用于肉制品中掺假马源性成分快速鉴别的锁核酸探针荧光定量pcr方法及其引物和锁核 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及动物源性成分鉴定技术领域，具体设及用锁核酸探针技术检测肉制品 中渗假马源性成分的方法及其引物和锁核酸探针序列。
【背景技术】
[0002] -些不法商家为牟取暴利，在标明某肉的肉制品中渗入低价位其它肉类，如在牛 肉丸中渗入猪肉，在牛肉制品中渗入马肉等，极大地损坏了消费者的利益。在我国，媒体已 多次曝光假冒牛羊肉卷事件。在瑞典、英国和法国等西方国家，也多次曝光用马肉假冒牛肉 事件。BA化IN等对近千种肉制品的检测分析发现，有近20%的产品存在标识与品种不完全相 符现象。目前，打击肉制品渗假已成为社会关注的热点，而对肉制品中动物源性成分的快速 鉴别是打假的重要技术手段。
[0003] 对肉制品的渗假检测主要基于对动物源性成分的鉴别，尽管动物源性成分鉴别有 多种方法，但W检测DNA为基础的分子生物学方法，尤其是PCR技术W稳定、准确、快速等优 势而得到越来越广泛的应用。然而，食品中DNA成分复杂，加之PCR技术的高灵敏度，使得应 用PCR方法来鉴别物种存在因非特异性扩增而产生假阳性结果的缺点。因此，WPCR为基础， 应用改良的引物探针设计策略已逐步成为肉类鉴别的新方向。关于马源性成分的检测鉴定 研究报道不多，李爱民等建立的簇化胶乳凝集抑制试验虽成本低、操作简便，但不适合熟制 马肉的检测。郑光明等建立了普通PCR鉴定马肉的方法，该法使熟制马肉制品的鉴别成为可 能，但该法存在普通PCR的缺点如易产生交叉污染、有触毒风险等。李楠等建立了实时巧光 PCR方法，实现了肉制品中马源性成分的快速检测，但该法还有瑕疵，如与牛源性成分有一 定交叉反应，设定wet值<30判为阳性，存在将非特异性反应误判为阳性和将生产加工、销 售过程肉污染误判为故意渗假的可能。
[0004]锁核酸换针是在化qman换针的基础上，有目的地将换针的一些碱基修饰成LNA碱 基，通过提高探针的Tm值，缩短探针长度来增加探针的稳定性、特异性和设计的灵活性。本 发明利用锁核酸探针的上述优点，建立检测肉制品中渗假马源性成分的锁核酸探针巧光定 量PCR方法，通过采用样品Ct值与纯马肉Ct值的绝对差值作为肉制品中马肉渗假的判定标 准，解决了肉污染引起的渗假误判和非特异性反应引起的假阳性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于肉制品中渗假马源性成分快速鉴别的锁核酸探针 巧光定量PCR方法及其引物和锁核酸探针序列。包括： (1)所述的引物和锁核酸探针的序列： 上游引物序列为:5 ' -CCCACTATCAGGATTCATACCC -3 ' ； 下游引物序列为:5'- AGTGAGGTGGAATAGGTTAGTCG -3'； 锁核酸探针序列为： 5 '- FAM-ACACCAAAAATAGCAGCATCATCCTCC-B册1-3 ' (2)采用步骤(1)设计的引物和锁核酸探针建立马源性成分的锁核酸探针巧光定量 PCR检测方法。其特征在于:锁核酸探针巧光定量PCR检测方法的反应体系为:2化L，包括10μ L Probes Master 2Xconc (包含有dNTP，Mg2+ W及Taq 酶等），10ymol/L上述上下游引物 F/R各0.化L，10皿〇1/上述锁核酸探针P 0.3化，DNA模板化L，超纯水补至20化。