用于检测人类jak2基因v617f突变的引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[00011本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于检测人类JAK2基因 V617F突变的引物、探 针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)的单病种发病率大多在 1/10万以下，属于罕见疾病。近10年来，随着人们生活水平的提高及医疗条件的改善，已发 现的MPN患者总数增加了三倍左右。JAK2基因在PV、ETUMF中具有较高的突变几率(依次为 ~90%、~50%、~50%)。
[0003] JAK2是一类酪氨酸蛋白激酶，与造血生长因子受体结合后，通过信号转导子和转 录激活子(STAT)来影响基因的转录调节(JAK-STAT途径）<JAK2基因 V617F是在第14外显子 617位点发生的点突变(G1849T)，缴氨酸(valine，V)被苯丙氨酸(phenylalanine，F)取代。 Val617位于JH2(假激酶区），JH2与JH1(激酶区）结合并抑制其活性;V617F突变使JH2失去了 对JH1激酶活性的抑制作用，导致了 JAK2的持续活化，在无需配体和造血生长因子受体结合 的情况下，导致造血细胞的异常增生。
[0004] 骨髓增殖性疾病(MPD)的遗传学基础长期不明，直到2005年研究人员在本类疾病 中发现存在JAK2点突变(V617F)，才使MPD的诊治进入了 一个新纪元。除在体检中发现外周 血异常而跟踪复查并确诊的患者外，本病的漏诊、误诊率很高。因此，JAK2基因是否存在突 变对患者的诊断具有重要的意义。2008年，随着对MH)的肿瘤本质得到确认，WHO将MH)改名 为MPN，并在修订的2008WH0分类系统中，将是否存在JAK2基因 V617F突变列入MPN(包括PV、 ET、頂F)的诊断标准。
[0005] 目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的 灵敏度低，检测灵敏度只有20~30%;实验操作复杂，检测效率低、样品易污染，通常要1~2 天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测， 会导致大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法，都无法有 效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。
[0006] 近年来，随着核酸扩增技术的不断优化，国外开始报道采用外周血标本检测游离 DNA中基因突变的方法。外周血取样不仅取材简便，且检测准确度与组织标本的结果符合率 较高。这不仅极大的促进了靶向药物基因突变检测方法的研究进展，也使以游离DNA为靶分 子对临床药物疗效及预后进行实时检测成为研究的热点。但外周血中癌细胞突变DNA存在 于大量野生型基因背景中，其比例较低。因此，需要高性能的检测技术来实现低突变含量的 检出。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有检测技术出现的灵敏度低、检测时间长、检测效率低、样本易污染、 假阳性率高等问题，本发明提供了用于检测人类JAK2基因 V617F突变的引物和探针，灵敏度 高，特异性强，有效避免假阳性。本发明还提供了包括上述引物和探针的试剂盒，检测方便 快速，操作简单，结果易读，适用范围广。
[0008] 本发明提供的用于检测人类JAK2基因 V617F突变的引物和探针，其核苷酸序列如 下：
[0009] 突变上游引物JW1-F:SEQ ID N0:1，
[0010] 突变下游ARMS引物JM1-R:SEQ ID N0:2，
[0011]检测探针jm-p:SEQ ID N0:3，
[0012] 阻断探针JW1-B:SEQ ID N0:4;
[0013] 其中，检测探针核苷酸序列5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团；阻断探针 的核苷酸序列5 '端经过双脱氧修饰，3 '端标记有淬灭基团。
[0014] 表1:JAK2基因 V617F热点突变
[0015]
[0016] 上述引物和探针是针对表1中位点突变设计的特异性检测引物，其中，JW1-F为突 变上游引物，与JAK2基因保守序列结合;JM1-R为突变下游ARMS引物，与V617F(1849G>T)位 点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列;JW1-P为5 '端标记有FAM信号3 '端标记MGB的 检测探针，能与扩增片段结合；JW1-B为5'端双脱氧修饰3'端MGB标记的阻断探针，能与 V617F位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
