动物源性成分肉类检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物信息学和生物技术领域，具体地，本发明提供了一种基于高通量 测序技术的动物源性成分肉类检测方法。
【背景技术】
[0002] 随着经济的发展和生活水平的提高，人们对肉类的需求日益增加，品种选择越来 越丰富。但是对于物种来源不明的肉类，有可能含有过敏原或者是不法分子偷猎的野生保 护动物，从而给人民食品安全和国家野生动物保护执法鉴定带来风险和问题。
[0003] 除此之外，对于肉类掺假所产生的欺诈现象同样不容忽视。
[0004] 对于目前的鲜肉或者冷冻肉等混合物成分的动物源性成分的肉类鉴定，通常采用 PCR技术或者qPCR扩增线粒体上的特异基因，不同的物种需要设计不同的特异性引物。该 种方法只能对常见的物种进行定性检测，不能对其他一些珍稀少见未开发引物的物种进行 检测。
[0005] 另外，虽然目前还开发了多重PCR系统，但是一个样品中也只能检测不到10个物 种，因此检测的范围比较小，对于未知的肉类样品具有较大的局限性。
[0006] 综上所述，本领域尚缺乏令人满意的、检测范围广、针对动物源性成分肉类的定性 检测方法。因此，本领域迫切需要开发检测范围广、正确性高的针对动物源性成分肉类的定 性检测方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一即在于提供一种检测范围广、正确性高的动物源性成分肉类的 检测方法。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种不需要设计特异性引物，适用于不明肉类样本和多 种成分混合的动物源性成分肉类的检测方法。
[0009] 在本发明的第一方面，提供了一种判定待测样品是否含有动物源性成分的检测方 法，包含以下步骤：
[0010] (a)提供一待测样品；
[0011] (b)从所述样品中，提取线粒体DNA ;
[0012] (c)用上一步骤的线粒体DNA，构建PCR-free文库；
[0013] (d)对上一步骤的PCR-free文库进行测序，从而获得所述待测样品的线粒体DNA 读序；
[0014] (f)将所述读序与动物线粒体DNA基因组标准序列进行比对，从而获得匹配的读 序（即比对上的读序）；
[0015] (g)计算匹配的读序占所述动物线粒体DNA基因组的覆盖率；
[0016] (h)基于所述的覆盖率，判断所述待测样品是否含有动物源性成分。
[0017] 在另一优选例中，在步骤（d)中，还包括对所获得的读序进行长度选择，选取读长 为80-220bp，较佳地90-200bp，更佳地100-190bp的读序。
[0018] 在另一优选例中，所述的匹配的读序是与动物线粒体DNA基因组标准序列的匹配 度（或同一性）为95%~100%的所有读序（即允许错配率为< 5% )。
[0019] 在另一优选例中，步骤（g)中的覆盖率是所有匹配的读序占所述动物线粒体DNA 基因组的总覆盖率。
[0020] 在另一优选例中，所述的样品为生制、腌制和/或熟制的肉类样品。
[0021] 在另一优选例中，所述的肉类样品包括肌肉、内脏、碎骨、血液或其组合。
[0022] 在另一优选例中，所述的样品为生制的肉类样品。
[0023] 在另一优选例中，在步骤（h)中，如果与某一动物的线粒体DNA基因组的覆盖率 > 90% (较佳地> 95%，更佳地> 99% )，则表明该待测样品含有该动物的动物源性成分； 和/或
[0024] 在步骤（h)中，如果与某一动物的线粒体DNA基因组的覆盖率彡50% (较佳地 < 40%，更佳地< 30% )，则表明该待测样品不含有该动物的动物源性成分。
[0025] 在另一优选例中，所述的动物源性成分包括来自哺乳动物、禽类、鱼类、软骨鱼类、 贝类（含头足纲）、两栖类和/或节肢动物的肉类样品和/或水产品；
[0026] 较佳地来自哺乳动物、禽类、鱼类和/或节肢动物，更佳地来自偶蹄目和禽类。
