>[0016] 本发明的第二方面提供了一种HLA分型的引物组合物，其包括特异性扩增人类白 细胞抗原系统HLA-A基因上游、HLA-A基因与HLA-B基因之间、HLA-B基因与HLA-DRA基因 之间、HLA-DRA基因与HLA-DQB1基因之间以及HLA-DQB1基因下游范围内紧密连锁的多态 性位点（SNP)的引物。
[0017] 优选地，所述特异性扩增人类白细胞抗原系统HLA-A基因上游、HLA-A基因与 HLA-B基因之间、HLA-B基因与HLA-DRA基因之间、HLA-DRA基因与HLA-DQB1基因之间以及 HLA-DQB1基因下游范围内紧密连锁的多态性位点（SNP)的引物的上下游序列分别选自SEQ IDN0:2n-1和SEQIDN0:2n，其中η为70~266的自然数。
[0018] 在一个特定的实施方案中，所述HLA分型的引物组合物包括SEQIDΝ0:139-532 的全部引物序列。
[0019] 本发明的第三方面提供了一种HBB基因突变和HLA分型的检测产品，其由本发明 的引物组合物制备得到。
[0020] 在一个特定的实施方案中，所述检测产品为试剂盒，其包括：
[0021] 1)用于文库构建的反应试剂，包括：特异性结合引物、通用PCR引物、多重PCR聚 合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs、反应缓冲液；
[0022] 2)用于纯化PCR的反应产物的试剂；优选地，其包括产物纯化磁珠及缓冲液。优 选地，所述试剂盒还包括：
[0023] 3)阴性质控品；
[0024] 4)阳性质控品。
[0025] 本发明的第四方面提供了一种HBB基因突变和HLA分型的检测方法，其包括以下 步骤：
[0026] 1)提取体外培养的囊胚滋养层细胞经全基因组扩增；
[0027] 2)磁珠纯化全基因组扩增产物；
[0028] 3)提取夫妻双方全血DNA;
[0029] 4)利用本发明的引物组合物通过多重PCR扩增单体型目标区域；
[0030] 5)纯化PCR产物，并测序；
[0031] 6)将测定的胚胎和夫妻3方的DNA序列进行比对，判断胚胎的单倍体型。
[0032] 其中，步骤1)中所述囊胚滋养层细胞全基因组扩增方法优选为多重置换扩增 (MDA)〇
[0033]步骤 5)中米用IontorrentPGM或IontorrentProton进行测序。
[0034] 步骤6)中利用Torrent_Server_4. 0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除 接头序列，用Tmap软件比对到人类hgl9参考基因组，最后分析目标位点覆盖倍数和基因 型。
[0035] 本发明的第五方面提供了一种造血干细胞移植的胚胎移植前诊断方法，其使用本 发明的方法确定胚胎的HBB基因突变情况和HLA分型情况。
[0036] 本发明的优越性主要有以下几点：
[0037] (1)通用性：本发明采用了HBB基因69个SNP和HLA区域197个SNP进行分析， 可用于有需要进行造血干细胞移植的β-地中海贫血患儿家庭胚胎移植前诊断。
[0038] (2)多位点SNP测序：基于第二代测序技术，本发明可以对ΗΒΒ基因附近和HLA区 域的多个SNP进行分析，不需依赖已知的探针和设计探针。
[0039] (3)高通量：基于高通量测序技术，本发明可以高通量地处理ΗΒΒ突变和HLA分型 的单倍体，通过在每个样品上加上不同的标签序列，可以一次地对大量样品进行分析。
[0040] (4)成本低：随着测序技术的不断发展和测序成本的不断降低，以及一次对大量 样品进行分析，本发明对ΗΒΒ突变和HLA分型的单倍体分析的成本也在不断下降。
[0041] (5)高灵敏度：本发明可用于3~5个细胞的分析，因此适合于试管婴儿技术中胚 胎移植如的检测。
[0042] (6)特异性强：本发明选取千人基因组计划数据（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/variation/tools/1000genomes/)中HBB基因上下游 1Mb范围内CHB(北方汉人）和 CHS(南方汉人）最小等位基因频率均大于0.2的高频突变位点，去除多聚核苷酸（polyN) 和位点上下游50bp序列中GC含量>70%的多态性位点，并选择unique比对到人类基因 组hgl9的60个SNP突变位点和HBB基因作为目标区域。同样的方法，根据2011年欧 洲生殖委员会PGD组指导原则（HartonGL，DeRyckeM，FiorentinoFetal.ESHRE PGDconsortiumbestpracticeguidelinesforamplification-basedPGD.Hum R印rod. 2011Jan;26 (1) :33-40)。分别在HLA-A基因上游、HLA-A基因与HLA-B基因之间、 HLA-B基因与HLA-DRA基因之间、HLA-DRA基因与HLA-DQB1基因之间以及HLA-DQB1基因下 游及各自基因上共选择197个高频突变位点作为目标区域。登陆https://www.ampliseq. com/网站分别提交HBB和HLA目标位点及区域设计引物，这些引物具有很高的特异性。
