专利名称：：含有补骨脂的制剂中补骨脂成分的检测方法
技术领域：
：本发明提供了一种药物中有效成分的检测方法，其为一种中药有效成分的检测方法，尤其是指中药制剂中补骨脂成分的检测方法。
背景技术：
：目前国家法定常用的含有补骨脂作为主要成分的中成药制剂中，大多缺少有效的有效成分或指标性成分的含量检测方法。这些中成药多为滋补强壮或扶正祛邪的中成药，如复方杜仲强腰酒，国公酒，健步强身丸、偏瘫复原丸、人参鹿茸丸、参茸三鞭丸、温肾全鹿丸、锁阳固精丸、茴香橘核丸、肉蔻四神丸、强阳保肾丸、七宝美髯丸、安坤赞育丸、加味青娥丸、千金止带丸、全鹿丸、益坤丸、安肾丸、黑锡丹等。但是至今没有更好的方法可以准确、有效、便捷地检测中成药中补骨脂有效成分包括补骨脂素和异补骨脂素的含量。
发明内容针对现有技术在中药成分检测方面存在的缺陷，为了更好地监控这些中成药的质量，发明人经过大量的实验，研究了一种中药制剂中补骨脂素的检测方法，结果证明，本发明的方法避免现有方法存在的千扰，测定结果也更准确。本发明的目的是提供一种含有补骨脂的制剂中补骨脂成分的检测方法，通过该方法可以得到准确的结果，且无其他杂质干扰。本发明提供一种含有补骨脂的制剂中补骨脂成分的检测方法，该检测方法实质上为制剂中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定方法，该方法包括(1)制备供试品溶液，取含有补骨脂的液体制剂为样品，用3-8倍体积的乙醚振摇，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解，定量转移至量瓶中，加甲醇至与该样品等体积，置内装100-200目中性氧化铝的中性氧化铝柱上，收集过柱后流出的洗脱液，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液；(2)制备对照品溶液，取补骨脂素对照品和异补骨脂素对照品，加甲醇制成含补骨脂素20mg/ml的溶液和含异补骨脂素20mg/ml的溶液，得到补骨脂素对照品溶液和异补骨脂素对照品溶液。(3)采用高效液相色谱法和紫外检测器进行检测，色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为体积比40:40-80的甲醇-水，检测波长为225-275nm;(4)检测方法，吸取供拭品溶液、补骨脂素对照品溶液和异补骨脂素对照品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明的检测方法釆用样品先经过前处理再用高效液相色谱的检测方法，改变了通常对液相色谱中含有补骨脂药材成分的样品处理方法，采用样品提取后的乙醚液过中性氧化铝柱再进入高效液相的方法，成功地消除了液相图谱中的杂峰，使液相基线更平，结果更精确稳定。本发明主要采用样品的乙醚液过中性氧化铝柱再迸入高效液相的方法，这里的中性氧化铝柱是己经过活化处理的中性氧化铝柱，其为市场销售公知的产品，其为内装100-200目中性氧化铝的分离用层析柱，在本发明的优选实施例中，对于所需要处理体积一般不超过50ml的样品而言，采用的中性氧化铝柱的柱内径约为10mm，内装4克100-200目中性氧化铝。在本发明提供的含有补骨脂的制剂中补骨脂成分的检测方法中，其为制剂中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定方法，该方法优选包括1.供试品溶液的制备取样，样品用3-8倍量(体积)的乙醚振摇，乙醚液挥干乙醚，残渣加甲醇使溶解，定量转移至量瓶中，加甲醇至与取样的样品等体积，置中性氧化铝柱上，该中性氧化铝柱为内装100-200目中性氧化铝的柱，收集过柱后流出的洗脱液，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液；该样品为含有补骨脂的液体制剂；2.对照品溶液的制备取干燥恒重的补骨脂素、异补骨脂素对照品，加甲醇制成含补骨脂素、异补骨脂素20mg,/ml的溶液，得到补骨脂素对照品溶液和异补骨脂素对照品溶液。3.色谱条件与系统适应性试验采用十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为体积比40:40-80的甲醇-水，检测波长为225-275nm;理论塔板数按补骨指素峰计算，不低于4000。4.观淀分别精密吸取两种对照品溶液与供拭品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。在本发明的优选实施例中，提供一种含有补骨脂的制剂中补骨脂成分的检测方法，其为制剂中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定方法，该方法包括1.