一种改良的pk-15细胞传代培养方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞培养工程技术领域，具体设及一种改良的ΡΚ-15细胞传代方法及 其应用。
【背景技术】
[0002] ΡΚ-15细胞由猪肾细胞驯化而来的传代细胞系，可用于多种动物病毒的培养，猪细 小病毒、猪圆环病毒2型、猪攝病毒、猪伪狂犬病病毒等。目前，ΡΚ-15细胞最大的应用即用 于猪圆环病毒2型培养，灭活后制备疫苗。
[0003] 研究发现，ΡΚ-15培养时，尤其大规模培养时，容易聚团，导致细胞生长不均匀，且 猪圆环病毒2型培养时大多采用同步方式接种，即将细胞消化分散的细胞分装后直接接种 猪圆环病毒2型病毒悬液，然后共同培养，同步接种方式较分步接种产毒量高，更适合于大 生产，但同步接种更容易导致细胞聚团，从而影响细胞的生产及病毒的增殖效率。培养操作 过程中发现，细胞传代时产生的泡沫是导致细胞聚团的主要原因，尤其利用滚瓶大规模培 养细胞时，泡沫粘附于瓶壁，培养时，细胞不断聚集于此，最终成团。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种能减少细胞聚团，细胞分 散均匀，生产效率高的改良的ΡΚ-15细胞传代培养方法。
[0005] 本发明的另一目的在于将上述改良的ΡΚ-15细胞传代培养方法应用于猪圆环病 毒2型的繁殖中。
[0006] 本发明的第一个目的可W通过采取如下技术方案达到：
[0007] 根据本发明所提供的一种改良的ΡΚ-15细胞传代培养方法，包括W下步骤：
[0008] 1)将ΡΚ-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体积达到滚瓶体积 的10%，ΡΚ-15细胞在培养液中的浓度为1-5Χ104个/mU所述培养液含lOwt%胎牛血清、 Iwt%青链霉素；
[0009] 2)加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0. 5-3. 0μL/200血，混匀后于 37 °C、6rA转瓶机中培养，至融合状态达到80%W上。
[0010] 本发明中，所述步骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁的PK-15细 胞按照如下方法获得：将在液氮中冻存的PK-15细胞复苏后，用含lOwt%胎牛血清、Iwt% 青链霉素的DMEM生长液悬浮，置于37°C、5%C〇2的培养箱中培养，形成100%融合状态的 细胞单层，用含膜蛋白酶的消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15细胞。
[0011] 其中，PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42°C水浴中快速解冻，然后 lOOOrpm离屯、5min。
[00。] 本发明中，所述消泡剂购买于Sigma公司，其型号为Antifoam204 (A8311)。优选 地，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为1. 5-3. 0μL/200mL。
[0013] 本发明的另一个目的可W通过采取如下技术方案达到：
[0014] 一种改良的ΡΚ-15细胞传代培养方法的应用，包括W下步骤：
[0015] 1)将PK-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体积达到滚瓶体积 的10%，ΡΚ-15细胞在培养液中的浓度为1-5X104个/mU所述培养液含lOwt%胎牛血清、 Iwt%青链霉素；
[0016] 。加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0. 5-3. 0μL/200血；按滚瓶内培养 液体积的5%接种猪圆环病毒2型病毒悬液，混匀后于37°C、6r/h转瓶机培养24h;
[0017] 扣弃去培养液，用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min后，弃去液体，加含2wt% 胎牛血清的DMEM培养液，继续培养72h，冻融收获病毒液。
[0018] 其中，步骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁的PK-15细胞按照 如下方法获得：将在液氮中冻存的PK-15细胞复苏后，用含lOwt%胎牛血清、Iwt%青链霉 素的DMEM生长液悬浮，置于37°C、5%C〇2的培养箱中培养，形成100%融合状态的细胞单 层，用含膜蛋白酶的消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15细胞。
