一种检测原代神经干细胞迁移极化的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及神经科学技术领域，具体地说，是一种检测原代神经干细胞迀移极化的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]神经干细胞(Neural stem cell，NSCs)是一种未分化、多潜能、具有自我更新能力的神经前体细胞，可进一步分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。此外，NSCs经过多次细胞分裂后，仍能稳定地保持自身的特性。Sally Temple于1989年首次发现，在小鼠室管膜下区(subventricular zone, SVZ)存在自我更新能力和多向潜能的细胞。1992年，Reynolds B.A.首次从成年小鼠的中枢神经系统中分离出NSCs，并引起人们的广泛关注。NSCs存在于动物脑内的很多部位，包括哺乳动物胚胎期的大脑皮质、海马、嗅球、纹状体等处，另外，在成年哺乳动物中枢神经系统(Central nervous system, CNS)海马齿状回(dentate gyrus, DG)的颗粒下层中也分离出NSCs。
[0003]细胞迀移，是细胞在接收到迀移信号后，通过一系列黏附与去黏附过程，在基质表面产生的整体位移，是一种重要的细胞运动现象。根据迀移的方式可分为无规律的自由迀移(free/random migrat1n)和定向迁移(direct1nal migrat1n)。近年的研究表明，不仅在哺乳动物的胚胎发育过程中，而且在神经系统疾病状态下NSCs都存在有序的定向迀移能力。在胚胎期中，神经上皮细胞不断向大脑皮层迀移，进一步分化为神经元，并形成大脑的基本神经构成。新生动物的海马和侧脑室中的NSCs不断迀移并分化新的神经元，维持海马和嗅球的神经功能；成年动物的NSCs处于相对静息的状态，仅在中枢神经系统损伤、缺血等病理因素的作用下才被激活和迀移到受损部位发挥其功能。NSCs的定向迀移不仅对机体神经系统的发生发育具有至关重要的作用，对于中枢神经系统的损伤修复也有重大的意义。有研究表明，中枢神经系统发生病理改变后，NSCs会特异性地迀移到损伤部位并可分化并替代缺失的细胞，与其它的神经元建立通路，从而使受损脑组织达到解剖和功能上的修复，这无疑为中枢神经疾病的治疗带来了希望的曙光。目前与NSCs迀移的相关因素很多:包括细胞周围环境、细胞间通讯、细胞代谢产物、NSCs自身及邻近或远隔部位其它细胞所分泌的细胞因子、黏附因子、激素和递质等，但定向迀移的具体机制还不完全清楚，因此了解NSCs定向迀移的机制对于利用NSCs治疗神经系统疾病是必须的。
[0004]细胞迀移的机制主要涉及到细胞骨架和其结合蛋白以及细胞外基质蛋白的变化，在迀移信号分子的浓度梯度和胞外基质的密度梯度等外界信号的刺激下，细胞内的信号传递分子和细胞骨架调节分子产生不对称的分布和/或激活，导致细胞骨架的形态、分布和细胞器的定位在即将发生迀移的方向上表现出前后不对称型，这一过程被称作迀移细胞的极性化(polarizat1n)，细胞由此分化出运动的前段和后部，之后在前段形成迀移所需的特殊结构-伪足，粘着斑(focal adhes1n，FA)。在极化过程中涉及多个信号通路和它们下游效应因子的作用，而不同信号通路的作用又必须紧密配合，形成精密的调控网络，保证极化及迀移的每个步骤能正确完成并密切衔接，而Rho家族小GTP酶(small GTPase)在细胞迀移的协调过程中扮演了关键性的角色，尤其Racl蛋白在细胞迀移过程中发挥了重要作用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种检测原代神经干细胞迀移极化的方法。
[0006]本发明的再一的目的是，提供上述方法的用途。