供试品溶液的制备取样品10ml，置分液漏斗中，用40-60ml的乙醚振摇提取，优选分次振摇提取，合并乙醚液，挥干乙醚，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，置已处理好的中性氧化铝柱上，该中性氧化铝柱为内装4克100-200目中性氧化铝的内径10mm的柱，收集过柱后流出的洗脱液，用0.45pm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。2.对照品溶液的制备精密称取减压干燥至恒重的补骨脂素、异补骨脂素对照品，加甲醇分别制成含补骨脂素、异补骨脂素20mg/ml的溶液，即得。3.色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水(体积比l:l-2)为流动相，检测波长为230-260nm;理论塔板数按补骨指素峰计算，应不低于4000。4.测定分别精密吸取两种对照品溶液与供拭品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明的方法采用的高效液相色谱条件是十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，该色谱柱的柱温一般为20-50'C，优选大约4(TC。甲醇-水(体积比优选40:50-70)为流动相，流动相的流速为0.5-2ml/min，优选大约lml/min;检测波长优选为240-250nm，更优选为246nm。针对本发明采用的高效液相色谱系统而言，为了数据的准确，还应该进行系统适应性试验S卩，理论塔板数按补骨指素峰计算，应不低于4000。本发明的上述检测方法是经过大量的实验方法和数据筛选才得到适合本发明的方法，其为含有补骨脂的中药制剂尤其是中药液体制剂的补骨脂有效成分的含量测定方法。本发明的检测对象——补骨脂的有效成分，指的是补骨脂素和异补骨脂素。本发明的优选实施例中，以含有补骨脂的药酒复方杜仲强腰酒为例，检测制剂中含有补骨脂的方法所采用的高效液相色谱条件1.仪器与试剂仪器SHIMADZULC-10AD液相色谱仪；SPD-M10A检测器；色谱柱DIAMOSILTMC18(250mmX4.6mm，5m);试剂甲醇一色谱纯(天津四友生物医学技术开发公司)；水一高纯水(国家标准物质中心提供)，其余试剂均为分析纯；对照品补骨脂素对照品(中国生物制品检定所提供，批号0739—200108);异补骨脂素对照品(中国生物制品检定所提供，批号0738—9907);均为含量测定用，纯度为100%。2.方法与结果色谱分析条件流动相甲醇-水(40:60);检测波长246nm;柱温40'C;流速lml/min;补骨脂素理论板数为4300。3.线性关系考察精密吸取补骨脂素(0.0392mg/m1)2、4、6、8、10ml移入10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述对照品溶液各10pl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，补骨脂素进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=8083206.6X—29933，r=0.9999。结果表明，补骨脂素在0.07840.392^范围内具良好的线性关系。表线性关系考察补骨脂素进样量(yg)峰面积0.07846163010.156812576410.235218757550.313625422990.39203181789精密吸取异补骨脂素(0.0456mg/m1)2、4、6、8、10ml移入10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述对照品溶液各lOnl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，异补骨脂素进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=7813848.7X—13367，r=0.9999。结果表明，异补骨脂素在0.09120.456吗范围内具良好的线性关系。表线性关系考察异补骨脂素进样量(ug)峰面积0.09127079540.182414212110.273620988010.364828257430.456035688034空白试验按处方中药味的比例，自配不含补骨脂的群药，按其工艺制成空白制剂，8再按供试品溶液制备方法制备并测定，结果空白溶液在补骨脂素、异补骨脂素对照品相同保留时间处未显色谱峰，故认为无干扰。5.稳定性试验精密吸取同一供试品溶液(批号1185002)，分别于配制后0、2、6、10、24小时，依法测定，供试品溶液在24小时内基本稳定，结果见下表。表补骨脂素稳定性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表异补骨脂素稳定性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>6.精密度试验取已知含量的补骨脂素对照品溶液(0.0392mg/ml)，按含量测定项测定，重复进样5次，结果见下表。