离屯、5min，收集 细胞沉淀，并用Ξ维培养用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1X1〇8个细胞/ml,接 种于水凝胶上，加入Ξ维培养用无血清培养基，在37°C、5%C02培养箱中培养，2-3d更换一 次培养基。
[0074] 本实施例中二维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酷胺、1倍的非必需 氨基酸、体积百分数5%血清替代物、15ng/mLbFGF、lOOU/mL青霉素和100μg/mL链霉素， 余量为叫traCULTURESerum-化eeMedium;^维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/ L谷胺酷胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5%血清替代物和15ng/mLBMP-2,余量为 UltraCULTURESerum-freeMedium。
[00巧]本实施例中水凝胶为I型胶原水凝胶，I型胶原为鼠尾胶原蛋白I型，购自sigma。 通过下述方法制备水凝胶：用lOmmol/L乙酸溶液配制I型胶原酸性溶液，于4°C下用Imol/ L化OH溶液调节抑值至7. 2左右，得到终浓度为12mg/血的胶原水凝胶溶液。瞬时离屯、脱 泡后接种到预先冷却到4°C的96孔板内，-80°C静置化后冻干16h，得到水凝胶。
[0076] 实施例4、牙周膜干细胞的培养方法
[0077] -种牙周膜干细胞的培养方法，与实施例1基本相同，包括W下步骤：
[0078]S1、牙周膜干细胞的分离及纯化
[0079] 将分离得到的牙周膜干细胞按照IXlOVwell接种至六孔板中，每孔加入2血二 维培养用无血清培养基，混匀后于37°C、5%C〇2、湿度95%的二氧化碳培养箱中培养。每3d 换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成。当细胞生长至80% -90%汇合，用 0. 25m/v%膜蛋白酶溶液消化细胞，进行传代培养。第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养 人牙周膜干细胞，待克隆长至孔底30-60%左右时，用0. 25m/v%膜蛋白酶溶液消化细胞， 扩大培养。
[0080] S2、S维培养
[0081] 将培养至第Ξ代的牙周膜干细胞，用0. 25m/v%膜蛋白酶溶液消化，吸弃膜蛋白 酶溶液，用Ξ维培养用无血清培养基重悬细胞，用70μm细胞筛过滤细胞，WlOOOrpm离屯、 5min，收集细胞沉淀，并用Ξ维培养用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1X107个细 胞/mU接种于水凝胶上，加入Ξ维培养用无血清培养基，在37°C、5%C〇2培养箱中培养， 2-3d更换一次培养基。
[0082] 本实施例中二维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酷胺、1倍的非必 需氨基酸、体积百分数5%血清替代物、7. 5ng/mLbFGF、lOOU/mL青霉素和100μg/mL链霉 素，余量为叫traCULTURESerum-freeMedium 维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/ 1谷胺酷胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5%血清替代物和7.511肖/1^日1?-2，余量为UltraCULTURESerum-freeMedium。
[0083] 本实施例中水凝胶为I型胶原水凝胶，I型胶原为鼠尾胶原蛋白I型，购自sigma。 通过下述方法制备水凝胶：用lOmmol/L乙酸溶液配制I型胶原酸性溶液，于4°C下用Imol/ L化OH溶液调节抑值至7. 2左右，得到终浓度为8mg/血的胶原水凝胶溶液。瞬时离屯、脱 泡后接种到预先冷却到4°C的96孔板内，-80°C静置化后冻干16h，得到水凝胶。
[0084] 对比例1、牙周膜干细胞的培养方法
[0085] -种牙周膜干细胞的培养方法，二维培养时不使用bFGF，其他培养条件与实施例 1相同；具体如下：
[0086]S1、牙周膜干细胞的分离及纯化
[0087] 将分离得到的牙周膜干细胞按照IXlOVwell接种至六孔板中，每孔加入2血无 血清培养基，混匀后于37°C、5%C〇2、湿度95%的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次， 7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，此时在光学显微镜100倍下观察，细胞群成团 生长，单个细胞成长梭形。当细胞生长至80% -90%汇合，0. 25m/v%膜蛋白酶溶液消化细 胞，进行传代培养。
