一种适用于羔羊卵母细胞体外受精培养的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物学领域，具体设及一种适用于黑羊卵母细胞体外受精培养的方 法。
【背景技术】
[0002] 幼畜体外胚胎生产和移植技术（juvenileinvitroemb;ryotransfer,JIVET)是 集成了幼龄母畜超数排卵技术、卵母细胞体外成熟技术、体外受精技术、胚胎体外培养技术 和胚胎移植技术等一系列繁殖技术为一体的生物技术体系。JIVET技术将幼龄母畜卵巢上 大量的卵母细胞为卵源在体外培养生产胚胎，有利于缩短家畜繁殖的世代间隔，充分发掘 优良遗传性状母畜的繁殖潜能，提高畜群的遗传改良速度与生产效率，为家畜育种提供丰 富的遗传资源。
[0003] 体外受精是指获能精子与成熟卵母细胞在体外完成受精的过程，其环境对受精率 影响很大。受精环境除了溫度、湿度、抑值和空气成分，还有受精培养基。近年来，很多试 验采用S0F、TALP、Hepes-M199W及B0等培养基作为体外受精培养基。不同的受精液，其受 精的培养时间也不同。B0培养基一般需培养6~化，而TALP培养基或者S0F培养基需要 培养18~2地。精卵培养时间不足，会降低受精率；而精卵解育时间过长，精子在代谢过程 中产生并积累的大量有害物质会严重影响卵母细胞及受精卵的正常生理过程，阻碍其正常 受精和卵裂。同时精卵在解育过程中，精子将消耗培养液中的营养物质，使卵母细胞及受精 卵处于一个营养不足的培养环境中，极大降低了受精率和胚胎后期发育质量；适当的受精 时间将提高受精率及胚胎发育潜能。体外受精一般采用液滴培养法，其中精子的密度一般 控制在2~10X1〇6个/mL，精子密度过低则会导致受精效果下降，而精子密度过高则会出 现多精入卵的现象。因而，提高家畜卵母细胞的受精率要从多重条件进行优化处理。
[0004] 本研究根据已有报道W及对山羊卵母细胞体外受精的反复试验，W期总结出一套 简单易行的黑羊卵母细胞体外受精方案，完善黑羊卵母细胞体外受精技术，提高黑羊卵母 细胞的受精效果，为后续源于黑羊受精卵的胚胎发育方面的研究奠定基础。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的是建立一种适用于黑羊卵母细胞体外受精培养的方法。
[0006] W江苏地方白山羊品种为动物模型，分别从成年母羊和黑羊卵巢中采集卵丘卵母 细胞复合体（COCs)进行体外成熟培养。收集成熟的卵母细胞进行体外受精，对黑羊W及成 年母羊卵母细胞体外受精卵裂率进行对比研究，W期建立一种简单、适用的黑羊卵母细胞 体外受精的方法。
[0007] 本发明所述的适用于黑羊卵母细胞体外受精培养的方法，包括卵母细胞获取及成 熟培养、精子获能，成熟卵母细胞体外受精和受精卵培养的步骤；其中精子获能时将装有精 子的小管放入培养箱中倾斜45°上游法解育40~50min后，吸取上层含高活力精子的精液 到灭菌PCR小管中，加入洗涂液2000rpm、3min离屯、洗涂2次；成熟卵母细胞体外受精时在 培养箱中解育8~化。
[0008] 上述步骤中的解育时间、离屯、机的转速及离屯、时间、离屯、洗涂次数、成熟卵母细胞 的培养时间等的组合利用，对本发明的技术效果有实质性影响。
[0009] 由表1可知，在所建立的培养技术体系下，黑羊和成年母羊受精卵的卵裂率分别 为33. 04 + 3. 57和34. 85 +1. 83,与目前相关研究报道中山羊受精卵卵裂率的水平基本一 致。同时，黑羊和成年母羊受精卵的卵裂率无显著性差异。说明，本研究所建立的黑羊卵母 细胞体外受精培养的方法有效可行。
[0010] 表1黑羊和成年母羊体外受精卵裂率的比较
[0011]
[0012] 注：上标有相同字母表示差异不显著任〉0.05)，无相同字母表示差异显著 (P<0. 05)。
【附图说明】
[0013] 图1是2-细胞胚胎电镜下，400X。A为成年母羊胚胎巧为黑羊胚胎。
【具体实施方式】
[0014] 1.试验材料
[0015] 选择江苏地方白山羊品种，分别为健康的1~2岁成年母羊和1~2月龄黑羊，摘 取其新鲜的卵巢。
[0016] B0 液、洗涂液：称取NaCl655.Omg，化肥0331 0 . 4mg，葡萄糖 251. 8mg，KC1 30.Omg， CaClzie. 7mg，NaH2P〇4ll. 5mg，MgCl2l〇. 6mg，丙酬酸钢 5. 5mg，1%酪红 4. 00ml，lOOIU/ml青霉 素，lOOIU/ml链霉素，加超纯水至100ml定容，0. 22μm滤器过滤除菌分装备用。