表精密度试验结果(n=5)峰面积ii5^1924688294035839439711.13493294159361627.重复性试验按正文方法，取同一批号(1185002)样品，平行5份，进行测定，求得相对标准偏差RSD分别为0.77%、0.70%,结果见下表。表补骨脂素重复性试验结果(n=5)N补骨脂素含量(呵/ml)RSD%10.024320.024230.02390.7740.024250.0244表异补骨脂素重复性试验结果(n=5)N补骨脂素含量(mg/inl)RSD先10.026620.026230.02620.7040.026350.02658.回收率试验釆用加样回收法，精密称取已知含量的同一批号(批号1185002，补骨脂素含量0.0242mg/ml异补骨脂素含量0.0264mg/ml)的样品5ml，分别精密加入补骨脂素、异补骨脂素对照品混合溶液(含量各为0.025088mg/ml，0.025536mg/ml)5ml，按含量测定项下测定。以下式计算回收率，结果见下表。补骨脂素回收輸=画卜骨月旨素总量-样品中补骨月旨素的含量x画、；加入补骨脂素对照品量异补骨脂素回收率(％》J出异补骨脂素总量-样品中异补骨脂素的含量.加入异补骨脂素对照品量'表补骨脂素回收率试验结果100%<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表异补骨脂素回收率试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>9.样品测定按含量测定项下方法对三批样品测定含量。测定结果见下表。表样品测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由以上测定结果可以看出，每ml样品含补骨脂异补骨脂素(CuH603)、异补骨脂素(CuH603)含量不得少于0.02mg。图l:补骨脂素对照品的高效液相色谱图2:异补骨脂素对照品的高效液相色谱图3:含有补骨脂的复方杜仲强腰酒样品的高效液相色谱图4:阴性样品的高效液相色谱图。具体实施例方式以下结合实施例详细说明本发明，但不限定本发明的实施范围。实施例一.复方杜仲强腰酒中的补骨脂的质量控制方法1.仪器与试剂仪器SHIMADZULC-10AD液相色谱仪；SPD-M10A检测器；色谱柱DIAMOSILTMC18(250mmX4.6mm，5m);试剂甲醇一色谱纯(天津四友生物医学技术开发公司)；水一高纯水(国家标准物质中心提供)，其余试剂均为分析纯；对照品补骨脂素对照品(中国生物制品检定所提供，批号0739—200108);异补骨脂素对照品(中国生物制品检定所提供，批号0738—9907);均为含量测定用，纯度为100%。2.方法与结果色谱分析条件流动相甲醇-水(40:60);检测波长246nm;柱温40。C;流速lml/min;补骨脂素理论板数为4300。3.供试品溶液的制备取样品(复方杜仲强腰酒)10ml，置分液漏斗中，用乙醚振摇提取3次，每次15ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，置己处理好的中性氧化铝柱上，该中性氧化铝柱为内装4g100-200目中性氧化铝的内径10mm的柱，收集洗脱液，用0.45nm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。4.对照品溶液的制备精密称取减压干燥至恒重的补骨脂素、异补骨脂素对照品，加甲醇分别制成含补骨脂素、异补骨脂素20mg/ml的溶液，即得。5.测定分别精密吸取两种对照品溶液与供拭品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。图谱参见图l、图2和图3。图l是补骨脂素对照品的高效液相色谱图；图2是异补骨脂素对照品的高效液相色谱图，需要说明的是保留时间5以前的峰为杂质峰，保留时间相近，在本发明中这些峰忽略不计；图3是含有补骨脂的复方杜仲强腰酒样品的高效液相色谱图。结果是该样品中含有补骨脂素和异补骨脂素不少于0.2mg。实施例二.复方补骨脂酊剂中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定方法1.供试品溶液的制备取样品10ml，用乙醚振摇提取，挥干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至量瓶中，加甲醇至10ml，摇匀，置已处理好的中性氧化铝柱上，该中性氧化铝柱内装100-200目中性氧化铝，收集过柱后流出的的洗脱液，用0.45pm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。2.对照品溶液的制备精密称取减压千燥至恒重的补骨脂素、异补骨脂素对照品，加甲醇分别制成含补骨脂素、异补骨脂素20mg/ml的溶液，即得。3.色谱条件与系统适应性试验用十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水(50:50)为流动相，检测波长为240-260nm。