牙髓髓相似细胞(dpmsc)和分离和使用的方法

专利名称：牙髓髓相似细胞(dpmsc)和分离和使用的方法
技术领域：
本发明总体上涉及分离和使用牙髓髓相似细胞(dental pulp marrow similar cells) (DPMSC)的组合物和方法。
背景技术：
从干细胞产生器官和组织和它们相继的移植为许多病状提供可能的治疗，使干细 胞成为许多领域中研究的中心焦点。使用干细胞产生器官和组织用于移植为糖尿病、帕金 森氏病、肝病、心脏病和自身免疫性疾病提供可能的治疗，仅举几个例子。然而，存在至少 两个与器官和组织移植相关的主要问题。首先，存在供体器官和组织的缺乏。少至意大利 曾经移植需要的器官的10%成为对受体可用的。参见，例如北意大利移植计划报告(Nord Italian Transplant program r印ort)2007。根据北意大利移植计划报告，在2006年需要 新肾的9，000个意大利人中只有约1，200人接受了新肾，2006年在肝移植物的等待名单中 平均12%的患者在等待接受合适的器官时死亡。第二个主要问题是移植的组织与受体的免 疫系统的不相容性。因为捐赠的器官或组织被宿主免疫系统识别为外来的，所以必须以重 大的费用，在财政上和身体上地，向患者提供抗排斥药疗法。异种移植或来自另一个物种的组织或器官的移植将提供可选的可能性来克服人 类器官和组织的缺乏。异种移植将提供先进的移植规划的优点，允许采集器官同时器官 仍是健康的，并允许患者在移植手术之前进行任何可能的预处理。令人遗憾的是，异种移 植没克服组织相容性的问题，反而甚至加重了它。此外，根据疾病控制中心(Centers for Disease Control)，有这样的证据，损害性病毒跨越种间屏障。猪已成为作为器官和组织供 体的可能候选者，但是已记录了来自猪的超过一个病毒跨种传播给人类。例如，在马来西 亚，有报道超过一百万头猪被屠宰以努力控制亨德拉病毒的爆发，亨德拉病毒是传播给超 过70个人、具有致死结果的疾病。参见，例如Butler，0.，Nature (1999) 398 :549。因此用于移植的器官和组织的有希望的来源在于干细胞技术的发展。理论上，干 细胞能经历自我更新细胞分裂以产生表型上和基因型上相同的子系，持续无限定的时间， 最后能分化成至少一个最终的细胞类型。通过从患者自己的干细胞产生组织或器官，或通 过遗传上改变异源的细胞以使受体免疫系统不将它们识别为外来的，能产生移植组织以提 供与异种移植相关的优点，没有感染或组织排斥的相关危险。干细胞还提供提高基因治疗结果的希望。能将患者自身的干细胞在体外从从遗传 上改变，然后再输入体内以产生期望的基因产物。这些遗传改造的干细胞将具有被诱导分 化形成用于在身体的特定位点植入或用于全身应用的许多细胞类型的潜能。可选地，能将 异源的干细胞在遗传上改变以表达受体的主要组织相容性复合体(MHC)抗原或没有MHC以 允许那些细胞从供体到受体的移植，没有排斥的相关危险。
干细胞是具有广泛的、可能的无限的增殖潜能以分化成几个细胞谱系并能在移植 之后重新住入组织的细胞。典型的干细胞是胚胎干(ES)细胞，由于它具有无限的自我更新 和多能的分化潜能。这些细胞是从胚泡的内细胞群得到的，或能从植入后胚胎(胚胎生殖 细胞或EG细胞)的原始生殖细胞得到。已从小鼠得到ES和EG细胞，最近，还从非人灵长 类和人类得到ES和EG细胞。当移植到小鼠胚泡或其它动物的胚泡中时，ES细胞能对小鼠 (动物)的所有组织有贡献。当移植到出生后的动物中时，ES和EG细胞产生畸胎瘤，这再 次显示了它们的多能性。用抗体SSEA-I和SSEA-4通过阳性染色能鉴别ES (和EG)细胞。在分子水平，ES和EG细胞表达许多对这些未分化细胞高度特异的转录因子。这 些包括Oct-4和Nanog。还发现LIF-R和转录因子Sox_2和Rox_l，即使后两个也在非ES 细胞中表达。Oct-4是在原肠形成前期胚胎、早期卵裂期胚胎、胚泡内细胞群的细胞和胚胎 癌(EC)细胞中表达的转录因子。当细胞在体外和在成体动物中被诱导分化时，Oct-4下调， Oct-4只在生殖细胞中发现。