一种牙周膜干细胞的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞培养领域，尤其设及一种牙周膜干细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002] 牙周膜干细胞（periodontalligamentstemcells,PDLSCs)是存在于牙齿牙周 组织中的一类可自我更新、增殖能力强及具有多向分化能力的成纤维细胞样干细胞。牙周 膜干细胞具有多向分化的潜能，体外可分化为成脂细胞、成骨细胞样细胞、成牙骨质样细胞 和神经前体细胞等，体内可分化为成牙骨质样和牙周膜样组织。因此，牙周膜干细胞是牙周 组织再生的种子细胞，将体外培养的牙周膜干细胞回输人体W治疗牙周病等疾病。现有牙 周膜干细胞的培养多采用单层细胞培养，获得的细胞数量低，生物性状与体内存在差异。
【发明内容】
[0003] 有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种牙周膜干细胞的培养方法。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0005] -种牙周膜干细胞的培养方法，将牙周膜干细胞接种到水凝胶上，用含BMP-2的 无血清培养基进行Ξ维培养。
[0006] 优选地，所述BMP-2的浓度为5-15ng/mL。
[0007] 优选地，Ξ维培养接种用的牙周膜干细胞在二维培养时，使用含bFGF的无血清培 养基进行培养。
[0008] 优选地，所述bFGF的浓度为5-15ng/mL。
[0009] 优选地，所述水凝胶为I型胶原水凝胶。
[0010] 更优选地，所述I型胶原水凝胶通过W下方法制备：I型胶原水凝胶溶液瞬时离 屯、脱泡，接种到预先冷却的培养板内，-80°C静置2-4h后冻干12-2化。
[0011] 更优选地，所述I型胶原水凝胶通过W下方法制备：将I型胶原酸性溶液调节抑 值至7. 2左右，得到终浓度为5-15mg/血的胶原水凝胶溶液；瞬时离屯、脱泡后接种到预先冷 却的48孔板或96孔板内，-80°C静置化后冻干16h。
[0012] 优选地，Ξ维培养接种用的牙周膜干细胞是传代培养第2代至第5代细胞。
[0013] 优选地，所述牙周膜干细胞的培养方法包括W下步骤：
[0014] S1、牙周膜干细胞的分离及纯化
[0015] 用I型胶原酶溶液消化牙周膜组织，获得牙周膜干细胞；用含bFGF的无血清培养 基培养牙周膜干细胞，至汇合度80% -90%，用膜蛋白酶溶液消化进行传代培养；
[0016] 第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，待克隆长至汇合度 30 % -60 %时，用膜蛋白酶溶液消化细胞，进行扩大培养；
[0017] S2、S维培养
[0018] 用膜蛋白酶溶液消化第3代细胞，接种至水凝胶上，用含有BMP-2的无血清培养基 进行Ξ维培养。
[0019] 优选地，无血清培养基包含基础培养基、非必需氨基酸、谷氨酷胺和血清替代物， 基础培养基为叫traCULTURESerum-freeMedium。
[0020] 更优选地，非必需氨基酸的浓度为1倍，谷胺酷胺的浓度为血清替代物 的体积百分数为5%。
[0021] 优选地，在上述无血清培养基中添加bFGF即为含bFGF的无血清培养基。因含 bFGF的无血清培养基是用于牙周膜干细胞的二维培养，下文中将其称为二维培养用无血清 培养基。为了防止污染，二维培养用无血清培养基中还可W添加抗生素。本发明中优选二 维培养用无血清培养基含有5-15ng/mLbFGF、1倍浓度的双抗（lOOU/mL青霉素和100μg/ mL链霉素），即二维培养用无血清培养基组成为：2mmol/L谷胺酷胺、1倍的非必需氨基酸、 体积百分数5 %血清替代物、5-15ng/mLbFGF、lOOU/mL青霉素和100μg/mL链霉素，余量为 U1traCULTURESerum-freeMedium。
[0022] 优选地，在上述无血清培养基中添加BMP-2即为含BMP-2的无血清培养基。因含 BMP-2的无血清培养基是用于牙周膜干细胞的Ξ维培养，下文中将其称为Ξ维培养用无血 清培养基。本发明中优选Ξ维培养用无血清培养基含有5-15ng/mLBMP-2,即Ξ维培养用无 血清培养基组成为：2mmol/L谷胺酷胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5%血清替代物和 5-15ng/mLBMP-2,余量为叫traCULTURESerum-freeMedium。
[0023]优选地，所述的非必需氨基酸包含甘氨酸（Glycine)、k丙氨酸化-Alanine)、 心天冬酷胺（X-Asparagine)、心天冬氨酸（X-Asparticacid)、k谷氨酸（X-Glutamic Acid)、k脯氨酸（X-Proline)和心丝氨酸（Serine)各ImM。
