专利名称：：18个基因座的荧光标记复合扩增检验系统的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种18个基因座的荧光标记复合扩增检验系统，具体是涉及一种同时分析人基因组DNA18个基因座的五色荧光标记复合扩增系统，该系统可以应用于个体识别和亲子鉴定。
背景技术：
：短串联重复序列基因座(STR)是目前普遍应用的遗传标记。90年代初STR基因座多态性的发现，特别是STR基因座具有片段小容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够复合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。尤其是在建立DNA数据库方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性。因此美国FBI选择了13个STR基因座用于建立DNA数据库——CODIS(CombinedDNAIndexSystem):CSFlPO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、HUMTHOl、TPOX、vWA。这些STR基因座通常被称为13个核心基因座。正因为STR所具备的优点和应用前景，法医学界以及一些大的公司均投入大量的资金对其进行了开发性的研究。90年代中后期以美国ABI公司为代表的研发商建立起荧光复合扩增体系。目前最具代表性的是ABI(AppliedBiosystems，USA)公司的IdentifilerTM和Promega(USA)公司的PowerPlex-16荧光检测试剂盒。这两个试剂盒均包括上述13个核心基因座。长期的DNA检验实践表明，短串联重复序列基因座的遗传多态性在种族间存在一定的差异，各个基因座间差别也很大。在美国FBI推荐的13个核心基因座中，有部分基因座遗传多态性不高，或是不同人群间差异较大。由此给DNA检验技术的应用及其效率带来一定的影响。4专利ZL200510096613.6公开了一种同时分析人基因组DNA的多个基因座的荧光标记复合扩增系统，其特征在于所述的15个基因座为Amelogenin、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、PentaE、CSFIPO、vWA、FGA。该专利提供了对15个基因座的分型结果，为4色荧光检测系统，其基因座分型系统的累积个体识别能力为3.49Xl(T18，累积非父排除率为0.999，999，6。我们对中国人群的短串联重复序列基因座的遗传多态性进行了深入的研究，并以此为依据开发新的短串联重复序列基因座的复合扩增检验系统，以求在5色荧光检测系统中，提供对包括Amelogenin在内的18个基因座的分型结果，同时提高系统的累计个体识别能力和累积非父排除率。
发明内容本发明的目的之一在于提供一种通过复合扩增18个基因座来进行个体识别和亲子鉴定的荧光标记STR复合扩增检验系统。涉及检测人基因组中具有多态性的遗传标记。本发明特别涉及用聚合酶链式反应在一个体系中同时扩增多个短串联重复基因座。为了实现本发明的目的，采用如下技术方案一种同时分析人基因组DNA的18个基因座的荧光标记复合扩增系统，复合扩增分析的18个基因座为Amelogenin、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、PentaE、TPOX、THOl、CSFIPO、vWA、FGA。本发明是在一个复合扩增反应体系中同时扩增18个基因座；将18个基因座分为四组并分别用四种颜色的荧光染料分别进行标记Amdogenin、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和PentaE为一组；TPOX、THOl、D2S1338、CSFlPO和D19S433为一组；vWA、D5S818、FGA和D6S1043为一组；D8S1179、D21S11和D18S51为一组。本发明所采用的18个基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5，端进行荧光染料标记；本发明的系统中包括每个基因座所对应的等位基因标准物的混合物，以确定DNA样品中各个基因座的等位基因；本发明的系统中包含的用于鉴别DNA样品性别的基因座是Amelogenin基因座；本发明的荧光标记复合扩增系统扩增多个基因座采用聚合酶链式反应进行，检测方法采用多道或单道毛细管电泳。本发明还涉及一种采用该荧光标记复合扩增检验系统对DNA样品进行分析的方法；其中，本发明适用的DNA样品来源于精斑、唾液斑、组织、血痕或血液等。本发明中17个短串联重复序列基因座STR基因座构成为D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaE、D2S1338、CSFIPO、D19S433、vWA、D5S818、FGA、D6S1043、D8S1179、D21S11、D18S51、TPOX、THOl。本发明对上述17个短串联重复序列基因座及其等位基因遗传特征进行了深入的研究，表明这17个短串联重复序列基因座在人群中具有高度的遗传多态性和良好的等位基因频率分布。将上述n个短串联重复序列基因座加上用于鉴别人性别的Amelogenin基因座构成本发明的复合扩增检验系统。本发明提供了一种通过复合扩增18个基因座来进行个体识别和亲子鉴定的检验系统。该基因座构成，.突破了现有13个核心基因座的模式，更加符合法医学DNA检验的技术要求与中国人群的群体遗传学特征，并兼顾了国际数据交流与共享的需求。本发明提供了荧光标记复合扩增体系的基因座组合设计方案。本发明分别选用了蓝、绿、黄、红、橙5色荧光组合方案。这种基因座组合方式使得仅需标记四种荧光就可实现这18个基因座在同一反应中扩增，同时将全部基因座扩增产物控制在400bp以内而实现高灵敏度。本发明提供用于复合扩增18个基因座的寡核苷酸引物混合物。本发明提供的检验系统达到目前国际上STR荧光标记复合扩增试剂盒的最高水平。