几个研究已显示Oct-4是维持ES细胞的未分化的表型所需要 的，并在测定胚胎发生和分化中的早期阶段中起主要作用。Oct-4，与Rox-I结合，引起锌指 蛋白Rex-I的转录激活，并还是维持ES在未分化状态所需要的。人和鼠的原生殖细胞需要 LIF的存在。ES细胞的另一个标记是端粒末端转移酶的存在，该酶提供给这些细胞体外的 无限自我更新潜能。已在大多数器官组织中鉴别了干细胞。最具有特征的是造血干细胞。其是来自 中胚层的细胞，已基于细胞表面标记和功能特性被纯化。从骨髓、血液、脐带血、胎肝和卵 黄囊分离的造血干细胞是祖细胞，为受体的生命重新启动血细胞生成和产生多个造血谱系 (参见 Fei，R.，et al.，美国专利号 5，635，387 ；McGlave, et al.，美国专利号 5，460，964 ； Simmons, P.，et al.，美国专利号 5，677，136 ；Tsukamoto, et al.，美国专利号 5，750，397 ； Schwartz, et al.，美国专利号 5，759，793 ；DiGuisto, et al.，美国专利号 5，681，599 ； Tsukamoto, et al.，美国专利号 5，716，827 ；Hill, B. , et al.，Exp. Hemato 1. (1996)24(8) 936-94 。当移植进致死辐照的动物或人类中，造血干细胞能重新住入(!^populate)红细 胞、嗜中性-巨噬细胞、巨核细胞和淋巴造血细胞库。在体外，能诱导造血干细胞以经历至 少一些自我更新细胞分裂，并能诱导造血干细胞以分化成如体内所见的相同的谱系。因此， 该细胞履行干细胞的标准。然而，只分化形成造血谱系的干细胞不能提供用于其它损伤组 织修复的细胞来源，例如，被高剂量化学治疗剂损伤的心或肺组织。已被广泛研究的第二种干细胞是神经干细胞(Gage F. H.，Science 287 1433-1438,2000) ；Svendsen C. N.，et al,Brain Path. 9 :499-513,1999 ；Okabe S.，et al, Mech. Dev. 59 =89-102,1996)。神经干细胞最初是在胎脑的室下区和嗅球中鉴定到的。直到 最近，人们相信成体脑不再含有具有干细胞潜能的细胞。然而，在啮齿动物中和最近也在非 人灵长类和人类中的几个研究已显示干细胞在成体脑中继续存在。这些干细胞在体内能增 殖，和在体内连续地再生至少一些神经元细胞。当离体培养时，神经干细胞能被诱导增殖， 以及分化成不同类型的神经元和神经胶质细胞。当移植进脑时，神经干细胞能移入和产生 神经细胞和神经胶质细胞。因此，该细胞落入干细胞的范围内。最初来自胚胎中胚层和从成体骨髓分离的间质干细胞(MSC)能分化形成肌肉、 骨、软骨、脂肪、骨髓间质和腱。胚胎发生期间，中胚层发育成肢芽中胚层，其是产生骨、软 骨、脂肪、骨骼肌和可能的内皮的组织。中胚层还分化成脏壁中胚层，其产生心肌、平滑肌或由内皮和造血祖细胞组成的血岛。原始的中胚层或间质干细胞因此能为许多细胞和组 织类型提供来源。已被命名为干细胞的第三组织特异性细胞是最初由Fridenshtein描 述的间质干细胞(Fridenshtein，Arkh. Pato 1. ,44 :3-11,1982) 许多间质干细胞已被 分离(参见，例如 Caplan，Α.，et al.，美国专利号 5，486，359 ；Young, H.，et al.，美国 专利号 5，827，735 ；Caplan, Α.，et al.，美国专利号 5，811，094 ；Bruder, S.，et al.，美 国专利号 5，736，396 ；Caplan, Α.，et al.，美国专利号 5，837，539 ；Masinovsky, B.，美国 专利号 5，837，670 ；Pittenger, M.，美国专利号 5，827，740 Jaiswal, N.，et al.，J. Cell Biochem. (1997)64(2) :295-312 ；Cassiede P. ， et al. ，J. Bone Miner, Res. (1996) 11(9) 1264-1273 Johnstone, B.，et al.