专利名称：：一种用于2,4-d残留快速检测胶体金试纸条的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于2,4-D残留检测的胶体金试纸条，主要适用于果蔬、水和粮食等样品中2,4-D残留的快速测定。属于免疫分析
技术领域：
。二
背景技术：
：2,4—二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyaceticacid，2,4-D)为一种苯氧羧酸类除草剂和植物生长调节剂，被广泛应用于小麦、大麦、谷物、草坪和牧场等去除阔叶类杂草和蔬菜的生长调节剂，大约有1500多种的农药中含有2,4-D的活性成分。2,4-D的急性毒性主要表现为神经性毒性；2,4-D还能刺激胃肠道引起恶心、呕吐和腹泻；皮肤接触2,4-D可能引起皮疹或皮炎。'另据报道2，4-D可能真有潜在的"三致"作用。由于其在农业生产中的广泛使用，已造成了果蔬、粮食、地下水和饮用水的污染。除草剂2，4-D残留常规分析方法主要是气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)等仪器方法。应用这些理化分析技术对环境、生物、食品等样品中痕量2,4-D残留进行分析，不仅仪器化程度要求较高，并且需要经过繁琐的分离、提取、净化、衍生等前处理过程，分析速度慢、成本高，并且前处理过程需要使用大量的有机溶剂，造成了二次污染。随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求，因此，迫切需要开发高效率农药残留快速分析技术。基于酶联免疫吸附分析方法的2,4-D残留快速胶体金检测试纸具有特异性强、灵敏度高而且简便快速，可以弥补色谱分析方法的缺陷。本发明对解决大批量样品的2,4-D残留现场监控技术具有重要的现实意义。三
发明内容为了解决目前农药残留仪器分析方法成本高、操作复杂、特异性差、灵敏度低和检测结果不稳定等缺点，本发明提供了一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单，并能用于大批量样品快速检测的2,4-D残留的胶体金试纸。2,4-D残留的快速检测试纸包括盒体、胶体金试纸条小包装、海绵支架和支架内包含有浓縮样品提取液、使用说明书。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是(1)首先利用活性酯法将2,4-D与牛血清白蛋白(BSA)偶联后制备人工免疫原，用该免疫原免疫新西兰大白兔制备出2,4-D多克隆抗体。(2)用混合酸酐法将2,4-D与卵清蛋白(OVA)偶联，它们的复合物作为包被抗原被固定于醋酸纤维膜(NC)作为检测线(T线)。(3)以羊抗兔抗体固定于醋酸纤维膜(NC)作为控制线线(C线)(4)柠檬酸钠改良法制备胶体金，同时标记制备的兔抗2,4-D抗体，并固定于胶体金垫上(5)按图1组装试纸条(6)检测与判定将待测2，4-D样品提取液滴加于样品垫上，室温放置10min后，观察。如T线显色则为阴性(即样品中2,4-D含量少于控制量)，反之为阳性，即T线不显色(样品中2,4-D含量高于控制量)。图版1所示。本发明的优点是能准确灵敏地检测水和果蔬及粮食中2,4-D残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时快速检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。试剂条的保存期至少6个月。四附图1为试纸条组装示意图和试纸条判读示意图(1、羊抗兔抗体，2、2,4-D-OVA，3、塑料衬板，4、吸水材料，5、硝酸纤维素膜，6、胶体金垫，7、金标抗体，8、样品垫，9、玻璃纤维素膜)，附图2为胶体金溶液的紫外可见光谱，图版1为试纸条判读示意图，图版2为胶体金扫描电镜图，图版3为胶体金透射电镜图，图版4为灵敏度的测定(10005ng/mL)，图版5为灵敏度的测定(1020ng/mL)。五具体实施例方式(1)试纸条的使用将盒内样品提取液稀释至500ml备用。取测定样品l.Og，加入10ml提取液研磨提取，取上清液lOO)il滴加至样品垫上，室温放置10min后进行判读。