【附图说明】
[0043] 图1β珠蛋白基因簇结构。
[0044] 图2β地中海贫血遗传方式。X.常规"2+1+1"家系，父母均为携带者，子代可能为 以下四种基因型（Α1 :正常人；Α2、Α3 :携带者；Α4 :患者）。
[0045] 图3HLA结构示意图。
[0046] 图4β-地中海贫血症家系单体型结果。Ε1、Ε2、Ε3、Ε4、Ε5、Ε6、Ε7、Ε8、Ε9为该家 系胚胎，不同单体型元件用不同灰度标示：F1 (
)和F2 (
)为父亲HBB基因上下游1M区 域的两条单体型链，Ml(議）和M2(C)为母亲HBB基因上下游1M区域的两条单体型链，D 先证者为β-地中海贫血症HBB基因β654/β17双重杂合子突变，因此可以推断D先证者 ΗΒΒ基因上下游1Μ的两条ΗΒΒ突变链分别来自父母双方的β17和β654突变链。"透明标 底"（C)标示ΗΒΒ突变碱基位置，"反色标底"（
）表示该链在此处发生基因脱扣。"？ "表 示该链在此处未检测到读段。
[0047] 图5人类白细胞抗原HLA家系单体型结果。Ε1、Ε2、Ε3、Ε4、Ε5、Ε6、Ε7、Ε8、Ε9为 该家系胚胎，不同单体型元件不同颜色标示，Fl(
)和F2(
)为父亲HBB基因上下游1M区域的两条单体型链，Ml(
和M2(
)为母亲HBB基因上下游1M区域的两条单体型链， D先证者人类白细胞抗原HLA基因区域的两条HLA链分别来自母亲的Ml和父亲的F1链。 "反色标底"（
）标示该链在此处发生基因脱扣。"？ "表示该链在此处未检测到读段。
【具体实施方式】
[0048]在本发明中，读段（reads)是指测序获得的序列片段。
[0049]在本发明中，单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指在基 因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
[0050] 在本发明中，单体型（Haplotype)是指位于一条染色体特定区域的一组相互关 联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合，又称单倍体型或单元型。
[0051]本发明中，基因组DNA的获取是当胚胎发育至囊胚期时取出外围滋养层细胞3~ 5个，运用全基因组扩增方法对细胞中基因组DNA进行富集。
[0052]在本发明中，目标区域DNA分子富集采用的是多重PCR扩增的方法。具体原理和 方法请参见生厂商提供的说明书，将DNA分子富集为比较集中的一定大小的片段。在本发 明的一个特定实施方案中，DNA片段大小在125~275bp的大小。
[0053]在本发明中，针对人类HBB基因及HLA区域，分别设计69对和197对序列特异性 引物。这些引物的特点为：（1)在目标染色体上序列唯一；（2)位置特异的寡核苷酸具有相 同的退火温度；（3)HBB基因69对引物混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中能进 行69重反应。HLA区域197对引物混合到1个PCR反应管中，在1个PCR反应管中能进行 197重反应。
[0054]在本发明中，所采用的测序方法可以为高通量测序方法。DNA片段长度分布在 125~275bp之间。在本发明的一个特定实施方案中，测序平台为IonTorrentPGM，得到 DNA长度分布在125~275bp之间的DNA序列分子。
[0055] 在本发明中，测序深度可以是300~3000X，即每条特异PCR扩增产物被测序 300~3000次，例如在本发明的一个特定实施方案中，测序深度为1000,即该条特异PCR扩 增产物被测序1000次。
[0056] 本发明中，当待测的DNA分子来自多个受试样品时，每个样品可以被加上不同的 标签序列（barcode)，以用于在测序过程中进行样品的区分（MicahHamady,JeffreyJ Walker,JKirkHarrisetal.Error-correctingbarcodedprimersforpyrosequencing hundredsofsamplesinmultiplex.NatureMethods, 2008, 5 (3))，从而实现同时对多个 样品进彳丁测序。
[0057] 本发明中，基因组参考序列可以来自公共数据库。例如，人类基因组序列可以是 NCBI或者ucsc数据库中的人类基因组参考序列。
[0058]