临床治疗级细胞治疗用毛囊干细胞细胞外基质筛选培养方法
【专利说明】临床治疗级细胞治疗用毛囊干细胞细胞外基质筛选培养方 法 -、技术领域：
[0001] 本发明属于生物干细胞技术，组织工程领域。设及一种体外构建高模拟体内贴附 环境分离筛选，毛囊干细胞的培养、扩增技术。获得毛囊干细胞应用于组织工程皮肤构建技 术中的活性种子干细胞。 二、【背景技术】：
[0002] 皮肤是人体最大的器官，参与抵御生物入侵、紫外线福射W及防止水分丢失、调节 体溫维持个体外貌等方面起着十分重要的生理作用，其是人体免疫系统组成的重要的一部 分，而皮肤细胞是构成运器官的基本单元，皮肤细胞基础研究领域是掲示皮肤健康、发育、 预防、治疗的重要科研途径。
[0003] 细胞外基质（extracellularmatrix,ECM)广泛存在于细胞间隙的基本填充成分， 是细胞新陈代谢、生长、繁殖、分化、表达、传递、互惠所依赖的极其重要场所。早期研究学者 认为.外基质只是一种组织内、细胞外的单纯的支持结构。Hauschka和Konigsberg在1966 年研究发现填充组织间隙的胶原与促进成肌细胞转化肌管的现象。并在两年之后，得W证 明学者们才对运种稳定外物质微环境有了新的认识和思考。
[0004] 化y在11年后报道了ECM对胚胎发育过程具有重要的诱导作用。ECM影响细胞行 为的现象得W关注并进行广泛的研究，但是并没有成型的理论基础佐证ECM与细胞的密切 关系。直到1982年有学者提出证明并建立ECM与细胞骨架和核基质之间"动态互惠"的模 型。在运个模中，ECM分子与细胞表面受体互相作用，然后把信号通过细胞膜传导进入细胞 浆中，引起从细胞骨架到细胞核的一系列变化，引起某些特定基因的表达。 阳0化]并证明运些基因的表达产物又可W反过来对ECM发生作用，今天的许多研究证实 了运个模型的合理性，并且证明细胞和ECM相互作用直接参与了细胞的黏附、生长、游走、 分化和程序性死（调亡）的过程；外基质参与调节细胞因子、生长因子的活性；还能够直接 激活、启动细胞内信号传导机制。由于运种对细胞的调节和对信号的传导作用。因此，我们 必须充分了解细胞外基质的化学的、物理的、生物学性质和功能及其在组织的形成和修复 中的作用，才能更好地应用运些生物材料构建成为组织接受，乃至模拟组织完善再生的"生 物构架"。我们建立的高拟细胞外基质材料利用的恰是反向理论，指导我们深入开展对ECM 的认识，同时也反作用得到我们可利用的干细胞，运种研究模式促进学科前行及发展。
[0006] 毛囊干细胞在正常皮肤组织中含量极少，分布在毛囊根翅部位根据其特有粘附性 与表面标志物特性，根据其特性密度梯度筛选、离屯、筛选技术，标记流式细胞仪筛选，异种 特异性粘附筛选等，离屯、与密度梯度筛细胞选损伤率高，获得及目标细胞纯度欠佳。规模化 耗时不宜产业化规模化的局限性。流式细胞仪制备毛囊干细胞依赖于特征性表面巧光标 记，对目标细胞具有鲜明的特异性，获得纯度高锁定目标强的特点，但经过表面议标记处理 对细胞造成标记物污染不宜适用于临床治疗级细胞的安全性，并且流式细胞仪费用高昂设 备应用复杂对设备标记物的依赖性，所获得的毛囊干细胞并无数量级优势，多局限与实验 室规模与细胞基础学研究领域。 阳007] 毛囊干细胞可牢固地定位在基底膜上，细胞培养液体系中，毛囊干细胞细胞与基 底膜成分的结合能力快速并强力粘附特性。利用毛囊干细胞粘附性强的特点可W对毛囊干 细胞进行分离纯化筛选，目前多采用异种IV胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等包被的培 养皿板粘附筛选，但会带来异种来源的生物污染因素，对于临床治疗级细胞运种方法并不 适合。