一、基因座的确定对现有的STR基因座进行深入分析研究并优选新的高鉴别力基因座。对D8S1179、D21S11、D7S820、CSFIPO、D3S1358、D13S317、D16S539、TPOX、THOl、D5S818、vWA、D18S51、FGA、D2S1338、D19S433、PentaE、PentaD、D19S253、D12S391、D6S1043等24个STR基因座在中国人群的遗传多态性开展调查研究。对5000多名个体进行基因型检测，根据各基因座等位基因的分布频率计算个体识别能力(DP)、杂合度(H)、非父排除率(PE)等数据，表明在24个STR基因座中，除THOl、TPOX基因座外，其余各基因座的DP值均接近0.9，H均大于0.7，PE值大都在0.5以上，这表明它们在法医学上有较好的应用价值。THOl、TPOX基因座在多态性方面较差，但也符合法医应用的要求。多态信息含量(PIC)也是衡量DNA基因座应用价值大小的指标之一。本系统所选STR基因座PIC均大于0.5，故可为生物学检材的检验提供相当大的f曰息里o在考虑到与现有数据库兼容的基础上，最终确立了STR基因座构成，即D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaE、TPOX、THOl、D2S1338、CSF1P0、D19S433、vWA、D5S818、FGA、D6S1043、D8S1179、D21S11、D18S51。该基因座构成突破了现有13个核心基因座的模式，提供了18个基因座的分型结果，提高了系统的累计个体识别能力和累积非父排除率，更加符合法医学DNA检验的技术要求。二、荧光标记复合扩增体系的基因座组合方案设计本研究对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、黄、红、橙五种荧光标记物，构建了5色荧光组合方案。在确定5色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，在国内首次自行设计出基因座组合方式，以下为其中一种产品组合方式Amelogenin、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和PentaE为一组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM;TPOX、THOl、D2S1338、CSFIPO、D19S433为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX;vWA、D5S818、FGA、D6S1043为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA;D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX;。内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。这种独创的基因座组合方式使得仅需标记四种荧光就可实现这18个基因座的同吋检测分析。在组合方案的基础上，根据18个基因座所在位置的侧翼序列进行引物设计，实现18个基因座在同一反应中的复合扩增，同时将全部基因座扩增产物控制在400bp以内而实现高灵敏度。本发明在国内首次实现18个基因座同时在单一反应中的复合扩增，并以五色荧光标记进行检验。三、荧光标记STR复合扩增体系的优化及建立1、基因座之间平衡度的调配随着复合扩增体系中基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，通过多次反复实验，调节引物浓度与配比，终达到平衡。2、复合扩增条件的建立先对18个基因座的单一扩增条件进行优化，在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上，研究18个基因座复合扩增PCR反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如，循环参数、退火温度、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，建立起复合扩增体系，同时扩增出18个基因座。其良好的应用效果主要表现在下述几个方面1.系统的灵敏度本发明中18个基因座的荧光标记复合扩增检验系统在DNA模板量为0.2ng的条件下，可检出全部18个基因座。2.遗传学调査用18个基因座的荧光标记复合扩增检验系统对中国汉族群体共5000多个样品进行遗传学调查的结果表明该试剂在中国汉族人群中的总体随机匹配概率为8.8xl(T21，其累积非父排除率为0.999999999993。3.实际应用的效果本发明中18个基因座的荧光标记复合扩增系统已在国内IO个省市的公安系统中测试与试用，结果表明该系统多态性高，平衡性好，灵敏度高，分型结果准确，完全能够满足实际案件检验、DNA数据库建设以及亲子鉴定的需要。图l:对无关个体DNA样品的STR分型结果。图2:18个基因座的荧光标记复合扩增检验系统的等位基因分型标准物。图3:对实施例2样品中的STR分型结果。具体实施例方式下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。实施例118个基因座的荧光标记复合扩增检验系统的复合扩增以及荧光检测。1、PCR扩增体系la分体积人基因组DNA0.5~2ngReactionMix10.0pLPrimers17+15.0(iL热启动G-Taq酶(5U/fiL)0.5sdH20补足至25.0^L2、扩增热循S9(1)将PCR扩增管置于热循环仪上;(2)选择下面推荐的程序进行扩增;(3)扩增后的样品应避光保存；热循环仪的扩增程序初始变性热循环终延伸保温IO个循环94°C1分钟，95°C62'C1分钟，72°C1分钟60。C4°C11分钟20个循环90°Cl分钟，60分钟维持60°C1分钟，72°C1分钟3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(AGCUMarkerSIZ-500)组成上样混合物((0.5plAGCUMarkerSIZ-500)X(进样数)+(12^去离子甲酰胺)X(进样数)〕。