，Exp. Cell Res. (1998)238(1) :265-272 ；Yoo, et al.， J.Bone Joint Sure. Am. (1998)80(12) :1745-1757 ；Gronthos, S.，Blood(1994)84(12) 4164-4173 ；Makino, S.，et al.，J. Clin. Invest. (1999) 103(5) :697-705)。已被描述 的许多间质干细胞中，所有的已显示有限的分化以只形成通常认为是间质起源的那些分 化的细胞。到目前为止，报道的最多能的间质干细胞是Pittenger等分离的细胞，其表 达 SH2+SH4+CD29+CD44+CD7rCD90+CD106+CD120a+CD124+CD14XD34TD45-表型。该细胞能 分化形成许多间质起源的细胞类型，但是分离它的小组已报道由于在扩大的培养物中从 未鉴定到造血细胞，该细胞在分化潜能上对间质谱系是明显有限的(Pittenger，et al., Science(1999)284 :143-147.)。已鉴定了其它的干细胞，包括胃肠干细胞、表皮干细胞和肝干细胞，也称作椭圆形 细胞(Potten C.，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 353 :821-30,1998 ；Watt F.， Philos. Trans R Soc Lond B Biol Sci 353:831,1997 ；Alison Μ.，et al, Hepatol 29 678-83，1998)。与ES细胞相比，组织特异性干细胞具有较小的自我更新能力，尽管它们分化成多 个谱系，但是它们不是那么多能的。此外，未完全探查到组织特异性干细胞中端粒末端转移 酶的程度，部分是因为难于获得这些细胞中大量的高度富集的群体。直到最近，人们认为器官特异的干细胞只能分化成相同组织的细胞。许多最近 的出版物已提示成体器官特异的干细胞可以能分化成不同组织的细胞。许多研究已显示 在骨髓移植的时候移植的细胞能分化成骨骼肌O^errari，Science 279 =528-30,1998 ； Gussoni,Nature 401 =390-4,1999)。这能被认为是存在于骨髓中的间充质细胞可能的分化 潜能的范围内。Jackson报道肌卫星细胞能分化成造血细胞，脏壁中胚层内表型的再次转换 (Jackson, PNAS USA，96 14482-6，1999)。其它的研究已显示来自一个胚层(例如脏壁中胚层)的干细胞能分化成被认为是胚胎发生期间来自不同胚层的 组织。例如，在经历骨髓移植的人类或动物中检测到的内皮细胞或它们的前体至少部分 来自骨髓供体(Takahashi，Nat Med 5 :434-8,1999 ；Lin, Clin Invest 105 :71-7,2000) 因此，用输入的骨髓转移脏壁中胚层和非脏壁中胚层，诸如MSC，取得的子代。甚至更令 人惊讶的是在啮齿动物和人类中显示肝脏上皮细胞和胆管上皮细胞来自供体骨髓的报 M (Petersen, Science 284 :1168-1170,1999 ；Theise, Hepatology 31 :235-40,2000 ； Theise, Hepatology 32 =11-6,2000) 同样，三个小组已显示神经干细胞能分化成造血 细胞。最后，Clarke等报道注射进胚泡的神经干细胞能对嵌合小鼠的所有组织有贡献 (Clarke, Science 288 :1660-3,2000)。
