一种黄连木种子产脂肪酶内生菌pc1及其分离方法
【专利摘要】本发明公开了一种黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1及其分离方法，通过将种子用酒精、氯化汞处理后，接种于牛肉膏蛋白胨培养得到内生菌，用液体LB发酵菌种，将菌液接种于三丁酸甘油酯固体培养基培养，选取透明圈的菌种接种于液体LB培养基发酵，取发酵液离心分离过滤后，将滤液用三丁酸甘油酯固体培养基培养，筛选得到菌株PC1。菌株PC1平板划线得到单菌落，外观呈白色，生长初期表明湿润光滑，随后边缘出现褶皱并变干；革兰氏染色呈阳性，在电子显微镜下观察菌体呈杆状。CCTCC NO：M201446120141009
【专利说明】一种黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1及其分罔方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种黄连木种子产脂肪酶内生菌PCI及其分 离方法。
【背景技术】
[0002] 黄连木（Pistacia chinensis Bunge)又名偕木、黄楝、药木等，系漆树科黄连木属 落叶乔木。黄连木籽含油49. 3%，不饱和脂肪酸高达82. 4%，是一种优良的野生油料资源， 特别是生产生物柴油的理想木本油料。
[0003] 植物内生菌（endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健 康植物的各种组织和器官内部或细胞间隙的真菌、细菌或放线菌，被感染的宿主植物（至 少是暂时）不表现出外在症状。植物内生菌广泛存在于已研究过的所有植物中，已在农业、 医药和环境保护等方面有着重大应用价值。但至今未见有关于黄连木内生菌的报道。
[0004] 脂肪酶（Lipase，EC3. I. 1. 3)即三酰基甘油酰基水解酶，是一类能在水-油界面催 化甘油三酯水解，而且在非水相介质中可催化酯合成反应的酶。脂肪酶普遍存在于动植物 和微生物体内，但微生物源脂肪酶具有更宽的反应pH、适宜温度范围和更强的底物专一性 和立体选择性，因而在酶学理论研究和实际应用中具有更加突出的地位。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种黄连木种子产脂肪酶内生菌PCl及其分离方法，通过对其中 产脂肪酶的菌株进行的选育，得到优势菌株，并对其酶学性进行研究。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现：
[0007] -种黄连木种子产脂肪酶内生菌PCl，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培 养物保藏中心，地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学，中国典型培养物保藏中心； 保藏日期：2014年10月9日；保藏编号为：CCTCC M 2014461。
[0008] 所述的黄连木种子产脂肪酶内生菌PCl脂肪酶的核苷酸全长序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0009] 所述的PCl菌株平板划线得到单菌落，外观呈白色，生长初期表明湿润光滑，随后 边缘出现褶皱并变干；革兰氏染色呈阳性，在电子显微镜下观察菌体呈杆状。
[0010] 一种黄连木种子产脂肪酶内生菌PCI及其分离方法，具体通过以下步骤完成：
[0011] 1)选取新鲜健康的黄连木果实，物理去除坚硬的果皮后，从中挑选出完好无损的 种子在至少20倍体积的75%酒精中浸泡10min，0. 1%氯化汞中浸泡lOmin，用无菌水清洗 5次，每次Imin ;
[0012] 2)将5枚经消毒的黄连木种子放入无菌研钵中，加入500 μ L无菌水研磨成糊状， 加入无菌水稀释至5mL，取100 μ L稀释液接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，在28°C条件下培 养3?7天，得到内生细菌，平板划线纯化后4°C穿刺保存；
[0013] 3)将获得的菌株接种于5mL液体LB，28°C，150rpm培养过夜，取2 μ L菌液点于三 丁酸甘油酯固体培养基，48h后选取菌落周围有明显透明圈的菌株，再次接种于5mL液体LB 培养基中，28°C，150rpm震荡发酵48h ;
[0014] 4)取ImL发酵液于IOOOOrpm离心Imin后，将上清液过滤，取滤液于打好孔的三丁 酸甘油酯固体培养基的孔内，28°C培养48h后依据透明圈的直径大小，筛选得到一株产脂 肪酶的优势菌株PCl。
[0015] 所述的牛肉膏蛋白胨培养基为：牛肉膏38/1，似(：158/1，蛋白胨1(^/1，？!17.4? 7. 6。
[0016] 所述的三丁酸甘油酯固体培养基为：蛋白胨l〇g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 5g/L，琼 脂18g/L，pH 8. 0,三丁酸甘油酯乳化液2%，所述的三丁酸甘油酯乳化液：三丁酸甘油酯与 4%阿拉伯树胶溶液体积比1:3在无菌条件下乳化至少5min。
[0017] 本发明方法得到的菌株PCl可以分泌产脂肪酶，该酶对多种有机溶剂有耐受性， 其中甲醇和丙酮对该酶有明显促进作用，最适PH为8. 0,且有广谱的pH稳定性；最适作用 温度为35°C，但不耐高温，在50°C时基本失活；与短小芽孢杆菌L5脂肪酶有最近的亲缘关 系。