[0007]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
[0008]一种检测原代神经干细胞迀移极化的方法，包括如下步骤:
[0009]a.在模具上用二甲基硅氧烷制备下表面有平行显微通道的PDMS印章；
[0010]b.条带包被，取消毒的玻片放入培养皿中，加入多聚赖氨酸进行包被，将制备好的PDMS印章扣在多聚赖氨酸包被的玻片上，将需要研究的导向因子用FITC-BSA稀释到作用浓度，然后加入到印章的微通道一端，于通道另一端抽吸使溶液充满整个通道，待溶液干后，移除印章，在玻片上形成含有导向因子的平行条带；
[0011]c.在包被好荧光条带的玻片上进行神经干细胞培养；
[0012]d.使用免疫荧光技术进行染色，观察条带间隙中神经干细胞贴壁后伪足的方向，计算神经干细胞前端与后端的伪足面积比值，判断神经干细胞是否极化。
[0013]所述PDMS印章下表面的通道宽为60 μ m、高为100 μ m，每个平行的通道之间间隔为 90 μ??ο
[0014]所述步骤b中多聚赖氨酸浓度为0.lmg/ml。
[0015]所述判断神经干细胞是否极化的方法为:当神经干细胞前端与后端的伪足面积比值为0.8-1.2时为未极化；当神经干细胞前端与后端的伪足面积比值多1.2时发生极化。
[0016]所述的导向因子为对神经纤维有导向作用的因子，所述的导向因子为基质细胞衍生因子(SDF-1)、BDNF (脑源性神经营养因子)、MAG(乙酰胆碱)。
[0017]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
[0018]如上任一所述的方法在检测神经干细胞迀移极化中的应用。
[0019]本发明优点在于:
[0020]本发明的方法不仅有助于使神经干/祖细胞迀移起始-极化可视化，而且对极化定量分析及机制的探讨具有潜在的开发价值。在本发明的基础上，检测不同分子对神经干细胞迀移极化的影响，同时探索迀移极化的具体分子机制，然后通过外源性给予细胞分泌因子，启动体内神经干细胞的迀移等功能，为神经干细胞治疗神经退行性疾病奠定实验基础。
【附图说明】
[0021]附图1为本发明示意图；其中A部分为PDMS印章的制备；B部分为条带包被。
[0022]附图2为趋化因子CXCL12介导的神经祖细胞极化共聚焦拍照图片；其中A、B中的条带只含BSA ;C、D中条带含BSA和趋化因子CXCL12 ;虚线为条带的边界;A、C的标尺为50 μ m ;C、D 的标尺为 20 μ m。
[0023]附图3为极化细胞的定量分析，其中虚线左侧为前端，虚线右侧为后部；标尺为 20 μ mD
【具体实施方式】
[0024]下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0025]实施例
[0026]一、PDMS印章的制备
[0027]原材料及仪器:模具(模具表面刻有间隔相等的平行微细凹槽，凹槽宽为60 μm，槽高为100 μπι，每个凹槽之间的间隔为90 μπι。)，聚二甲基硅氧烷(PDMS) (Momentive RTV615Α液、B液，苏州汶颢芯片科技有限公司)，厚质铝箔，培养皿(150mm);真空箱，烤箱，手术刀。
[0028]流程:
[0029]1、大培养皿中铺铝箔，称好A液、B液(分别为预聚体与偶联剂)，充分搅拌，将铝箔的边缘翻上来，放真空箱里抽真空1min(注1:抽真空时，可一直抽；也可一边抽一边放)；
[0030]2、新培养皿中铺铝箔，其周围压平，在把模具放进铝箔上，将I中抽真空抽好的胶倒入模具的凹槽中(注2:在倒在模具之前，如果还有气泡，可用针头刺破)，再抽5min真空，放在85°C Ih ；
[0031]3、将招箔和模具从培养皿中拿出，用合适的手术刀沿着模具的边缘小心的分开，去掉铝箔，将印章拿出，切割。印章大小:长宽1mmX5mm，其下表面带有间隔相等的平行显微通道，通道宽为60 μm、高为100 μm，每个平行的通道之间的间隔