一株产抗菌蛋白基因工程菌株与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，涉及一株产抗菌蛋白基因及工程菌株与应用。
【背景技术】
[0002]随着可持续农业的不断发展以及化学农药抗性和污染问题的日益严重，微生物农药成为植物病害防治的重要手段。目前，广泛应用的微生物农药以活菌制剂为主，应用中存在储藏期短和防效不稳定现象。研究发现一些生防菌能够产生抗菌蛋白，但因产量低和稳定性差难以产业化。近年来，随着分子生物学与生物技术的不断发展，微生物农药的研发由活菌制剂向重组微生物农药方向发展。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一株含有抗菌蛋白基因工程菌株与应用，该基因工程菌株具有抗菌蛋白诱导时间短，表达率、纯化后产量和回收率高以及能够抑制大豆根腐病菌和水稻恶苗病菌生长的特性。
[0004]生防菌株TF28具有广谱抑菌活性，能够产生多种抗菌蛋白，从TF28菌株发酵液中可以分离纯化出一种分子量较小的抗菌蛋白API (10KD)，经N端测序得到N端氨基酸序列，在对该菌株进行基因组测序之后，发现了该抗菌蛋白的基因序列。因此，本发明采用人工合成方法合成该抗菌蛋白基因，连接到表达载体pET32a(+)上，转化E.coli BL21菌株中，获得一株高表达抗菌蛋白的基因工程菌株(pET32a(+)-Apl-BL21)，其为含抗菌蛋白的大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌wswJW_86，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.11542，保藏日期为2015年10月21日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号。
[0005]上述高表达基因工程菌株(pET32a(+)-Apl_BL21)的构建方法如下:
[0006]将抗菌蛋白API基因和质粒pET32a (+)分别用BamH I和XhoI I双酶切，用T4DNA连接酶连接后转化E.coli BL21感受态细胞中，获得带有抗菌蛋白基因的工程菌株(pET32a(+)-Apl-BL21)。
[0007]本发明的基因工程菌株含有抗菌蛋白基因，在30°C诱导时间短，表达率高(43.2% )，纯化蛋白产量高(124.82mg/L)，回收率高(92%)，经ITPG诱导、HIS柱纯化和肠激酶酶切后的蛋白对植物病原菌(大豆根腐病菌Fusarium oxysporum、水稻恶苗病菌Fusarium moniIiforme)有很好的抑制作用，抑制率达80%以上，该菌株为重组蛋白农药的研发提供了新型的菌株资源。
[0008]保藏信息:
[0009]分类命名:大肠杆菌(Escherichiacoli)；
[0010]保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
[0011]保藏编号:CGMCCN0.11542 ；
[0012]保藏日期:2015年10月21日；
[0013]保藏地址:北京市朝阳区北辰路I号院3号。
【附图说明】
[0014]图1为表达载体pET32a(+)-Apl酶切后的电泳图，图中:1为D2000 DNAMarker (MD121221)，2 为 pET32a_APl 质粒 DNA，3 为 pET32a_APl 质粒 DNA 双酶切；
[0015]图2基因工程菌株诱导表达后的SDS-PAGE电泳图，图中:1为工程菌30 °C诱导2h的电泳图，2为E.coli BL21菌株，3为蛋白质分子量标准(Lot#26616 ThermoScientific)，箭头指向为表达蛋白；
[0016]图3为菌体裂解、纯化及肠激酶酶切后的SDS-PAGE电泳图，图中:I为肠激酶酶切纯化后的重组蛋白，2为HIS柱纯化后的重组蛋白，3为超声裂解后的总蛋白，4为E.coliBL21 菌株，5 为蛋白质分子量标准(Lot#26616 Thermo Scientific)；
