br>[0022] W下实施例子是对本发明作进一步详述。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0023] 实施例1:特异性试验 检测设备:Li曲tCycler ? 480型巧光定量PCR仪(Roche)，高速离屯、机(Beckman)，恒溫 干热器(E卵endorf )。
[0024] 检测试剂：核酸提取（离屯、柱法）试剂盒由达安公司提供，Probes Master 2X cone.由Roche公司提供，上、下游引物和锁核酸探针由上海辉眷公司合成标记。具体序列如 下： 上游引物序列为：5 ' -CCCACTATCAGGATTCATACCC-3 ' ； 下游引物序列为:5 ' -AGTGAGGTGGAATAGGTTAGTCG-3 ' ； 锁核酸探针序列为： 5 '-FAM- CACCAAAAATAG+CAGCATCATCCTCC-B册1-3 ' 样品：牛、羊、猪、驴、鹿、驴、鸡、鸭、碟、邮肉。
[00剧检测步骤： 1)样品的制备与DNA模板的提取： 取样品化g，加去离子水制成1:4匀浆，吸取匀浆50化于1.5mL离屯、管内，按核酸提取(离 屯、柱法)试剂盒使用说明操作，提取DNA。经紫外分光光度计测定其纯度为1.81~2.11，DNA 浓度为107.38~183.11叫/41^。其中马肉0魁含量为140雌/41^，00260/00280值为1.97。将 上述样品DNA稀释为SOngAiL后进行特异性试验。
[00%] 2)反应液配制： 将试剂从冰箱取出后，置室溫融化，8000 rpm离屯、lOsec。按下表计算试剂用量，
将上述Probes Master 2Xconc.，上、下游引物，探针和去离子水分别加入1.5mL离屯、 管中，混匀后，8000巧m离屯、1 Osec。分别加入96孔反应板，1化L/孔。
[0027] 3)加样： 将马肉DNA加入阳性对照孔、将去离子水加入阴性对照孔、将样品DNA分别加入样品反 应孔，ΙμL孔。用反应膜封住反应孔，置于Li曲tCycler? 480型巧光定量PCR仪上检测。
[002引 4)反应参数设置:95°C 8min; 951：，103,58°(：，303(采集巧光信号），40循环。
[00巧]5)结果判断： (1)质控标准 一一阴性对照:无 Ct值； 一一阳性对照：Ct为17.6，且扩增曲线明显呈对数增长。详见图1 阴性和阳性对照满足质控标准，实验有效，可进行结果判定。
[0030] (2)判定和报告 样品均无 Ct值，也无明显扩增曲线。判定未检出马源性成分。报告牛、羊、猪、驴、鹿、驴、 鸡、鸭、碟、邮肉DNA不含马源性成分，即与马肉DNA无交叉反应。
[0031 ] 实施例2:敏感性试验 用去离子水10倍系列稀释纯马肉DNA，直至ΙΟΛ按实施例1进行锁核酸探针巧光定量 PC时式验，每个稀释度作3个重复，并设去离子水阴性对照。结果如图2。由此可知其检测低限 达1 〇-6，即马肉DNA浓度为0.00014ngAiL，相当于马肉含量0.0001〇/〇。
【主权项】
1. 用于肉制品中掺假马源性成分快速鉴别的锁核酸探针荧光定量PCR的引物序列和探 针序列，其特征是所述引物序列包括： 上游引物序列为：5 ' -CCCACTATCAGGATTCATACCC -3 ' ； 下游引物序列为:5'_ AGTGAGGTGGAATAGGTTAGTCG -3'； 所述锁核酸探针序列为： 5，- FAM-ACACCAAAAATAGCAGCATCATCCTCC-BHQ1-3,。2. 用于肉制品掺假马源性成分快速鉴别的锁核酸探针荧光定量PCR方法，其特征在于 包括如下步骤： ⑴设计引物和锁核酸探针的序列： 上游引物序列为：5 ' -CCCACTATCAGGATTCATACCC -3 ' ； 下游引物序列为:5'_ AGTGAGGTGGAATAGGTTAGTCG -3'； 锁核酸探针序列为： 5，- FAM-ACACCAAAAATAGCAGCATCATCCTCC-BHQ1-3,； (2)采用步骤（1)设计的引物和探针建立马源性成分的锁核酸荧光定量PCR检测方 法； 其特征在于:锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的反应体系为:20yL，包括10yL Probes Master 2Xconc，其中包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶等，ΙΟμ mol/L上述上下游引物F/R各 0.4yL，10ymol/上述锁核酸探针P 0.3yL，DNA模板lyL，超纯水补至20yL; 反应参数:95°C 8min; 95°C，10s，58°C，30s，收集荧光信号，35~40个循环， 试验设纯马肉DNA阳性对照和空白对照， 阳性对照Ct值<20,且有明显扩增曲线，空白对照无 Ct值，试验有效，可进行结果判 定； 样品无 ct值，或ct(#；a)>3〇,或| ct (?a)- ct侧?|<7,且样品有明显扩增曲线，判定 为阳性结果，报告样品掺有马源性成分；I ct (揣ct侧?I >7,且样品无明显扩增曲线， 判定为阴性结果，报告样品无马源性成分；I ct (稱ct侧?I >7,且样品扩增曲线明显 呈对数增长，判为假阳性，报告样品污染马源性成分。
【专利摘要】马源性成分锁核酸荧光定量PCR检测方法及其引物和锁核酸探针。本发明涉及将锁核酸探针技术应用于马源性成分的快速鉴别，建立的锁核酸荧光定量PCR方法具有快速、敏感、特异等优点，适应于肉制品中掺假马源性成分的快速检测。本发明包括引物和锁核酸序列的设计及锁核酸荧光定量PCR方法的建立。上游引物序列为：5<b>’</b><b>-</b>CCCACTATCAGGATTCATACCC？-3<b>’</b>；下游引物序列为：5<b>’</b><b>-</b>？AGTGAGGTGGAATAGGTTAGTCG？-3<b>’</b>；锁核酸探针序列为：5<b>’</b><b>-</b>？FAM-ACACCAAAAATAGCAGCATCATCCTCC-BHQ1-3<b>’</b>锁核酸荧光定量PCR检测方法的反应体系为：20μL，包括10μL？Probes？Master？2×conc(包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶等)，10μmol/L上述上下游引物F/R？各0.4μL，10μmol/上述锁核酸探针P？0.3μL，DNA？模板1μL，超纯水补至20μL。反应参数：95℃？8min；？95℃，10s，58℃，30s（收集荧光信号），35～40个循环。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105671034
【申请号】
【发明人】许如苏, 周广彪, 陈冠武, 利光辉, 刘中勇, 段建发, 魏霜
【申请人】中华人民共和国汕头出入境检验检疫局
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2015年4月29日