[0008] 毛囊干细胞公认是一种在体内具有无限更新能力，强大的潜在分化，且可分化形 成相应全层组织分化细胞（表皮角质细胞、黑色素细胞，附属器皮脂腺、汗腺等）体外培养 具有长期生长潜能并可形成无限克隆。是愈合修复创面，皮肤更新代谢再生的重要参与者。 但由于目前缺乏理想筛选方法，对干细胞进行筛选及鉴定方法报道较少。
[0009] W上技术背景下本发明设及一种体外构建高模拟体内贴附环境分离筛选，极具安 全性、简易性规模化、特异性的诸多优势，尤其是临床治疗级细胞的最理想筛选富集解决方 案。
[0010] Ξ、毛囊干细胞名称概述
[0011] 本发明设及的毛囊干细胞（化airFolliclestemCells,hFSCs))。毛囊干细胞 化FSCs)，毛囊干细胞存在于表皮内，毛囊干细胞是在人的毛囊外根銷隆突部中的一种多能 干性细胞。毛囊干细胞属于成体干细胞，毛囊干细胞是毛囊中的原始细胞，和其它成体干细 胞一样，毛囊干细胞分化经毛囊干细胞、短暂增殖细胞（transitamplifyingcells,TAC) 有丝分裂后分化细胞（postmitoticdifferentiatingcells,PDC)Ξ个阶段。毛囊干细胞 在光镜下呈立方形，细胞体积小，核浆比率大，表面光滑，皱權少，又被称为非银齿形细胞， 细胞体积的增大与增殖能力呈负相关。超微结构显示细胞表面有少许微绒毛，细胞核存在 许多卷曲，染色质弥散分布，运些形态特征均表现出原始细胞的特性.
[0012] 可增殖分化为表皮中各种细胞的祖细胞，研究发现，毛囊干细胞具有多向分化潜 能，它可W分化成表皮、毛囊、皮脂腺等。是由原始外胚层细胞形成。其数量较少，周围血供 良好，营养丰富、所处微环境具有优异性；在损伤或生长刺激等因素下可增殖，具有慢周期 性；在体内处于静止状态，具有未分化细胞的特征；自我更新增殖能力强；体外克隆能力突 出等优势细胞特征。创伤修复的再生重建重要愈合细胞。
[0013] 四、毛囊干细胞概述
[0014] 毛囊单位是一种复合种子细胞，包括表皮细胞、真皮细胞、汗腺、皮脂腺、毛囊干细 胞、毛囊等，有利于提高创面愈合的质量。
[0015] 毛囊干细胞的研究起步较晚，对于它的生物学认识目前才刚刚开始。但现在的基 础研究结果证实，毛囊干细胞在成体内参与皮肤的再生与修复过程.且皮肤创伤后造成的 微环境对毛囊干细胞具有一定的调控作用，运可能是由于创伤后皮肤局部因子发生改变， 促进了皮肤相关细胞的迁移分化，从而加速了创伤的修复。在表皮创伤修复中的作用长期 W来受到诸多国家的研究者的关注。研究者利用小鼠和兔进行了大量的研究。在临床上研 究者也意识到来自毛囊的角质形成细胞可促进创伤的再生。而有关毛囊干细胞在表皮创伤 后组织的修复、重建中的作用在相关相关研究中也得到了证实。结果显示各种皮肤创伤后， 毛囊干细胞可迁移至表皮。并且在新生的表皮中，至少有25%的细胞来源于毛囊干细胞。 但与预期有出入的是，在新生的表皮中，其他大多数细胞在几周后被清除，表明在表皮创伤 过程中，毛囊干细胞参与了创伤的急性修复过程，通过产生短期存在的过渡性放大细胞（ΤΑ细胞），对表皮创伤进行快速的回应。因而，有人推测干细胞与微环境之间的相互作用是其 参与修复的生理基础，在大面积皮肤损伤修复研究领域和脱发等疾病领域成为热口研究热 点。