(2)如为阴性，则样品中2,4-D含量<17ng/mL，否则>17ng/mL实施例12,4-D与载体蛋白偶联(1)活性酯法偶联2,4-D与牛血清白蛋白(BSA)称取250mg2,4-D(约270umol)溶于10mL无水二甲基酰胺(DMF)中(A液)，称取500mg!3SA溶于10mL0.01moI/LpH7.4PBS中(B液)，250mgEDC溶于适量PBS(C液)，将A液滴入C液中反应lh;然后将反应液逐滴滴入B液中，并在室温搅拌反应12h，然后将反应液透析、离心，上清液冷冻干燥，4"保存。(2)混合酸酐法偶联2,4-D与卵清白蛋白(0VA)准确称取2,4-D250mg，加入10mLDMF溶解，再向此溶液中依次加入50.0pL三正丁胺和3(^L氯丁酸异丁酯，室温磁力搅拌过夜；再将此溶液在搅拌状态下缓慢滴加到溶有450mgOVA的20mL0.05mol/LpH9.6的碳酸缓冲液中，搅拌反应24h;此反应液在4'C下对O.Olmol/LpH7.4的磷酸缓冲液透析，透析液3500rpmn离心lOmin，上清液冷冻干燥，得合成抗原。实施例22,4-D多克隆抗体制备将2,4—D与BSA的偶联物作免疫原，称2mg免疫原溶于lmL无菌生理盐水中，与'imL完全弗氏佐剂混合，充分乳化后注射新西兰大白兔颈背部皮下(6点)，以后每隔两周加强免疫一次，换用不完全弗氏佐剂与免疫原混合，免疫部位相同，从第三次免疫开始，每次免疫后一周从兔耳静脉采血检测血清效价。总共免疫5次，最后一次免疫后一周从兔颈动脉釆全血，先用辛酸-饱和硫酸铵法粗提兔抗血清，再用DE-52阴离子交换层析法进一步纯化，获得较纯的2,4-D多克隆抗体。实施例3胶体金制备柠檬酸钠改良法制备胶体金(1)用新制去离子水配制100mL0.0P/。氯金酸，置于锥形瓶内，电炉加热至煮沸。(2)准确吸取一定量的1.0%柠檬酸三钠，迅速加入锥形瓶中，摇晃均匀后，立即放入电炉中继续煮沸，直至氯金酸变成红色后取出。冷却至室温后用去离子水恢复至原体积，无菌密封保存。如图2所示400~700nm紫外扫描的最大吸收峰波长为525nm，并在237nm处有较小吸收峰，双峰为胶体金的特征。图版2、图版3所示在电镜下观察到胶体金颗粒的大小基本一致，没有椭圆形、多角形的金颗粒，粒径大约在2030nm，符合胶体金标记要求。实施例42,4-D抗体的胶体金标记在2mL体积的胶体金溶液中，用0.1mol/LK2C03、0.1mol/LHC1调节pH值至8.0，在磁力搅拌下，将抗体溶液(84pg/mL)逐滴加入胶体金溶液中(llmg的蛋白质约5min加完)，室温搅拌15min。采用低温超速离心法纯化以除去其中未标记的抗体和未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。沉淀溶于原体积的1/10PB(含P/。BSA)缓冲液中。4"C保存备用。实施例5胶体金试纸条组装(1)将适量的包被抗原和羊抗兔抗体包被于NC膜(lcmX2cm)上。(2)适量的金标2,4-D抗体固定于玻璃纤维(lcmXlcm)上。(3)取制作试纸条专用的塑料板，先撕掉粘贴硝酸纤维素膜部位的纸条，裁取相应长度的硝酸纤维素膜粘贴在塑料板上，然后取吸附好金标抗体的玻璃纤维贴于相应部位，要压住硝酸纤维素膜，再粘好吸水材料和没有吸附金标抗体的玻璃纤维纸。如图l所示实施例6试纸条检测灵敏度将2,4-D'2000.0ng/mL的贮备液用含5%甲醇PBST的缓冲液配制成1000.0ng/mL、500.0ng/mL、100.0ng/mL、50.0ng/mL、20.0ng/mL、10.0ng/mL、5.0ng/mL和阴性的标准系列溶液。并在确定为阳性浓度下进一步准确细分浓度，将金标试纸条插入上述标准系列溶液中2030s后，取出10min观察结果。结果如表1由表1和2可知，试纸条检测含量在20.0ng/mL以上的2,4-D标准液时，结果都为阳性。对此浓度进一歩实验，发现在检测浓度为17.0ng/mL的2，4-D时，可观测到样本试纸条T线。因此，试纸条的检测灵敏度确定为17.0ng/mL。见图版4、图版5。表l灵敏度的测定(10005ng/mL)2,4-D浓度(ng/mL)阴性样品1000500100502010结果(T线)—+++++——备注"十""一"分別表示阳性和阴性表2灵敏度的测定(2010ng/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*10X稀释液,"+"阳性，"-"阴性由表可知，添加浓度为200.0ng/mL和100.0ng/mL时，IOX稀释后试纸条对4-氯-2-甲基苯氧乙酸(DMPC)，4-氯-2-甲基苯氧丙酸(Mecoprop)、2-(4-羟基苯氧基)丙酸(2-(4-Hydroxyphenoxy)propionicacid,Propionic)3种类似物检测结果为阴性，浓度为200.0ng/mL时，10X稀释后试纸条对2,4-D检测结果为阳性，表明本实验研制的试纸条对2,4-D具有较高的特异性，只适用于样本中2,4-D检测。