反应参数： 95°C 8min; 95°(：，1〇3,58°(：，3〇3(收集巧光信号），35~40个循环。试验设纯马肉0臟阳性对 照和空白对照。阳性对照Ct值含20,且有明显扩增曲线，空白对照无 Ct值，试验有效，可进 行结果判定。样品无 ct值，或Ct消品)> 30，或I Ct(棉。。)-Ct脚性)I > 7，且样品无明显扩增曲线 的，判为阴性，报告样品不含马源性成分；let(稱a- Ct咖电I且样品扩增曲线明显呈对 数增长，判为阳性，报告样品中渗有马源性成分；let(棉Ct咖电|>7，Ct(樹》<30,且扩增 曲线明显呈对数增长，判为假阳性，报告样品污染马源性成分。
[0006] 基于本发明建立的锁核酸探针巧光定量PCR检测方法，按下列步骤进行： 1)样品的制备与DNA模板的提取： 取肉制品化g，剪碎后，加去离子水制成1:4匀浆，吸取匀浆50化于1.5mL离屯、管内，按组 织核酸提取(离屯、柱法)试剂盒使用说明操作，提取DNA备检。
[0007] 2)将试剂从冰箱取出后，置室溫融化，8000 rpm离屯、10s。根据样品数按下表计算 试剂用量。
[0008] ~n=l (阴性对照)+1 (阳性对照)+样品数+损耗数 ' ' ' 将上述Probes Master 2Xconc.，上、下游引物，探针和去离子水分别加入离屯、管中， 混匀后，8000巧m离屯、10s。向设定的反应孔加入19化/孔。
[0009] 3)加样： 将马肉DNA加入阳性对照孔、将去离子水加入阴性对照孔、将样品DNA分别加入样品反 应孔，化L/孔。用反应膜封住反应孔，置于巧光定量PCR仪上检测。
[0010] 4)反应参数设置:95°C 8min; 951：，1〇3,58°(：，3〇3(采集巧光信号），35~40循环。
[0011] 5)结果判断： (1)质控标准 一一阴性对照:无 Ct值或Ct值>30,且无典型扩增曲线； 一一阳性对照：Ct含20，且扩增曲线明显呈对数增长。
[0012] 阴性和阳性对照满足质控标准，实验有效，可进行结果判定。
[OOU] (2)判定和报告 样品无 Ct值，或撕棉。。)>30,或|化棉。。)-Ct脚胜I >7,且样品无明显扩增曲线的，判为阴 性，报告样品不含马源性成分。
[0014] let(棉。。)-ct咖电I且样品扩增曲线明显呈对数增长，判为阳性，报告样品渗有 马源性成分。
[001引let猫a)- ct獅电|>7，ct猫a)<30,且扩增曲线明显呈对数增长，判为假阳性，报告 样品污染马源性成分。
[0016]本发明具有下列优点。
[0017] 1本发明提供的引物和锁核酸探针具有良好的检测灵敏度和特异性。
[0018] 2本发明建立了用于快速检测肉制品中马源性成分渗假的锁核酸探针巧光定量 PCR方法。该法提出W样品Ct值与阳性对照Ct值的绝对差值作为渗假成分阳性判定标准， 解决了生产加工和销售过程中肉污染造成的渗假误判和其他肉类非特异性反应造成的假 阳性问题。
[0019] 3本发明为其他动物源性成分的检测探索了新的途径。
【附图说明】
[0020] 图1马源性成分锁核酸探针巧光定量PCR检测方法特异性试验扩增曲线图 其中图中1为马源性成分;2-12为牛、羊、猪、驴、鹿、驴、鸡、鸭、碟、邮肉源性成分和阴 性对照。
[0021] 图2马源性成分锁核酸探针巧光定量PCR检测方法灵敏性扩增曲线图，其中图中： 1-7的DNA浓度分别为：140雌、14雌、1.4雌、0.14叫、0.014叫、0.0014叫、0.00014雌；8为阴 性对照。
【具体实施方式】<