[0017]优选地，上述用于检测人类JAK2基因 V617F突变的引物和探针，所述荧光基团为 FAM，所述淬灭基团为MGB。MGB(MinorGrooveBinder)基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提 高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10°C)。相对于普通TaqMan探针，MGB探针 序列可设计得更短，特异性更强。
[0018] 本发明提供的用于检测人类JAK2基因 V617F突变的试剂盒，包括以上任一所述的 用于检测人类JAK2基因 V617F突变的引物和探针。
[0019] 优选地，所述用于检测人类JAK2基因 V617F突变的试剂盒，还包括外控引物和探 针，核苷酸序列如下：
[0020] 外控上游引物JW1-F:SEQ ID N0:1，
[0021 ]外控下游引物JW1-R:SEQ ID N0:5，
[0022] 外控检测探针JW1-P:SEQ ID NO:3,外控检测探针核苷酸序列的5'端标记有FAM， 3'端标记有MGB。
[0023] 其中，JW1-F和JW1-R为外控上下游引物，扩增JAK2基因上一段包含V617F位点的序 列;JW1-P为5 '端标记有FAM信号3 '端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合。
[0024] 优选地，所述用于检测人类JAK2基因 V617F突变的试剂盒，还包括内控引物和探 针，核苷酸序列如下：
[0025] 内控上游引物IC-F:SEQ ID N0:6，
[0026] 内控下游引物IC_R:SEQ ID N0:7，
[0027] 内控检测探针IC-P:SEQ ID N0:8,内控检测探针核苷酸序列的5'端标记有J0E，3' 端标记有BHQ1。
[0028] 其中，IC-F和IC-R为内控上下游引物，扩增matK基因保守序列；IC-P为5'端标记有 J0E信号3 '端标记BHQ1的检测探针，能与扩增片段结合。
[0029] 优选地，所述用于检测人类JAK2基因 V617F突变的试剂盒，还包括阳性对照品和内 控品，阳性对照品包括含有发生1849G>T碱基变化的CKIT基因片段〉gi |568815589: 5073601-5074000的阳性质粒，含有JAK2基因保守序列〉gi |568815589:5054501-5054900段 碱基的外控质粒，含有matK基因保守序列〉gi|ll994090:c2400-2001段碱基的内控质粒；内 控品为含有matK基因保守序列〉gi 111994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。
[0030] 优选地，所述用于检测人类JAK2基因 V617F突变的试剂盒，试剂盒中的反应体系分 为两种：
[0031] 检测反应体系:包括用于检测人类JAK2基因 V617F突变的引物和探针，内控引物和 探针，AB premix，10Xbuffer和ddH2〇;
[0032] 质控反应体系:包括外控引物和探针，内控引物和探针，AB premix，10 Xbuffer和 ddH20；
[0033] 所述AB premix为美国应用生物系统公司产品TaqMan1; Fast Advanced Master Mix;所述10 X buff er为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg2+。
[0034] 本发明还提供上述用于检测人类JAK2基因 V617F突变的试剂盒的使用方法，是首 先提取待检样品的基因组DNA，分别加入到检测反应体系和质控反应体系，进行荧光定量 PCR反应;另外设置非模板对照和阳性对照，与待检样品的基因组DNA进行同样的操作;根据 Ct值分析检测结果：
[0035]首先需要满足J0E信号Ct值< 25,非模板对照的FAM信号不起线，阳性对照的FAM信 号Ct值< 20; 9〈Ct廠< 18;然后按照ACt = Ct櫛rCt廠判定，ACt < 8为阳性，ACt>8为阴性；
[0036] 所述Ct獅j为待检样品的基因组DNA在检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct 值，所述(???为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。
[0037] 优选地，上述用于检测人类JAK2基因 V617F突变的试剂盒的使用方法中，荧光定量 PCR反应的条件为：
[0038] 95〇C lOmin；
[0039] 92°C 158〇。，58。