实施例8重复性试验随机取不同批次的试纸条，对lOx稀释的阴性样品，20.0ng/mL的2，4-D标准溶液，200.0ngZmL添加浓度水样本lOx稀释液进行重复试验。结果见表4。表4试纸条童复性试验<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注"'+',、"一"分别表示试纸条检测结果为阳性和阴性从3个批次的试纸条中随机抽取的试纸条对IOX稀释阴性水样本、20.0ng/mL2,4-D标准液、200.0ng/mL添加浓度水样本IOX稀释液检测结果一致，说明不同批次间试纸条重复性较好。实施例9试纸条稳定性测试(1)将制作好的试纸条置于4。C的冰箱内，分别在l、2、3、4、5、6月后取试纸条进行浓度为0.0、10.0、20.0ng/mL2,4-D标样溶液的测试，每次2个重复，观察稳定性测试结果(检测线和质控线的有无、条带的清晰度以及玻璃纤维释放金标记抗体的程度)。(2)加速稳定性试验37'C、7d。将制作好的试纸条置于37"C的干燥箱内，每天取试纸条进行2,4-D标样溶液(0.0，10.0，20.0ng/mL)的测试，每处理3个重复，观察稳定性测试结果(检测线和质控线的有无、条带的清晰度以及玻璃纤维释放金标记抗体的程度)。密闭保存于4'C条件下的试纸条在6次12组检测试验中，检测阴性样本时检测线清晰，背景白色，结合释放垫上金标抗体释放完全；检测20.0ng/mL标准品时，对照试纸条检测线清晰，测样试纸条检测线完全消失(阴性)，符合实验要求。试纸条在37'C条件下保存到第6d，检测阴性样本时检测线颜色开始变浅，第7d对照试纸条检测线颜色己很浅，模糊不清。最后确定试纸条的保存条件是置于铝箔袋中抽真空、加干燥剂室温密闭保存，有效期至少为6个月。权利要求1.一种用于2，4-D残留快速检测胶体金试纸条，其特征在于由盒体、试纸条、海绵支架和支架内包含的浓缩样品提取液。2.根据权利要求1所述一种用于2,4-D残留快速检测胶体金试纸条，盒内有真空包装的用于2,4-D检测的胶体金试纸条。每个^^纸条上吸附相同量的包被抗厚和抗体以及金标抗体。3.根据权利要求2所述的包被抗原和抗体，其特征为醋酸纤维膜(NC)上有包被相同量的2，4-D和卵清蛋白(OVA)的偶联复合物及羊抗兔抗体。玻璃纤维膜上吸附相同量的胶体金标记的兔抗2,4-D多克隆抗体。4.根据权利要求3所述兔抗2,4-D多克隆抗体制备方法如下以2,4-D和牛血清蛋白(BSA)的偶联复合物作为免疫原免疫新西兰雌性大白兔获得2,4-D多克隆抗体。5.根据权利3所述胶体金标记兔抗2,4-D多克隆抗体制备方法如下采用柠檬酸钠还原氯金酸制备胶体金;在pH8.0滴加兔抗2,4-D多克隆抗体，离心纯化制得金标抗体。6.根据权利要求1所述浓縮样品提取液配制(稀释20倍使用)Na2HPCV2H20288.4mg，NaH2P04'2H205.9mg，吐温-20100pL,甲醇4mL，蒸馏水10mL。7.根据权利要求1所述试纸条有以下部分组成试纸条专用的塑料板(lcmx8cm)，塑料板自上而下依次粘贴吸水纸(1cmx3cm),硝酸纤维素膜(1cmx2cm),胶体金吸附垫(玻璃纤维，lcmxlcm)，样品垫(玻璃纤维，lcmx2cm)。全文摘要本发明涉及了一种用于2，4-D残留快速检测胶体金试纸条，属于免疫分析
技术领域：
。本发明克服了2，4-D理化分析方法操作复杂、检测成本高、速度慢和环境二次污染等缺点，能准确、快速检测果蔬、粮食作物和水中样品的2，4-D残留。检测过程中，样品中的2，4-D和金标2，4-D抗体(定量)的特异性反应，通过剩余金标2，4-D抗体于试纸条醋酸纤维膜上预包被2，4-D包被抗原(检测线，T线)的特异性结合反应确定样品中2，4-D含量(显色为阴性，即不超过控制量；反之则超过控制量)；并以试纸条醋酸纤维膜上预包被的羊抗兔抗体作为质量控制线(C线，显色为试纸条有效，反之失效)。试纸条保存期为至少6个月。文档编号G01N33/543GK101451997SQ200810246960公开日2009年6月10日申请日期2008年12月31日优先权日2008年12月31日发明者于基成,曹远银,菡王申请人:沈阳农业大学