[0018] 本发明的有益效果为首次从黄连木种子里分离得到内生菌，通过对其中产脂肪酶 的菌株进行的选育，得到一优势菌株PC1，为其酶学性质的研究提供了技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是本发明菌株PCl的革兰氏染色图；
[0020] 图2是本发明菌株PCl的16S rDNA序列的系统进化分析；
[0021] 图3是本发明菌株PCl所产脂肪酶的最适pH和pH稳定性；
[0022] 图4是本发明菌株PCl所产脂肪酶的最适温度和热温定性；
[0023] 图5是表面活性剂对本发明菌株PCl所产脂肪酶活性的影响；
[0024] 图6是有机溶剂对本发明菌株PCl所产脂肪酶活性的影响；
[0025] 图7是本发明菌株PCl脂肪酶的核苷酸和推测的氨基酸序列；
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的 较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用 上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内 容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本 发明的保护范围内。
[0027] 实施例1
[0028] -种黄连木种子产脂肪酶内生菌PCl及其分离方法，具体通过以下步骤完成：
[0029] 1)选取新鲜健康的黄连木果实，物理去除坚硬的果皮后，从中挑选出完好无损的 种子在至少20倍体积的75%酒精中浸泡1〇11^11，0.1%氯化汞中浸泡1〇1^11，中间不时摇动， 然后用无菌水清洗5次，每次Imin ;
[0030] 2)将5枚经消毒的黄连木种子放入无菌研钵中，加入500 μ L无菌水研磨成糊状， 然后加入无菌水稀释到5mL，取IOOyL稀释液接种于牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g， NaCl 5g，蛋白胨10g，水1L，PH 7. 4?7. 6)上，同时取最后一次清洗的无菌水和未研磨的 种子作为负对照，在28°C条件下培养3?7天，得到内生细菌，平板划线纯化后4°C穿刺保 存；试验重复3次，每次设置3个平行组；
[0031] 3)将获得的菌株接种于5mL液体LB，28°C，150rpm培养过夜，取2 μ L菌液点于三 丁酸甘油酯固体培养基上，48h后选取菌落周围有明显透明圈的菌株，再次接种于5mL液体 LB培养基中，28°C，150rpm震荡发酵48h ;
[0032] 4)取ImL发酵液于IOOOOrpm离心Imin后，将上清液用无菌滤膜过滤，取滤液于打 好孔的三丁酸甘油酯固体培养基的孔内，28°C培养48h后依据透明圈的直径大小，筛选得 到一株产脂肪酶的优势菌株，暂命名为PCl。
[0033] 获得的PCl菌株平板划线得到单菌落，外观呈白色，生长初期表明湿润光滑，随后 边缘出现褶皱并变干；革兰氏染色呈阳性，在电子显微镜下观察菌体呈杆状（图1)。
[0034] 该PCl菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉 市洪山区八一路，武汉大学，中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2014年10月9日；保藏 号为：CCTCC M 2014461。
[0035] 通过利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增并测序得到PCl菌株的16S rDNA 的部分核苷酸序列，借助Clustalw和MEGA5. 1软件对PCl菌株的16S rDNA序列进化系统 分析（图2)，显示其与Bacillus pumilus S7具有最近的亲缘关系，表明该菌属于短小芽孢 杆菌 Bacillus pumilus，因此将该菌命名为 Bacillus pumilus PC1。
[0036] 实施例2利用对硝基苯酚法测定PCl所产脂肪酶的酶学性质 [0037] L利用对硝基苯酚法测定脂肪酶活力
[0038] 分别配制溶液A [30mg对硝基苯棕榈酸酯（p-NPP)溶于IOmL异丙醇]和溶液 B[50mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)]。将溶液A与B按1:18比例混匀并取I. 9mL于试管中，力口 入上清粗酶液〇. ImL (设高温灭活的粗酶液为负对照），于28°C准确反应IOmin后，加入ImL 10 %的SDS溶液终止反应。分光光度计0D410nm下测定催化产生的对硝基酚（pNP)的吸收 值。
[0039] 脂肪酶1个酶活单位定义：在pH8. 0, 28°C条件下，以每分钟释放1 μ mol pNP所需 的酶量，酶活计算公式：
[0040] A= ([A1 - A0] X K+C〇) XV1XnZ(V2Xt)
[0041] 式中，A:样品酶活（U/mL) ;A1:样品酶液的吸光度OD值；Atl:对应酶液的空白吸光 度OD值；K:对硝基酚标准曲线的斜率；C tl:对硝基酚标准曲线的截距；η:稀释倍数W1:反 应液的体积/mL ;V2:酶液的体积/mL ;t:反应时间/min。
[0042] 2.脂肪酶的酶学性质
[0043] 把过夜培养的PCl菌液按1%接种量接种在50mL液体LB培养基中，150rpm发酵 48h。将发酵液经5000rpm离心15min，取上清液在不同的pH环境下反应IOmin后测酶的最 适pH，让粗酶液与等体积的不同pH的缓冲液混合，4°C放置24h后测剩余酶活，确定酶的pH 稳定性。将粗酶液在不同的温度下反应IOmin后测酶的最适作用温度；让粗酶液在不同的 温度下放置Ih后测剩余酶活，确定酶的温度稳定性。将粗酶液与等体积的不同表面活性剂 或有机溶剂混匀，28°C，150rpm摇动30min后检测剩余酶活。
