一种适合昆虫细胞生长的无血清无动物源培养基添加物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物制药技术领域，具体设及一种适合对昆虫细胞主要包括S巧和 化曲Five细胞）的无血清无动物源培养的添加物的研制。
【背景技术】
[0002] 目前，常用的昆虫细胞有Sf-9细胞，即：Spodopterafrugiperda(草地贪夜蛾）细 胞和Hi曲Five细胞，Hi曲Five细胞度TI-TN-5B1-4)是来自于粉纹夜蛾灯richopulsia ni)亲本细胞系的克隆分离株，常用于杆状病毒表达载体系统度EV巧的重组蛋白表达。杆 状病毒表达系统化aculovirusexpressionsystem)是近年来应用较多的真核表达系统， 它可W在昆虫细胞中表达多种外源基因，包括真菌，植物，细菌，病毒的基因。杆状病毒是 一类W昆虫细胞为天然宿主的双链DNA病毒，具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物，对 人、畜无害。目前研究较多的是首猜银纹夜蛾核多角体病毒（AcNPV)，其宿主是草地贪夜蛾。 而Sf-9细胞和化曲Five细胞，是杆状病毒表达系统的宿主细胞。在应用于蛋白的表达与 制备纯化中，有着许多的优点，包括：表达的重组蛋白能正确折叠，并形成二硫键；翻译后 可进行修饰加工如糖基化、憐酸化、酷胺化及信号肤切割等，使重组蛋白在结构和功能上更 接近天然蛋白；与其他真核表达系统相比，杆状病毒表达系统可W高效表达外源基因，表达 量最高可达被感染昆虫细胞总蛋白量的50% ;可W容纳大片段外源基因。
[0003] 目前，国内的生产工艺多采用Grace培养基或者IPk41培养基添加5-10 %的小牛 血清培养，或者用商业化无血清培养基如SF90〇n再添加适当血清培养。很多商品号称是 无血清培养基，但是，很难做到完全脱离血清培养。另外，由于目前国内血清供应日益紧张 伴随着价格不断走高，对国内生物抗体生产企业产生了明显的限制。此外，从生产的角度来 讲，血清中含有大量成分复杂的蛋白质，运极不利于疫苗、类病毒颗粒、细胞因子和单克隆 抗体等生物制品的下游纯化分离，同时血清所含的化学成分不确定，血清也存在批次稳定 性问题，而且还容易引起细菌、真菌、病毒和支原体污染。因此，尽量不用或少用血清成为昆 虫细胞培养的趋势，现有技术常通过添加牛血清白蛋白、转铁蛋白、膜岛素等动物源成分， 来降低血清的添加量，但是动物源成分的蛋白质对生物制品（如疫苗）的安全性有很大影 响，所W迫切需要一种能代替血清功能的细胞培养添加物。既能够使细胞快速生长，保持较 高的活力，又减少了污染的可能，提高细胞产品的稳定性，同时减少动物来源的蛋白组分含 量，利于后期纯化工艺，降低生产成本。
[0004] 目前，商业化的昆虫培养基有Grace培养基、I化-41培养基、TC100培养基，运 些培养基都是结合血清使用的经典的培养基，也有商业化的无血清培养基如：SF900II， SF900III，ExpressFi\c'SFM，EX-CEI丄等系列产品，运些产品价格高且配方保密，且很 难完全去除血清培养，不能持续的维持细胞的活力，或者是成本较高，很少有针对于昆虫细 胞，研发出替代血清的添加物。本发明基于上述的产品现状，开发了适合昆虫细胞悬浮生长 的代替血清的细胞添加物，在培养昆虫细胞的过程当中，能起到代替血清的功能，并且价格 低廉。W传统培养基Grace或者是IPk41作为基础，添加有利于昆虫细胞生长的添加物， 昆虫细胞能够获得24化的连续生长，细胞活力能保持在95%W上。
【发明内容】