4.测定分别精密吸取两种对照品溶液与供拭品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。实施例三.复方杜仲强腰酒对照例的结果对比复方杜仲强腰酒对照例是在原复方杜仲强腰酒的配方基础上删除了补骨脂的成分得到的酒剂。1.仪器与试剂同实施例1.对照品补骨脂素对照品(中国生物制品检定所提供，批号0739—200108);异补骨脂素对照品(中国生物制品检定所提供，批号0738—9907);均为含量测定用，纯度为100%。2.方法与结果色谱分析条件流动相甲醇-水(40:60);检测波长246nm;柱温；40°C;流速lml/min;补骨脂素理论板数为4300。3.供试品溶液的制备取样品(对照例的酒剂)10ml，置分液漏斗中，用乙醚振摇提取3次，每次15ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，置已处理好的中性氧化铝柱上，该中性氧化铝柱为内装4g100-200目中性氧化铝的内径10mm的柱，收集过柱后流出的洗脱液，用0.45pm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照例的供试品溶液。4.对照品溶液的制备精密称取减压千燥至恒重的补骨脂素、异补骨脂素对照品，加甲醇分别制成含补骨脂素、异补骨脂素20mg/ml的溶液，即得。5.测定分别精密吸取两种对照品溶液与供拭品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。图谱参见图l、图2和图4，其中，图l是补骨脂素对照品的高效液相色谱图；图2是异补骨脂素对照品的高效液相色谱图；图4是阴性样品的高效液相色谱图。结果是该样品中不含有补骨脂素，也不含有异补骨脂素。结果证明与对照例的实际组成一致。实施例四.国公酒中的补骨脂的质量控制方法l.仪器与试剂仪器SHIMADZULC-10AD液相色谱仪；SPD-M10A检测器；色谱柱DIAMOSILTMC18(250mmX4.6mm，5m);试剂甲醇一色谱纯(天津四友生物医学技术开发公司)；水一高纯水(国家标准物质中心提供)，其余试剂均为分析纯；对照品补骨脂素对照品(中国生物制品检定所提供，批号0739—200108);异补骨脂素对照品(中国生物制品检定所提供，批号0738—9907);均为含量测定用，纯度为100%。2.方法与结果色谱分析条件流动相甲醇-水(40:60);检测波长246nm;柱温40°C;流速lml/min;补骨脂素理论板数为4300。3.供试品溶液的制备取样品(国公酒)lOmI,置分液漏斗中，用乙醚振摇提取3次，每次15ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，置己处理好的中性氧化铝柱上，该中性氧化铝柱为内装4g100-200目中性氧化铝的内径10mm的柱，收集洗脱液，用0.45|im的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。4.对照品溶液的制备精密称取减压干燥至恒重的补骨脂素、异补骨脂素对照品，加甲醇分别制成含补骨脂素、异补骨脂素20mg/ml的溶液，即得。5.测定分别精密吸取两种对照品溶液与供拭品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。实施例五.温肾全鹿丸中的补骨脂的质量控制方法l.仪器与试剂仪器SHIMADZULC-10AD液相色谱仪；SPD-M10A检测器；色谱柱DIAMOSILTMCI8(250mmX4.6mm,5m);试剂甲醇—色谱纯(天津四友生物医学技术开发公司)；水一高纯水(国家标准物质中心提供)，其余试剂均为分析纯；对照品补骨脂素对照品(中国生物制品检定所提供，批号0739—200108);异补骨脂素对照品(中国生物制品检定所提供，批号0738—9907);均为含量测定用，纯度为100。％。2.方法与结果色谱分析条件流动相甲醇-水(40:60);检测波长246nm;柱温40°C;流速lml/min;补骨脂素理论板数为4300。3.供试品溶液的制备取样品(温肾全鹿丸)2g，用5g硅藻土分散研匀，置锥形瓶中，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，置已处理好的中性氧化铝柱上，该中性氧化铝柱为内装4g100-200目中性氧化铝的内径lOmm的柱，收集洗脱液，用0.45jam的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。4.对照品溶液的制备精密称取减压干燥至恒重的补骨脂素、异补骨脂素对照品，加甲醇分别制成含补骨脂素、异补骨脂素20mg/ml的溶液，即得。5.测定分别精密吸取两种对照品溶液与供拭品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。