一种大菱鲆肝脏组织细胞体外构建方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞培养技术领域，具体设及一种大菱解肝脏组织细胞的体外构建方 法及其在鱼类营养代谢的分子细胞生物学研究中的应用。
【背景技术】
[0002] 大菱解作为一种肉食性鱼类，在人工养殖过程中，其饲料中需要添加鱼油。随着水 产饲料工业的迅猛发展，鱼油短缺的问题日益突出。植物油W其稳定的供应量、较高的多不 饱和脂肪酸含量和相对低廉的价格成为较理想的替代脂肪源，但植物油替代鱼油的比例过 高会影响鱼体的健康和品质。近年来在植物油替代鱼油的研究上已有了一定进展，但在大 菱解饲料中还未能实现W植物油完全替代鱼油而不影响其代谢和健康。
[0003] 为进一步阐释植物油替代鱼油影响大菱解代谢和免疫的分子机理，亟需构建大菱 解肝脏细胞体外模型。之前虽有大菱解肝脏组织细胞原代培养的报道，但存在重复性差、细 胞迁出和生长缓慢的缺点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是构建一种大菱解肝脏组织细胞体外构建方法，并将其应用于鱼类 营养代谢的分子细胞生物学研究中，从而弥补现有技术的不足。
[0005] 本发明首先提供一种细胞培养基，是添加有20%的胎牛血清、0.5%补体灭活的 花食卢血清、10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子化FGF)、10μg/L表皮样生长因子巧GF)、 Immol/L丙酬酸钢、2mmol/L的k丙氨酷谷氨酷胺的kl5培养基。
[0006] 所述的补体灭活的花驴血清，是对花驴静脉取血后，将血液经56°C水浴30min后， 再经0. 22μm过滤除菌制成的；
[0007] 上述的细胞培养基中还添加有抗生素，作为实施例的优选，为100000IU/L青霉素 和lOOmg/L链霉素。
[0008] 本发明提供的细胞培养基用于体外培养大菱解肝脏组织细胞；
[0009] 本发明一方面设及一种大菱解肝脏组织原代培养细胞的分离和培养方法，具体是 利用II型胶原酶消化液处理剪碎的大菱解肝脏组织小块获得解离的大菱解肝脏组织小块， 然后将解离的大菱解肝脏组织小块接种到细胞培养瓶中，用上述的细胞培养基培养形成细 胞单层。
[0010] 上述II型胶原酶消化液的配制方法：是将II型胶原酶溶解于汉克斯平衡盐溶液 化BSS)中制备的；作为实施例的优选，其中II型胶原酶质量分数为0. 1 %的溶液。
[0011] 上述的细胞培养瓶进行预处理，具体是吸取纤连蛋白溶液加入到细胞培养瓶中， 均匀浸润瓶底，然后吸除多余纤连蛋白溶液，用PBS冲洗后，再用上述的细胞培养基冲洗， 备用。
[0012] 上述纤连蛋白溶液是将纤连蛋白溶解于皿SS中制备的。
[0013]本发明培养的大菱解肝脏组织细胞在鱼类营养代谢的分子细胞生物学研究上的 应用。将报告基因表达质粒（如PIRES2-eGF巧转染到体外培养大菱解肝脏组织细胞中，可 观察到绿色巧光蛋白在细胞中的成功表达，证明所构建的大菱解肝脏组织细胞体外模型可 用于鱼类营养代谢的分子细胞生物学研究。
[0014] 本发明优化了培养基的配方，添加了花驴血清、丙酬酸钢和k丙氨酷谷氨酷 胺，为细胞的迅速、大量迁出提供了更为全面、充足的营养；调整了II型胶原酶的配制方法、 浓度和酶解时间，既减小了胶原酶对肝脏组织细胞的损伤，同时又充分酶解肝脏组织小块， 促进肝脏细胞的迁出。本发明所设及的大菱解肝脏组织细胞体外模型的构建方法，具有简 便易行、重复性好、成本低和细胞生长迅速的优点。而且，本发明所提供的大菱解肝脏组织 原代培养细胞可成功用于报告基因如绿色巧光蛋白基因的脂质体转染，表明该体外细胞模 型可用于鱼类营养代谢的分子细胞生物学研究。
【附图说明】
[0015] 图1:原代培养48小时、72小时、120小时和7天大菱解肝脏组织原代培养细胞的 光镜照片，比例尺=lOOym;
[0016] 图2 :报告质粒PIRES2-eGFP转染大菱解肝脏组织原代培养细胞的巧光显微镜照 片，比例尺=100ym;
【具体实施方式】
[0017] 目前，鱼类肝脏细胞原代培养主要采用组织块和膜酶消化的方法进行，但实验发 现，组织块法中的大菱解肝脏组织，细胞难W迁出，而0. 25 %膜酶酶解法中细胞成活率较 低。较高浓度和较长作用时间的胶原酶处理，也会损伤大菱解肝脏组织细胞。为更好地满 足实验要求，本发明调整了大菱解肝脏组织细胞原代培养完全培养基的配方，优化了II型 胶原酶的配制方法、浓度和酶解时间。为更好地解释本发明，W下结合实例进一步阐释本发 明的主要内容：
[0018] 实施例1 一种大菱解肝脏组织细胞原代培养方法。
[0019] 步骤如下：
[0020] (1)培养基的制备，其步骤如下：
[0021] kl5液体培养基购于Sigma公司，100X青链霉素溶液和100X丙酬酸钢溶液购 于索莱宝公司，胎牛血清购于Gibco公司，k丙氨酷谷氨酷胺购于Life公司，生长因 子购于化protech公司；
[0022] 花驴血清的制备方法：2kg左右花驴尾静脉取血，56°C水浴30min后经0. 22μm滤 器过滤除菌制成；
[002引生长因子bFGF和EGF溶液的制备：分别溶解于0. 1 %牛血清白蛋白溶液中，制成lOmg/ml的母液，分装后-20°C保存。
[0024] 基础培养基制备：每100mlkl5液体培养基中，加入100X青链霉素溶液1ml，用 高压灭菌过的1M氨氧化钢溶液调节抑到7. 4。
[00巧]完全培养基制备：将占完全培养基总体积20%的胎牛血清、0. 5%补体灭活花食卢 血清W及终浓度为10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10μg/L表皮样生长因子、Immol/L 丙酬酸钢及2mmol/Lk丙氨酷A-谷氨酷胺加入到基础培养基中，抽滤除菌，制成大菱解 肝脏组织细胞完全培养基。
[0026] (2)细胞培养瓶的纤连蛋白包被处理，具体步骤：吸取1ml25μg/ml纤连蛋白溶 液，加入到T25细胞培养瓶中，均匀浸润瓶底，45min后吸除多余纤连蛋白溶液，备用。
[0027] 上述25μg/ml纤连蛋白溶液的配制方法为：将Img纤连蛋白溶解于40ml皿SS中。
[0028] (3)原代培养具体步骤包括：
[0029] ①实验鱼的选取：选取体重约为lOg的健康大菱解幼鱼；
[0030] ②实验鱼的暂养：用含lOOOIU/ml青霉素和lOOOIU/ml链霉素的无菌海水暂养实 验鱼10小时；
[0031] ③肝脏组织分离：
[0032] 将实验鱼用抄网拱出，在灭菌培养皿中用舰伏（1% )擦拭Ξ次，后转移至超净台 中再用70%酒精擦拭Ξ次；在灭菌纱布上用解剖工具解剖试验鱼并无菌分离肝脏组织；注 意，解剖鱼体外表及内脏的解剖工具不能混用，W减少染菌几率。
[0033] ④肝脏组织的清洗：