[0017]图4为肠激酶酶切后的重组蛋白对大?根腐病囷的抑制结果，图中:1为吸收1uL抗菌蛋白的滤纸片，2为吸收20uL抗菌蛋白的滤纸片，3为吸收1uL无菌水的滤纸片，4为吸收20uL无菌水的滤纸片；
[0018]图5为肠激酶酶切后的重组蛋白对水稻恶苗病菌的抑菌效果图，图中:1为吸收1uL抗菌蛋白的滤纸片，2为吸收20uL抗菌蛋白的滤纸片，3为吸收1uL无菌水的滤纸片，4为吸收20uL无菌水的滤纸片。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0020]本发明提供了一株产抗菌蛋白基因工程菌株，包括以下内容:
[0021]—、抗菌蛋白基因合成及基因工程菌株的构建
[0022]依据菌株基因组序列人工合成抗菌蛋白基因，在基因5’端加上BamH I酶切位点，在3’端加上Xhol I酶切位点，合成的抗菌蛋白APl基因序列见SEQ ID N0.1。因该抗菌蛋白较小，为了提高基因表达率，选pET32a(+)作为表达载体。将人工合成的抗菌蛋白APl基因和质粒pET32a(+)分别用BamH I和XholI双酶切，用T4DNA连接酶连接后转化E.coliBL21感受态细胞中，获得带有抗菌蛋白基因的工程菌株(pET32a(+)-Apl-BL21)。
[0023]具体方法:
[0024]酶切:目的基因和质粒DNA分别用BamH I和Xho 11双酶切。
[0025]取目的基因(5yg)或pET32a 质粒 DNA(1 yg)，加入 lOXTango? buffer (I μ I),BamH I (I μ I)，去离子水补足 10 μ 1，37°C酶切 3h 后，再加入 lOXTango? buffer (2 μ I),XholI (I μ I)，去离子水7 μ 1，37°C酶切3h，双酶切后的基因和质粒用胶回收试剂盒纯化，4 °C冰箱保存备用。
[0026]连接:取酶切后的基因40ng，质粒DNA 10ng, 10X连接buffer (I μ I)，T4DNA连接酶I μ I，用去离子水补足至?ο μ 1，20°C连接2h。
[0027]转化:10 μ I连接液加到100 μ L BL21感受态细胞，轻弹混匀，冰浴30min后置于42°C恒温90s，冰浴中放置3min，加入250 μ L 37°C预热的LB培养基，37°C，150r/min震荡培养45min。取菌液100 μ L涂布含100 μ g/mL的氨苄青霉素，240 μ g/mL IPTG和400 μ g/mL X-gal的LB固体琼脂培养基上，37°C培养16h。
[0028]二、工程菌筛选鉴定
[0029]挑取白色菌落接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C震荡培养18h，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用BamH I和Xhol I双酶切质粒DNA进行鉴定，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，结果表明在321bp处有一条DNA片断，说明已获得含抗菌蛋白基因的工程菌株。
[0030]三、抗菌蛋白基因的表达
[0031]菌株活化后，按I %接种量转接于含100 μ g/mL氨苄青霉素的10mL LB培养基中，30°C，160r/m振荡培养，待OD600为0.8?1.0时，加入IPTG至终浓度为0.lmmol/L，30°C、160r/m的条件下诱导表达2h，以E.coli BL21菌株作对照。取1.0mL培养液置于1.5mL无菌离心管中离心2min，用20 μ L无菌水悬浮菌体，加入5X蛋白上样缓冲液(碧云天生物技术有限公司，商品编号:P0015)，100°C煮5min，离心收集上清液，进行SDS-PAGE电泳(10%分离胶和5%浓缩胶)，上样量为5 μ L，SOv电泳至样品接近分离胶后，调节电压为10v继续进行电泳，直至溴酚蓝到达分离胶底部，用卡马斯亮蓝染色1.5h，用脱色液脱色，结果如图2所示，在27KDa处有一条明显蛋白带。
[0032]四、抗菌蛋白的分离纯化及抑菌活性测定
[0033]I)抗菌蛋白的分离纯化
[0034]取450mL诱