[0024] 优选地，所述牙周膜干细胞的培养方法，包括W下步骤：
[00巧]S1、牙周膜干细胞的分离及纯化
[0026] 刮取根中1/3牙周膜组织，剪碎后用10倍体积的lg/L-5g/LI型胶原酶溶液在 37°C、200巧m条件下消化30-60min，加入等体积的完全培养基终止消化，1000-2000巧m离 屯、5-lOmin，丢弃上清，用20-40血PBS反复吹打离散细胞团块，70μm的细胞筛网过滤，滤 液1000-200化pm离屯、5-lOmin，用二维培养用无血清培养基重悬沉淀；
[0027] 按照化1-1)XlOVwell将细胞悬液接种至培养板中，每孔加入2血二维培养 用无血清培养基，混匀后于37°C、湿度95%的条件下培养，每3d换液1次，当汇合度达 80% -90 %时，用0. 125% -0. 25 %膜蛋白酶溶液消化细胞，进行传代培养；
[0028] 第1代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，调整原代细胞密度为 10-100个细胞/mU接种于培养板，用二维培养用无血清培养基于37°C、5%C〇2条件下培 养，2d-5d换液1次，待克隆长至汇合度30% -60%时，用0. 125% -0. 25%膜蛋白酶溶液消 化细胞，进行扩大培养；
[0029] S2、S维培养
[0030] 将培养至第3代的牙周膜干细胞用0. 1% -0. 25%膜蛋白酶溶液消化，吸弃膜蛋 白酶溶液，用Ξ维培养用无血清培养基重悬，70μm细胞筛过滤细胞，1000-2000rpm离屯、 5-lOmin，收集细胞沉淀，并用Ξ维培养用无血清培养基重悬细胞，W化1-1)X108个细胞/ mL的密度接种于5-15mg/血的水凝胶材料上，加入Ξ维培养用无血清培养基，在37°C、5% C〇2条件下培养6-8天，每2-3天换半液。
[0031] 骨形态发生蛋白（bonemo;rphogeneticp;rotein，BMP)是I963 年由美国的 MarshallR.化ist教授发现的。骨形态发生蛋白能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、 软骨、初带、肌腫和神经组织。它是与胚胎骨骼形成有关的蛋白质，在骨形成的数个阶段均 起作用，由形态发生的早期阶段开始，并延续至出生后。在中枢神经的发生中也起着关键作 用。近年来基因重组的骨形态发生蛋白-2度MP-2)的安全性和有效性得到了充分的证实， 美国FDA也于2002年7月批准重组骨形态发生蛋白-2用于脊柱融合。基于骨形态发生蛋 白的安全性和高效诱导成骨活性被越来越多的实验所证实，在一些国家骨形态发生蛋白已 进入大规模的临床实验阶段。
[0032] 碱性成纤维细胞生长因子化asicfibroblastgrowthfactor,bFGF)是一种能够 促进成纤维细胞生长的物质，因对酸和热敏感，等电点呈碱性巧.6)，称为碱性成纤维细胞 生长因子化FGF)。bFGF是重要的促有丝分裂因子，也是形态发生和分化的诱导因子，其生 物学效应分体内和体外两大部分。体外作用十分强烈，对成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、血 管内皮细胞、肾上腺皮质和髓质细胞、神经元和神经胶质细胞等具有很强的促细胞分裂增 殖活性。体外细胞培养中能在低浓度（Img/mL)发挥其作用。
[003引 S维细胞培养技术（t虹ee-dimensionalcellculture,TDCC)是指将具有Ξ维结 构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的Ξ维立体 空间结构中迁移、生长，构成Ξ维的细胞-载体复合物。Ξ维细胞培养技术除可W获得大 量细胞外，还解决了单层细胞培养与动物实验之间因体内和外界环境相互影响而变得复杂 化，难W研究单一过程、中间过程的问题。普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增 生逐渐丧失了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在体内进行，但由于体 内的多种因素制约W及体内和外界环境相互影响而变得复杂化，难W研究单一过程，且难 W研究中间过程。Ξ维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既 能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。
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