这些研究中的许多的结论未显示单个细胞能分化成不同器官的组织。许多研究者 没鉴别起始细胞的表型。Weissman和Grompe的研究是个例外，他们显示重新住入肝的细胞 存在于Lin-Thytk^ca1+髓细胞中，其在造血干细胞中是高度富集的。同样，Mulligan组显 示针对HSC高度富集的髓Sp细胞能分化成肌肉和内皮，Jackson等显示肌肉Sp细胞负责 造血重建(Gussoni et al. , Nature 401 :390_4，1999)。从异源胚胎干细胞产生的组织和器官的移植需要细胞被进一步从遗传上修饰以 抑制某些细胞表面标记的表达，或为了防御移植排斥，需要化学疗法免疫抑制剂的使用继 续。因此，尽管胚胎干细胞研究给用于移植的器官的有限供应的问题提供了有希望的可选 的解决办法，但是与对异源细胞或组织的持久移植的免疫抑制的需要相关的问题和危险将 保持。为了为针对群体大多数的治疗提供免疫相容的细胞，将需要建立估计的20个免疫学 上不同的胚胎干细胞系(ffadman, M.，Nature (1999) 398 :551)。使用来自发育的个体，而不是胚胎的细胞作为自体的或同种异体的干细胞源将克 服与移植的胚胎干细胞的使用相关的组织不相容性的问题，以及解决与胚胎干细胞研究相 关的伦理困境。迄今与用于组织移植的自体干细胞的使用相关的最大缺点在于它们有限的 分化潜能。已从完全发育的生物体，特别是人类分离出许多干细胞，但是这些细胞尽管被报 道是多能的，但是已显示分化成多个细胞类型的有限潜能。因此，即使其它人和本发明者先前已分离了具有多分化潜能的干细胞，但是尚未 描述具有分化成不同谱系的品种多样的细胞类型的潜能的祖细胞，包括成纤维细胞、成骨 细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌、内皮、间质、平滑肌、心肌和造血细胞。如果细胞和组织 移植和基因疗法将要提供期望的治疗改进，那么需要具有最大或最广泛分化潜能的干细胞 或祖细胞。需要的是胚胎干细胞的成体相等物。作为对胚胎干细胞疗法的替代物，成体干细胞已显示出希望(Caplan，1991，2000， 2003,2004,2005 ；Caplan and Bruder,2001 ；Kuehle and Goodel1，2002 ;Pittenger， 2004)。例如，来自小鼠骨髓(mMAPC)的多能成体祖细胞显示出表达几个胚胎干(EQ细胞 标记，诸如Oct-4 (P0U转录因子),Rex-I (转录因子)和SSEA-I (阶段特异性胚胎抗原)，和 当将单个细胞注射进胚泡时，对所有的胚胎细胞谱系有贡献(Jiang et al.，2002)。虽然骨 髓是具有被证明的治疗价值的干细胞的极好来源，但是采集骨髓的过程是侵害性的，而且， 最近的数据牵涉癌症发展中的骨髓干细胞(Houghton et al.，2004)。脐带血、骨髓、脂肪 组织和羊膜干细胞以外的多能成体干细胞的潜在来源的名单的扩充(Jiang et al.，2002 ； Zuk et al.，2002 ；Miki et al.，2005)将具有价值。延伸在啮齿动物中的较早发现(Mann et al.，1996)，最近的在人脱落的乳牙(SHED)牙髓中的相对未成熟的干细胞的发现已提供 干细胞的潜在地非创伤性来源(Miura et al.，2003)。SHED显示体外快速的扩张和增殖， 同时表达几个间质干细胞标记，诸如STR0-1和⑶146。与ES细胞或mMAPCs相比，来自牙髓 的干细胞(Miura et al. ,2003)在它们的潜在治疗价值上似乎是差的，这是由于它们未显 示表达Oct-4、SSEAs, Nanog或全能干细胞的任何其它标记，而它们的多谱系终末分化只是
) W (Jiang et al. ,2002 ；Chambers et al. ,2003 ；Constantinescu, 2003 ；Laslett et al. ,2003 ；Mitsui et al.,2003 ；Pierdomenico et al. ,2005 ；Laino et al.,2006)o SHED已显示是高度异质的，因为只有9%的SHED表达未分化细胞的标记，人们不清楚是否 从SHED获得的克隆维持这些标记的表达(Miura et al.，2003)。先前，已报道干细胞从它们的天然环境中的去除可改变它们的分化性质(Bissell and Lafarge,2005 ；Schwartz and Verfaillie,2005)o描述从牙髓获得的干细胞的另外的出版物包括WO 03/066840、 WO 04/094588、US 2005/0106724、US2007/0009492, US 2007/0258957、WO 03/066840、EP 1748066AUW0 2006/010600和WO 2006/100088。