[0088] 第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，将消化的牙周膜细胞悬 液计数，并调整细胞密度为50个细胞/mU将细胞悬液吹打均匀，种于6孔板，每孔放 入37°C、5 %C〇2培养箱中培养，2d-5d换液一次，待克隆长至孔底30-60 %左右时，用0. 25m/ V%膜蛋白酶溶液消化细胞，扩大培养。
[0089]S2、S维培养
[0090] 将培养至第3代的牙周膜干细胞，用0. 25m/v%膜蛋白酶溶液消化，吸弃膜蛋白 酶，用无血清培养基重悬，用70μm细胞筛过滤细胞，W1000巧m离屯、5min，收集细胞沉淀， 并用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为W1X1〇8个细胞/mL的密度接种于水凝胶材 料上，加入Ξ维培养用无血清培养基，在37°C、5%C〇2培养箱中培养，2-3d更换一次培养 基。
[0091] 本实施例中Ξ维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酷胺、1倍的非必需 氨基酸、体积百分数5%血清替代物和1〇11肖/1^81?-2，余量为叫付日抓1；1'1]1?6 86削111-化66 Medium。
[0092] 本实施例中水凝胶为I型胶原水凝胶，I型胶原为鼠尾胶原蛋白I型，购自sigma。 通过下述方法制备水凝胶：用lOmmol/L乙酸溶液配制I型胶原酸性溶液，于4°C下用Imol/ L化OH溶液调节抑值至7. 2左右，得到终浓度为lOmg/血的胶原水凝胶溶液。瞬时离屯、脱 泡后接种到预先冷却到4°C的96孔板内，-80°C静置化后冻干16h，得到水凝胶。
[0093] 对比例2、牙周膜干细胞的培养方法
[0094] -种牙周膜干细胞的培养方法，在Ξ维培养时不使用BMP-2,其他培养条件与实施 例1相同，具体培养方法如下：
[0095]S1、牙周膜干细胞的分离及纯化
[0096] 将分离得到的牙周膜干细胞按照IXlOVwell接种至六孔板中，每孔加入2血二 维培养用无血清培养基，混匀细胞悬液，放于37°C、5%C〇2、湿度95%的二氧化碳培养箱中 培养。每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，此时在光学显微镜100 倍下观察，细胞群成团生长，单个细胞成长梭形。当细胞生长至80% -90%汇合，0. 25m/v% 膜蛋白酶溶液消化细胞，进行传代培养。
[0097] 第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，将消化的牙周膜细胞悬 液计数，并调整细胞密度为50个细胞/mU将细胞悬液吹打均匀，种于6孔板，每孔放 入37°C、5%C〇2培养箱，2d-5d换液一次，待克隆长至孔底30-60%左右时，膜酶消化，扩大 培养。
[0098] S2、S维培养
[0099] 将培养至第Ξ代的牙周膜干细胞，用0. 25m/v%膜蛋白酶溶液消化，吸弃膜蛋白酶 溶液，用无血清培养基重悬，用70μm细胞筛过滤细胞，W1000巧m离屯、5min，收集细胞沉 淀，并用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为W1X1〇8个细胞/mL的密度接种于水凝 胶材料上，加入无血清培养基在37°C、5%C〇2培养箱中培养，2-3d更换一次培养基。
[0100] 本实施例中二维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酷胺、1倍的非必需 氨基酸、体积百分数5%血清替代物、lOng/mLbFGF、lOOU/mL青霉素和100μg/mL链霉素， 余量为叫traCULTURESerum-freeMedium。
[0101] 本实施例中水凝胶为I型胶原水凝胶，I型胶原为鼠尾胶原蛋白I型，购自sigma。 通过下述方法制备水凝胶：用lOmmol/L乙酸溶液配制I型胶原酸性溶液，于4°C下用Imol/ L化OH溶液调节抑值至7. 2左右，得到终浓度为lOmg/血的胶原水凝胶溶液。瞬时离屯、脱 泡后接种到预先冷却到4°C的96孔板内，-80°C静置化后冻干16h，得到水凝胶。
[0102] 为了便于更直观的了解各实施例、对比例的区别，现将各实施例、对比例中的bFGF 浓度、Ξ维培养的接种密度、水凝胶浓度和BMP-2浓度列于表1。
[0103] 表1各实施例、对比例的区别
[0104]
[0105]效果实施例1、CCK8检测细胞增殖检测
[0106] 采用CCK-8法检测各实施例、对比例中Ξ维培养6天后牙周膜干细胞的增殖活力。 CCK-8法检测时每孔加10μLCCK-8 (终质量浓度约为0. 5g/L)于5%C〇2, 37°C培养化，用 酶标仪测定450nm，参考波长为630nm的吸光度值（A)。具体操作方法按照酶标仪说明书进 行。结果如图2所示。在巧光显微镜下观察胶原凝胶内牙周膜干细