[0027] 在另一优选例中，在步骤（f)中，所述的动物线粒体DNA基因组包括选自下组的动 物的线粒体DNA基因组：牛、牦牛、水牛、绵羊、山羊、盘羊、大角羊、猫、狗、鼠、马、骆驼、兔、 猪、野猪、老虎、豹、长颈鹿、熊猫、梅花鹿、象、穿山甲、果子狸、鸡、火鸡、雉鸡、野鸡、老鹰、肉 鸽、鹌鹑、鹅、雁、鸭、潜鸭、鸵鸟、鸸鹋、鹳、鳄鱼、鱼类、蛇、贝类、乌贼、鲍鱼、龙虾、蟹、甲鱼、 鲨、當、牡贩。
[0028] 在另一优选例中，所述方法还设置阳性对照组，并且所述阳性对照组的试验条件 与测试组相同，且不同点在于：所述阳性对照组中为成分已知的单一肉类样品。
[0029] 在另一优选例中，所述的对照组中的肉类选自下组：牛、牦牛、水牛、绵羊、山羊、 盘羊、大角羊、猫、狗、鼠、马、骆驼、兔、猪、野猪、老虎、豹、长颈鹿、熊猫、梅花鹿、象、穿山甲、 果子狸、鸡、火鸡、雉鸡、野鸡、老鹰、肉鸽、鹌鹑、鹅、雁、鸭、潜鸭、鸵鸟、鸸鹋、鹳、鳄鱼、鱼类、 蛇、贝类、乌贼、鲍鱼、龙虫下、蟹、甲鱼、藍、當、牡贩。
[0030] 在另一优选例中，通过线粒体DNA数据比对的方法不仅可以用于鉴定动物肉类样 品的源性成分，还可以用于其他能够通过线粒体基因组DNA和核基因组DNA比对进行定性 区分的其他混合物，包括饲料、酱汁、宠物食品。
[0031] 在另一优选例中，在步骤（c)中包括步骤：先将所述的线粒体DNA打断为 150-350bp(更佳地150-250bp)的片段，然后再构建文库。
[0032] 在另一优选例中，在所述打断中，采用Covaris LE220打断仪进行打断。
[0033] 在另一优选例中，在步骤（c)中，还包括对打断的片段化DNA，进行末端修复、连接 接头、和缺口平移处理。
[0034] 在另一优选例中，在步骤（c)中，还包括对于所述的经处理的片段化DNA进行纯 化，从而获得大小为200-300bp (较佳地240-260bp)的DNA片段。
[0035] 在另一优选例中，在步骤（d)中，用Ion Proton? System进行测序。
[0036] 在另一优选例中，在步骤（f)中，先将读序数据转换为fastq格式，然后进行比对。
[0037] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0038] 图1显示了本发明的一个优选例中测试结果中平均读长的统计分布情况。其中， X轴为读序（reads)长度（读长）；Y轴为读序在某一长度时占总读序的百分比。
【具体实施方式】
[0039] 发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现利用物种共有的遗传物质线粒 体，可以对线粒体全线粒体基因组文库进行构建，并进行高通量测序，从而通过比对参考线 粒体基因组序列，对肉类检测样品进行精确地定性分析和成分的物种鉴定。该方法无需设 计引物或进行PCR扩增，同时在构建文库时，接头加入不同barcode序列，可使得检测通量 1?而快速。在此基础上完成了本发明。
[0040] 文库构建
[0041] 在本发明中，为了提高检测的准确性和可靠性，优选构建针对线粒体DNA的PCR - free文库。
[0042] 在本发明的一个优选例中，包括以下步骤：
[0043] 将待检测的样品研磨均匀后，提取线粒体DNA。使用Covaris LE220仪器将DNA打 断为200bp左右片段，末端修复酶修复补平，片段两端分别连接测序的P接头和含有区分样 品的barcode序列的A接头。通过磁珠纯化去除多余的接头序列，琼脂糖凝胶进行电泳，回 收添加接头片段的240bp-260bp片段。使用Agilent 2100和Qpcr检测文库，符合上机测 序的标准。
[0044] 测序
[0045] 在本发明中，可用常规的测序技术和平台进行测序。优选的测序方法包括：Life Technologies 的 proton 或 PGM, Illumina HiSeq, ABI SOLiD, Roche 454 等测序仪器。
[0046] 在本发明中，特别适合对本发明构建的PCR - free文库进行测序的方法是Ion Proton法。在一优选例中，将符合上机测序标准的文库片段，使用The Ion Proton? System 进行测序。
[0047] 数据处理
[0048] 在本发明的优选例中，数