然而，这些参考文献中没有描述纯化的干 细胞的同种群体，该干细胞能分化成不同谱系的细胞。相应地，需要的是干细胞的群体，该干细胞在ES细胞变成许多细胞的能力中显示 出ES细胞的可塑性，但是来自非胚胎来源和非创伤性来源。本发明满足这些需要，还提供 另外的好处。根据本文引用的参考文献本说明书被最充分地理解。在实施例部分之后参考文献 中的一些具有它们完全的著录信息。引用到本文的所有出版物、专利、专利申请和出版的专 利申请的公开每个特此通过引用以其全部被并入本文。发明_既述本发明提供分离的牙髓髓相似细胞(DPMSC)的组合物和分离、培养和分化这些细 胞的方法以及使用这些细胞的方法。DPMSCs的分离群体显示特别的标记表型，能通过蛋白 分析或核酸分析(例如rt-PCR)测量这些表型。相应地，在一方面，本发明提供DPMSCs的 分离群体，其中该分离群体中至少约90%的细胞共表达以下标记中的每一种⑶10、⑶13、 CD29、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CD90、CD105、Oct-4 同种型 k 和 B、Nanog、Sox-2 和 SSEA-4。在另一个方面，本发明提供DPMSCs的分离群体，其中该分离群体中至少约95%的 细胞共表达以下标记中的每一种CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CD90、 CD105、0ct-4同种型A和B、Nanog、Sox-2和SSEA-4。在另一个方面，本发明提供DPMSCs的 分离群体，其中约90-99%的细胞群体表达以下标记中的每一种⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、 CD49a、CD49d、CD59、CD73、CD90、CD105、Oct-4 同种型 A 和 B、Nanog、Sox-2 和 SSEA-4。在另一个方面，DPMSCs群体中的任何一种能显示表型，其中群体中0. 25_1%的细 胞表达⑶34和⑶45。在另一个方面，DPMSCs群体中的任何一种能显示表型，其中群体中小 于的细胞表达⑶34和⑶45。在另一个方面，DPMSCs群体中的任何一种能显示表型，其 中该群体中的细胞共表达以下每一种的mRNA :0ct-4同种型A和B、Nanog、Sox-2, SSEA-4、 c-Myc、Klf-4和Rex-I。在另一个方面，DPMSCs群体中的任何一种能显示表型，其中该群体 具有约观-30小时的平均倍增速度。在另一个方面，DPMSCs群体中的任何一种能显示表型， 其中DPMSCs具有分化成外胚层、内胚层或中胚层谱系中的一种、两种或所有三种细胞类型 的能力。在另一个方面，DPMSCs群体中的任何一种可以是人类DPMSCs。本发明还提供来自人牙髓的DPMSCs的分离群体，其中该分离群体中至少约90% 的细胞共表达以下标记中的每一种⑶10、⑶29、⑶13、⑶44、⑶49a、CD49d、⑶59、⑶73、 CDw90、CD105、0ct-4、Nanog、Sox-2 和 SSEA-4 ；其中该分离群体中 0. 25-1 % 的细胞表达 CD34 和CD45;其中该细胞具有正常核型；其中该分离群体中的细胞具有分化成外胚层、内胚层 或中胚层谱系中的至少两种细胞类型的能力。在另一个方面，DPMSCs群体中的任何一种能显示表型，其中该细胞具有分化成以 下中的任何一种或多种的能力成骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经胶质细 胞和神经元细胞。在一些方面，DPMSCs来自牙齿器官。在一方面，牙齿器官来自儿童。在另一个方面，牙齿器官来自成人。在一些方面，DPMSCs的群体包含在容器中，诸如组织培养平板、培养瓶和培养基 质。