阳0化]本发明目的在于，克服现有技术中的缺陷，提供一种适合昆虫细胞悬浮生长的无 血清培养基，培养基研制过程中，用一些具有特殊功能的化合物、脂类成分、酵母和植物水 解物、微量元素和维生素代替了培养基中常规添加的动物源成分，在降低血清使用成本的 同时，减小了培养基中血清和动物源蛋白携带外源病原菌污染的机率，同时培养基中的蛋 白含量大幅减少，十分有利于后期纯化工艺，提高细胞产品的稳定性。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：提供一种适合昆虫细胞瓶培养 的无血清培养基，其特征在于，在常规Grace或者是IPk41培养基的基础上，添加了氨基 酸、脂类、微量元素和水解物成分，用W替代血清的功能，用于无血清的添加量，添加成分如 下：
[0007] 葡萄糖 3-15g/l， 阳00引 k精氨酸2-9mM,
[0009] k天冬酷胺
[0010] k甘氨酸 5-14mM, W11] k组氨酸 2. 77mM, 阳〇1引心异亮氨酸8.41mM, 阳01引 k亮氨酸5-llmM,
[0014] k赖氨酸 4-9mM, 阳〇1引 k蛋氨酸0. 1-0. 7mM,
[0016] k苏氨酸
[0017] k色氨酸 0. 2-1. 4mM, 阳0化]心结氨酸，2-5mM
[0019] k脯氨酸 7-lOmM,
[0020] 棉巧水解物 300-3000mg/l，
[0021] 大米水解物 300-3000mg/l,
[0022] 麦教水解物 300-3000mg/l，
[0023] 重组膜岛素2-25mg/l，
[0024] 丙酬酸钢 50-300mg/l, 阳0巧]亚砸酸钢0.0010. 04mg/l, 阳0%] 巧樣酸铁0. 05-lmg/l，
[0027] 亚油酸 0. 1-0. 3mg/l，
[0028] 大豆卵憐脂 10-65mg/l,
[0029] 胆固醇 5-25mg/l，
[0030] 环庚Ξ締酪酬 0.l-6mg/l，
[0031] F-68 100-600mg/l,
[0032] 还原型谷脫甘肤0. 04-0. 5mg/l，
[0033] 心谷氨酷胺3-15g/L。
[0034] 其中，F-68是pluronicF-68的简称，在细胞培养过程中的常用添加物，对细胞具 有保护作用。
[0035] 关于"棉巧水解物"、"麦教水解物及"大米水解物"在本领域中有公认的含义， 就是将棉巧，麦教，大米，经过特殊的工艺，包括酶消化、酸处理等手段进行处理后，提取适 合细胞生长组分，目前均有商品化试剂，本发明具体使用的是Difico公司生产的水解物。
[0036] Grace和IPk41，是成分公开的培养基，目前均有商品化试剂，本发明具体使用的 是LifeTechnology公司生产的基础培养基。
[0037] 本发明研制的无血清培养基添加物，不仅降低了培养基成本而且还大幅减少了培 养基中动物源蛋白的含量，简化了无血清培养基研发的过程，更有利于细胞下游产品的分 离和纯化。
[0038] 为实现上述发明目的，本发明采用的另一个技术方案是适合昆虫细胞瓶培养的无 血清培养基的配置方法，其特征在于，所述配制方法包括如下工艺步骤：
[0039] S1 :在容器中加注射用水至总体积的90%，将一袋Grace或者是IPk41培养基全 部倒入容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下并入容器，轻微揽拌溶解；
[0040] S2 :将上述组分依次加入到溶液中，轻微揽拌溶解；
[0041] S3 :轻微揽拌至完全溶解，加注射用水至总体积的100% ; 柳创 S4 :用Imol/L氨氧化钢溶液或Imol/L盐酸溶液调抑至6. 2 ;
[0043] S5 :用0. 2μm滤膜正压过滤除菌； W44] S6 :溶液配制完成后应在2°C~8°C下密闭避光保存。
[0045] 其中优选的技术方案是，所述S1步骤中注射用水的水溫为30°C。
[0046] 本发明的优点及有益效果是，该培养基通过氨基酸、脂类、微量元素、水解物等的 添加，代替了血清的功能。相比较传统的IPk41+10%FBSW及Grace+10%FBS，更能促进 细胞快速生长，增加细胞密度，缩短倍增时间，提高细胞活力，说明该发明培养基更适合于 昆虫细胞细胞的无血清悬浮培养。
【附图说明】
[0047] 图1 :Sf9细胞在Grace+SM中生长曲线（左栏）与