[0016] 在毛囊干细胞信号调控中设及到许多的调控信号，主要包括WNT信号、BMP信号和 NFATcl等基因的作用。 阳017] WNT信号通路在调节毛囊干细胞增殖和命运决定中起重要作用，它在毛囊循环的 过程中呈一种动态变化，在生长期活性最高。研究均证明WNT信号在毛囊形态发生的调节 中和皮肤重建的过程中通过帮助HF世系和与上皮细胞命运有关的祖细胞分化而起作用。
[0018] 骨形成蛋白信号度Μ巧也在毛囊形态发生、出生后的重建和通过调节毛发基质前 体细胞的分化和增殖来控制毛囊循环中起到重要作用。通过异位表达ΒΜΡ4或特定的缺 失BMP括抗者noggin而增强的BMP信号将导致毛囊生长延迟和越来越严重的光秀。表达 noggin将诱导毛囊向生长期的过渡，并且破坏毛干的分化。
[0019] WNT信号与BMP信号是一种相互依赖并相互括抗的关系。在毛发生长期早期，WNT 信号的表达使毛囊干细胞发生增殖和分化，从而引起表皮相关成分的形成；但是此阶段过 后，BMP信号中的转录因子表达量升高，抑制正在进行增殖分化的干细胞，从而维持干细胞 巢中的干细胞数量。
[0020] 另外，NFATcl基因在毛囊信号调控中也有着重要的作用。 阳02U 总么影响毛囊干细胞增殖、分化的信号通路主要有丽1、BMP、notch等。在体外培 养状态下，BMP可使毛囊bulge干细胞从细胞周期的进程中退出，进而抑制其增殖。
[0022] 毛囊干细胞存在与毛囊外根銷隆突部中（毛乳头及毛囊真皮銷中）的一种多能性 干细胞。也有研究者关注毛囊干细胞具有很高的增殖潜能，在体外培养时呈克隆性生长，并 体外诱导分化为神经元细胞，神经胶质细胞，平滑肌细胞和黑色素细胞等细胞，而植入体内 则可分化形成神经元、黑色素细胞和角化细胞等。
[0023] 由于毛囊干细胞能进行多向分化，从而它在自体干细胞基因治疗方面有广阔的基 础及临床研究前景。
[0024] 五、毛囊干细胞的分离及鉴别
[00巧]人们利用成人枕、颠部的全层头皮，用显微切割方法分离出人毛囊bulge区，对分 离的细胞进行CD200免疫巧光标记后，用磁珠分选的方法获得了高纯度的人毛囊干细胞。 Kloepper等发现WCD200、K19作为阳性标记物，CD34、nestin为阴性标记物，可W更好地 鉴定人毛囊干细胞，提示在利用于细胞标记物进行毛囊干细胞分离时，将阳性标记物与阴 性标记物加W组合，分离的效果更为有效及实用。
[0026] 有人应用CD200、frizzled受体、CD34、CD71、CD146等一系列阳性及阴性标记物， 对人毛囊bulge区进行免疫巧光标记后，为了最大数量地获得毛囊bulge干细胞，他们又对 毛囊bulge区进行了不同于传统的横向切片，然后用激光显微切割法分离切片中的bulge 区，得到了数量众多的、标记物表达特征为CD200、CD24、CD34、CD71、CD146、具有高克隆形成 率及多向分化潜能的人毛囊干细胞。
[0027] 对毛囊干细胞多采用贴壁筛选的方法进行分离，同时利用运一方法并结合相对特 异标识分子、增殖活性、分化潜能等几方面对毛囊干细胞加W鉴定。
[0028] 目前常根据特异性表面分子标识物和无限更新分化能力有无的特点来鉴别干细 胞。现在对毛囊干细胞的研究并未发现特异的表面标识物，从mRNA和蛋白两个水平上对 获得的毛囊干细胞进行检测，CK15阴性和整合素〇6的阳性表达情况，β1 -整合素标志物 (角蛋白）Κ19阳性表达，
[0029] 六、传统筛分方法介绍
[0030] 因为毛囊干细胞对基底膜有较强的粘附性，对细胞胞外基质的粘附速度要比其它 类型细胞快得多，所W利用该种特性进行培养筛选。目前传统的皮肤细胞筛选如下阐述：
[0031] 方法一（3Τ3滋养层法）：人类皮肤细胞体外培养研究已有一个世纪的历史背景， 建立体外扩增培养体系于1