16实施例六.七宝美髯丸中的补骨脂的质量控制方法1.仪器与试剂仪器SHIMADZULC-10AD液相色谱仪；SPD-M10A检测器；色谱柱DIAMOSILTMC18(250mmX4.6mm,5m);试剂甲醇一色谱纯(天津四友生物医学技术开发公司)；水一高纯水(国家标准物质中心提供)，其余试剂均为分析纯；对照品补骨脂素对照品(中国生物制品检定所提供，批号0739—200108);异补骨脂素对照品(中国生物制品检定所提供，批号0738—9卯7);均为含量测定用，纯度为100%。2.方法与结果色谱分析条件流动相甲醇-水(40:60);检测波长246nm;柱温40°C;流速lml/min;补骨脂素理论板数为4300。3.供试品溶液的制备取样品(七宝美髯丸)2g，研碎，置锥形瓶中，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，置已处理好的中性氧化铝柱上，该中性氧化铝柱为内装4g100-200目中性氧化铝的内径10mm的柱，收集洗脱液，用0.45pm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。4.对照品溶液的制备精密称取减压干燥至恒重的补骨脂素、异补骨脂素对照品，加甲醇分别制成含补骨脂素、异补骨脂素20mg/ml的溶液，即得。5.测定分别精密吸取两种对照品溶液与供拭品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。权利要求1.一种含有补骨脂的制剂中补骨脂成分的检测方法，该方法包括(1)制备供试品溶液，取含有补骨脂的液体制剂为样品，用3-8倍体积的乙醚振摇，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解，加甲醇至与该样品等体积，置内装100-200目中性氧化铝的中性氧化铝柱上，收集过柱后流出的洗脱液，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液；(2)制备对照品溶液，取补骨脂素对照品和异补骨脂素对照品，加甲醇制成含补骨脂素20mg/ml的溶液和含异补骨脂素20mg/ml的溶液，得到补骨脂素对照品溶液和异补骨脂素对照品溶液；(3)采用高效液相色谱法和紫外检测器进行检测，色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为体积比4040-80的甲醇-水，检测波长为225-275nm；(4)吸取供拭品溶液、补骨脂素对照品溶液和异补骨脂素对照品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述的中性氧化铝柱为内装100-200目中性氧化铝的层析过滤柱。3.如权利要求1所述的检测方法，其中，步骤(3)所述的流动相为体积比40:50-70的甲醇-水，检测波长为240-250nm。4.如权利要求1所述的检测方法，其中，步骤(3)所述的检测波长为246nm。5.如权利要求1所述的检测方法，其中，步骤(3)所述的色谱柱的柱温为20-50。C。6.如权利要求1所述的检测方法，其中，步骤(3)所述的流动相的流速为0.5-2ml/min。7.如权利要求l-6任一项所述的检测方法，其中，该方法包括(l)制备供试品溶液，取样品10ml，置分液漏斗中，用40-60ml的乙醚振摇提取，优选分次振摇提取，合并乙醚液，挥干乙醚，残渣加甲醇使溶解，定量转移至量瓶中，加甲醇至10ml，使其通过中性氧化铝柱除杂，该中性氧化铝柱为内径10mm的、内装4克100-200目中性氧化铝的柱，收集过柱后流出的洗脱液，用0.45pm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；(2)制备对照品溶液，取干燥至恒重的补骨脂素对照品和异补骨脂素对照品，加甲醇分别制成含补骨脂素20mg/ml的对照品溶液和含异补骨脂素20mg/ml的对照品溶液；(3)采用高效液相色谱，色谱柱的填充剂为十八烷基硅垸键合硅胶，柱温为40°C，流动相为体积比40:60的甲醇-水，流速为lml/min;检测波长为246nm;(4)吸取两种对照品溶液与供拭品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。全文摘要本发明提供了一种含有补骨脂的制剂中补骨脂成分的检测方法，该方法包括将供试品先经过中性氧化铝前处理再制备供试品溶液，以及制备对照品溶液，采用高效液相色谱法和紫外检测器进行检测，流动相为体积比40∶40-80的甲醇-水，检测波长为225-275nm；本发明的检测方法成功地消除了液相图谱中的杂峰，使液相基线更平，结果更精确稳定。文档编号G01N30/00GK101458237SQ20081024701公开日2009年6月17日申请日期2008年12月29日优先权日2008年12月29日发明者刘柏刚,炜吴,蓉夏,爽张,薇张,鹏彭,银李,王铭文申请人:北京同仁堂股份有限公司