[0044] 结果表明，通过利用对硝基苯酚法测定PCl菌株所产脂肪酶的酶学性质，表明该 PCl菌株所产脂肪酶的最适pH为8. O且有广谱的pH稳定性（图3);最适作用温度为35°C， 但不耐高温，在50°C时基本失活（图4)。表面活性剂显著抑制该酶活性（图5)。该酶对多 种有机溶剂有耐受性，其中甲醇和丙酮对该酶有明显促进作用（图6)。
[0045] 实施例3PC1脂肪酶基因的克隆
[0046] 通过对NCBI GenBank数据库中已公布的部分短小芽孢杆菌脂肪酶的核苷酸序 列使用Clustalw软件进行多重序列比对分析，确定严格保守的区段用于设计扩增脂肪酶 基因全长的正反向引物（P 1 :TAG AGTCGTATAAGATGAATAAGG 和 P2 :TTAATTCGTATTCTGTCCT CCG)。PCR 扩增体系（50 μ L) :5 X PHmerSTAR(S)BufTer 10 μ L、d NTP Mixture (2. 5mM each)4y L、PrimeSTAR?HS (2. 5U/y L)0. 5μ L、ddH2032. 5μ L、引物 P1 和卩2(1(^]\〇 各 14 1^、？(：1基因组0嫩1以1^。？0?反应条件：941：预变性41^11;951：变性2〇8,581：退火3〇8， 72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸5min。扩增产物送往公司测序。
[0047] 结果表明：通过同源克隆得到PCl脂肪酶的核苷酸全长序列，如SEQ ID NO. 1所 示，经系统进化分析进一步表明本发明鉴定的短小芽孢杆菌PCl脂肪酶与NCBI公布的短小 芽孢杆菌L5脂肪酶有最近的亲缘关系（图7)，但序列仍有区别。
[0048]
【权利要求】
1. 一种黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1，其特征在于：该菌株已于2014年10月9日保 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 201446。
2. 根据权利要求1所述的黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1，其特征在于：所述的黄连木 种子产脂肪酶内生菌PC1脂肪酶的核苷酸全长序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 根据权利要求1所述的黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1，其特征在于：所述的PCI菌 株平板划线得到单菌落，外观呈白色，生长初期表明湿润光滑，随后边缘出现褶皱并变干； 革兰氏染色呈阳性，在电子显微镜下观察菌体呈杆状。
4. 权利要求1所述的黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1的分离方法，其特征在于：包含 以下步骤： 1) 选取新鲜健康的黄连木果实，物理去除坚硬的果皮后，从中挑选出完好无损的种子 在至少20倍体积的75%酒精中浸泡lOmin，0. 1 %氯化汞中浸泡lOmin，用无菌水清洗5次， 每次lmin ; 2) 将5枚经消毒的黄连木种子放入无菌研钵中，加入500 y L无菌水研磨成糊状，力口 入无菌水稀释至5mL，取lOOy L稀释液接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，在28°C条件下培养 3?7天，得到内生细菌，平板划线纯化后4°C穿刺保存； 3) 将获得的菌株接种于5mL液体LB，28°C，150rpm培养过夜，取2 y L菌液点于三丁酸 甘油酯固体培养基，48h后选取菌落周围有明显透明圈的菌株，再次接种于5mL液体LB培养 基中，28°C，150rpm震荡发酵48h ; 4) 取lmL发酵液于lOOOOrpm离心lmin后，将上清液过滤，取滤液于打好孔的三丁酸甘 油酯固体培养基的孔内，28°C培养48h后依据透明圈的直径大小，筛选得到一株产脂肪酶 的优势菌株PC1。
5. 根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于：所述的牛肉膏蛋白胨培养基为：牛肉 膏38，恥(：158，蛋白胨1(^，水比，？117.4?7.6。
6. 根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于：所述的三丁酸甘油酯固体培养基为： 蛋白胨l〇g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂18g/L，pH 8. 0,三丁酸甘油酯乳化液2%。
7. 根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于：所述的三丁酸甘油酯乳化液为三丁 酸甘油酯与4%阿拉伯树胶溶液体积比1:3在无菌条件下乳化至少5min。
【文档编号】C12R1/07GK104388353SQ201410696261
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】陈东红, 宋春竹, 阮颖, 黄勇, 刘春林 申请人:湖南农业大学