将上样混合物与1nl扩增产物或系统中等位基因分析标准物(17+1AllelicLadder)混合，避免产生气泡。95'C变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。4、分型分析用片段分析软件GeneMapper分析步骤3中遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和17+1AllelicLadder(见附图2)比较，得到实际样品的分型数据，结果见附图1。实施例2应用18个基因座的荧光标记复合扩增检验系统进行亲子鉴定1、收集亲子鉴定案件中的血样本实验中样品由深圳血站提供。2、Chelex-100法提取基因组DNA取0.55pl全血或13mmx25mm的血斑置于灭菌的1.5ml离心管中，加AsdH20lml于管中，振荡数秒。置于室温10分钟，振荡数秒。用12，000rpm离心3分钟。弃上清液，-保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀。加入20(Hd5。/。的Chelex-100，振荡数秒。于56。C保温30分钟，振荡数秒。沸水浴10分钟，振荡数秒。用12,000rpm离心5分钟，上清中为提取得到的人基因组DNA。3、扩增检测按照实施例1进行PCR扩增、遗传分析仪检测并最终获得分型结果。4、结论亲子鉴定的基本原理为根据孟德尔遗传定律，亲代基因型决定子代基因型。在没有基因突变、分型差错的前提下①孩子的一对等位基因必定是一个来自父亲，一个来自母亲；②孩子不可能带有双亲均没有的等位基因。用实施例1方法检测一例父一子一母三联体亲子关系，其结果见附图3。在附图3中，各色图中各行依次为孩子、父亲、母亲的相应检测结果。由附图3得到本实验的亲子鉴定父一子一母基因分型如下表1:表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>CPI=21063359.1RCP=99.99999%PI为父权指数，又称亲子关系指数，是指假设父提供生父基因的可能性(x)与随机男人提供生父基因的可能性(Y)的比值，表示假设父为孩子生父比随机男子为孩子生父的可能性大多少倍，即PI=X/Y。f表示生母给孩子必需等位基因机会；c表示被控父亲给孩子必需等位基因机会；p表示随机男人给孩子必需等位基因机会，等于必需等位基因频率；联合父权指数CPI，为各个不连锁基因座PI的乘积；相对亲权概率(RCP)=(CPI/(CPI+1))xl00%;根据上述计算，本实验中父一子一母三联体亲子鉴定RCP值为99.99999%，认定亲子关系。1权利要求1.一种同时分析人基因组DNA18个基因座的荧光标记复合扩增系统，其特征在于复合扩增分析18个基因座Amelogenin、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、PentaE、TPOX、TH01、CSF1PO、vWA、FGA。2.如权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于在一个复合扩增反应体系中同时扩增18个基因座。3.如权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于所述的18个基因座分为四组并分别用四种不同颜色的荧光染料分别进行标记，分组方式为Amelogenin、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和PentaE为一组；TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO和D19S433为一组；vWA、D5S818、FGA和D6S1043为一组；D8S1179、D21S11和D18S51为一组。每组分别采用一种荧光染料进行标记。4.如权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于所述的18个基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5'端进行荧光染料标记。5.如权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于所述的系统中包括每个基因座所对应的等位基因标准物的混合物，以确定DNA样品中各个基因座的基因型。6.如权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于:所述的系统中用于鉴别DNA样品性别的基因座是Amelogenin基因座。7.如权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于其中多个基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应，其检测方法采用多道或单道毛细管电泳。8.—种同时分析人基因组DNA的方法，其特征在于应用权利要求1至3任一的复合扩增系统来进行DNA样品分析。9.根据权利要求8所述的方法，其中DNA样品包括精斑、唾液斑、组织、血痕或血液等。全文摘要本发明涉及一种同时分析人基因组DNA18个基因座的五色荧光标记复合扩增系统；本发明将18个基因座分为4组，共涉及5种颜色的荧光标记；本发明的荧光标记复合扩增系统的灵敏度高，在DNA模板量为0.2ng的条件下，可检出全部18个基因座；在中国汉族人群中的总体随机匹配概率为8.8×10<sup>-21</sup>，累积非父排除率为0.999999999993。文档编号G01N21/64GK101440410SQ200810246660公开日2009年5月27日申请日期2008年12月29日优先权日2008年12月29日发明者夏子芳,杜蔚安,熊勇华,郑卫国,陈光辉申请人:无锡中德美联生物技术有限公司