[0017] B0获能液、B0受精液（现配现用）：B0液，肝素钢20μg/血，BSAlOmg/血混合后 过滤0. 22μm滤器除菌，38. 5°CC〇2培养箱内平衡30分钟。
[0018] 受精卵培养液：TCM199,FBS20 %，Na肥032. 2mg/mL，丙酬酸钢 25.Omg/mL，肥阳S 6.Omg/mU青霉素钢和硫酸链霉素各lOOIU/ml。，
[0019] 2.卵母细胞的采集
[0020] 卵巢运回实验室后，用手术剪刀快速去除其表面多余组织，用38. 5°C的卵巢洗涂 液清洗3次后放入装有PBS的培养皿中。把培养皿放置在39Γ的溫控板上，挑选表面直径 为1~5mm的卵泡，用无菌綴子固定住住卵巢，用手术刀轻轻划破卵泡，再用注射器吸取PBS 冲洗划破的卵泡，汇集冲洗液，静置Imin后在体视显微镜下检卵，用口吸管挑选出形态正 常、胞质均匀且包有1层W上完整卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体（COCs)
[0021] 3.卵母细胞成熟培养
[0022] 成熟培养采用微滴培养法，微滴上覆盖石蜡油。本试验选用35mm直径的培养皿， 可W放置4个微滴，每个微滴50μ1成熟液。把挑选好的卵丘-卵母细胞复合体用口吸管 移入平衡化之后的微滴中洗涂Ξ次，放置在最后一个微滴中。最后把培养皿移入38. 5°C， 5%C〇2,饱和湿度条件的培养箱中培养24~26h，黑羊则为22~24h。培养结果时先通过观 察卵丘颗粒细胞的扩散状况来初步判断卵母细胞整体成熟效果是否良好，然后把卵丘-卵 母细胞复合体放入透明质酸酶溶液微滴里，用枪头快速吹打W剥离颗粒细胞，收集卵母细 胞裸卵在倒置显微镜下观察是否成熟，W细胞分出第一极体为成熟标准。
[0023] 3.精子的获能处理
[0024] 采集本品种种公羊新鲜精液。公羊平均每次精液量1.OmU精子密度1~3X109个 /ml,抑值6. 9,活力0. 8W上，符合常规标准。种公羊新鲜精液，用4层灭菌纱布过滤后，用 微量移液枪吸取约0. 2ml置于含有1~1. 5ml精子洗涂液的灭菌PCR小管底部。将试管放 入培养箱中倾斜45°上游法解育30~60min后，吸取上层含高活力精子的精液到灭菌PCR 小管中，加入洗涂液离屯、洗涂2次（200化pm，3~5min)，弃去上清液。用平衡化W上的B0 获能液溶解沉淀，置于38. 5°C、5%C〇2、饱和湿度条件培养箱中解育1~化备用。 阳0巧]4.卵母细胞体外受精
[00%] 将成熟的卵母细胞移入平衡化W上的BO受精液微滴里，每个微滴内放10个卵母 细胞，然后加入10μ1用血细胞计数法调节过密度的体外获能精液，精子最终密度为2~ 10Χ106个/mU加盖后置于5%C0 2、38. 5°C、饱和湿度条件培养箱中解育7~化。
[0027] 5.受精卵的体外培养
[0028] 在受精7~化后，使用口吸管吹打除去卵母细胞外面的精子和卵丘细胞，把受精 后的卵母细胞移入平衡过的受精卵培养液液中，置于38. 5°C、5%C〇2、饱和湿度条件培养箱 中培养，每隔2d半量更换胚胎培养液。在受精后4化检查受精卵的卵裂率（见图1)。
【主权项】
1. 一种适用于羔羊卵母细胞体外受精培养的方法，包括卵母细胞获取及成熟培养、精 子获能，成熟卵母细胞体外受精和受精卵培养的步骤，其特征在于，精子获能时将装有精子 的小管放入培养箱中倾斜45°上游法孵育40~50min后，吸取上层含高活力精子的精液到 灭菌PCR小管中，加入洗涤液2000rpm、3min离心洗涤2次；成熟卵母细胞体外受精时在培 养箱中孵育8~9h。
【专利摘要】本发明属于生物学领域，具体涉及一种适用于羔羊卵母细胞体外受精培养的方法。该方法包括卵母细胞获取及成熟培养、精子获能，成熟卵母细胞体外受精和受精卵培养的步骤；在精子获能和成熟卵母细胞体外受精步骤中对孵育时间、离心机的转速及离心时间、离心洗涤次数、成熟卵母细胞的培养时间条件进行优化组合利用，实现了羔羊和成年母羊受精卵的卵裂率基本一致。
【IPC分类】C12N5/073, C12N5/076, C12N5/075
【公开号】CN105255820
【申请号】CN201510862744
【发明人】李拥军, 蔡缪荧, 程国虎, 张昊, 郭海燕
【申请人】扬州大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月30日