[0019] 其中，所述PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42°C水浴中快速解冻，然 后 1000;rpm离屯、5min。
[0020] 优选地，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为1. 5-3. 0μL/200mL。
[0021] 本发明所提供的技术方案可W包括W下技术效果： 阳0巧 （1)在PK-15细胞传代培养过程中，加入消泡剂，消泡剂能有效消除细胞传代操作 过程中产生的泡沫，使细胞生长状态保持良好，且能有效减少细胞聚团。
[0023] (2)采用改良的PK-15细胞传代培养方法培养细胞后，有效消除细胞传代操作过 程中产生的泡沫，有利于猪圆环病毒2型（JM株）的增殖。
【附图说明】
[0024] 图1为PK-15细胞扩繁培养后的状态图； 阳0巧]图2为未使用消泡剂处理在滚瓶（2000ml)培养的PK-15细胞状态图（肉眼观 察）； 阳0%] 图3为未使用消泡剂处理在滚瓶（2000ml)培养的PK-15细胞状态图（显微镜观 察）；
[0027] 图4为使用消泡剂（浓度：3μL/200血）处理后在滚瓶（2000ml)培养的PK-15细 胞状态图（肉眼观察）；
[0028] 图5为使用消泡剂（浓度：3μL/200血）处理后在滚瓶（2000ml)培养的PK-15细 胞状态图（显微镜观察）。
[0029] 此处的附图并列入说明书并构成说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例， 并与说明书一起用于解释本发明的原理。
【具体实施方式】
[0030] 下面，结合附图W及【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0031] 1.试剂与材料 阳0扣]细胞：PK-15细胞（肇庆大华农生物药品有限公司保存）；
[003引病毒：猪圆环病毒2型（JM株），由肇庆大华农生物药品有限公司保存；
[0034] 培养基与血清：DMEM培养基（Gibco公司），血清（Hyclone公司）；
[0035] 消泡剂：型号Antifoam204 (A8311)，购买于Sigma公司；
[0036] 其它试剂：青链霉素（广州美津生物技术有限公司），膜蛋白酶（Gibco公司），猪 圆环病毒2型多克隆抗体（VMRD公司），FITC标记的羊抗猪二抗脚L公司）。
[0037] 2、PK-15细胞传代培养方法的改良 阳03引 2. 1改良方法具体操作步骤
[0039] 2. 2. 1PK-15 细胞的扩繁 W40] 从液氮中取出冻存的PK-15细胞，于42°C水浴中快速解冻，100化pm离屯、5min，用 含lOwt%胎牛血清、Iwt%青链霉素的DMEM生长液悬浮，置37°C、5%C〇2的培养箱中，培养 至融合状态为100%的细胞单层，用含膜蛋白酶的消化液分散后分装扩大培养。
[0041] 2. 2. 2消泡剂工作浓度确定
[0042] 2. 2. 2. 1在2000血滚瓶中培养PK-15细胞
[0043] 将2. 2. 1中扩大培养的细胞用含膜蛋白酶的消化液分散后，分装至7个2000ml 的滚瓶中，然后添加培养液至200ml，细胞浓度为5ΧΙΟ4个/mU其中培养液含lOwt%胎 牛血清和Iwt%青链霉素。接着，分别往其中6个滚瓶中加入消泡剂，消泡剂在6个滚瓶 中的浓度分别为 0. 5μL/200mL1μL/200mL1. 5μL/200mL2μL/200mL2. 5μL/200mL 3μL/200mU另外一个滚瓶作为对照例，不添加消泡剂；加入消泡剂的6个滚瓶混匀后，把7 个滚瓶置于37°C、6r/h滚瓶机中培养，培养至融合状态到达80%W上。分别用肉眼和在显 微镜下观察细胞聚集状态。如此重复Ξ次，W确定消泡剂的最佳浓度。
[0044] 2. 2. 2. 2在15000血滚瓶中培养PK-15细胞
[0045] 将2. 2. 1中扩大培养的细胞用含膜蛋白酶的消化液分散后，分装至7个15000mL 滚瓶中，然后添加培养液至15000ml，细胞浓度为1X104个/mU其中培养液含lOwt%胎 牛血清和Iwt%青链霉素。接着，分别往其中6个滚瓶中加入消泡剂，消泡剂在6个滚瓶 中的浓度分别为 0. 5μL/200mL1μL/200mL1. 5μL/200mL2μL/200mL2. 5μL/200mL 3μL/200mL，另外一个作为对照例，不添加消泡剂，加入消泡剂的6个滚瓶混匀后，把7个滚 瓶置于37°C、化A滚瓶机中培养，培养至融合状态到达80%W上。分别用肉眼和在显微镜 下观察细胞聚集状态。如此重复Ξ次，W确定消泡剂的最佳浓度。
[0046] 2. 2结果与讨论
[0047] 如图1所示，为PK-15细胞扩繁培养后的状态图。从图中可得，从液氮中复苏的 PK-15细胞生长良好，在处于静止状态的方瓶中传代培养，PK-15细胞出现部分聚集现象。