本发明还提供DPMSCs的分离群体，该群体已被培养以诱导分化，其中起始群体是 上面描述的DPMSCs，其中DPMSC中的分化结果变成选自骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、 心肌细胞、神经胶质细胞、神经元细胞、皮肤上皮细胞、肝上皮细胞、胰上皮细胞、胰内分泌 细胞、胰岛细胞、胰外分泌细胞、肠上皮细胞、肾上皮细胞、表皮相关的结构、毛囊、包围牙齿 的软组织、牙本质(牙齿)、釉质(牙齿)和牙骨质(牙齿)的分化细胞。本发明还提供DPMSCs的分离群体，其中该分离群体中的细胞的基因组还未通过 预选择的分离的DNA的插入、通过用预选择的分离的DNA替代细胞基因组的区段、或通过细 胞基因组的至少部分缺失或失活而被改变。本发明还提供通过在添加了选自血小板衍生的生长因子、胰岛素、硒、表皮生长因 子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、地塞米松、亚油酸和抗坏血酸的一种或多种生长因子 的培养基中培养牙髓源获得上面描述的DPMSCs群体的方法以获得DPMSCs群体。在一些 方面，所有前面的组分都包括在培养基中。在一些方面，DPMSCs是人类DPMSCs，牙髓源来 自人。在其它的方面，共培养贴壁细胞和非贴壁细胞，没有通过免疫耗竭、物理耗竭或化学 耗竭的选择。在其它的方面，该方法不耗竭细胞的起始来源或表达⑶3、⑶14、⑶19、⑶38、 CD66b和CD45血型糖蛋白A的单核细胞的细胞培养物。在其它的方面，该方法进一步包括 将细胞放到细胞培养容器中，其中细胞培养容器不包括细胞外基质(ECM)底物。在该方法 的其它方面，血清百分比占约0. 5-2. 5%。在本发明的另一个方面，培养的方法包括以下培养参数中的一个或多个胰岛素 以约10至约50μ g/ml的浓度存在，转铁蛋白以大于0但小于约 ομ g/ml的浓度存在，硒 以约0. 1至约5 μ g/ml的浓度存在，亚油酸以约0至约1 μ g/m的浓度存在，地塞米松以约 0. 005至0. 15 μ M的浓度存在，L-抗坏血酸以约10-50mg/L的浓度存在，血小板衍生的生长 因子以约5至约15ng/ml的浓度存在，表皮生长因子以1至约15ng/ml的浓度存在，胰岛素 样生长因子以1至约15ng/ml的浓度存在，成纤维细胞生长因子bl以约15ng/ml的浓度存 在。在另一个方面，培养的方法包括培养基中所有前面的组分。在另一个方面，本发明提供诱导DPMSCs分化成分化细胞的方法和从这些方法获 得的分化细胞的组合物。本发明还包括用本文描述的方法中的任何一个生产的ES细胞。在一个实施方式 中，本发明提供用如实施例1中所描述的培养方法产生的DPMSCs。在另一个方面，本发明提供通过将有效辅助治疗的量的DPMSCs施用给个体而对 需要其的个体提供治疗辅助的方法。在另一个方面，本发明提供为了有益的效果将干细胞 施用给需要其的个体的方法。在一些实施方式中，将有效量的细胞导入到需要其的个体。在 其它的实施方式中，需要其的个体是具有本文描述的医学的、生物学的、遗传学的或生理学 的病症中的任何一个或多个的个体。在另一个方面，本发明提供将治疗用酶、蛋白质或其它生物制品提供给具有或怀 疑具有遗传缺陷的个体的方法，其如下实施(a)进行足够量DPMSCs的宫内移植形成细胞或组织嵌合体以在移植之后在出生前或出生后的个体中产生人类细胞，和(b)允许细胞在具有或怀疑具有遗传缺陷的个体中 产生治疗用酶、蛋白质或其它产物。在另一个方面，本发明提供将基因治疗提供给需要治疗性治疗的个体的方法，其 如下实施(a)通过将分离的预选择的编码期望基因产物的DNA导入进一个或多个DPMSCs 而从遗传上改变DPMSCs ;(b)在培养物中扩大细胞；和(c)将该细胞导入到个体的身体以 产生期望的基因产物，因此提供基因治疗。在另一个方面，本发明提供为需要其的人类个体中的损伤组织提供治疗的方法， 其如下实施(a)培养DPMSCs以增殖它们；和(b)将有效量的扩大的DPMSCs与所述个体的 损伤组织接触以提供治疗。在一个实施方式中，通过局部注射或通过全身注射将细胞导入 到个体的身体中。在另一个实施方式中，将细胞与合适的基质植入物一起导入到个体的身 体中，该植入物提供另外的遗传物质、细胞因子、生长因子或其它因子以促进细胞的生长和 分化。在另一个实施方式中，在导入到个体的身体中之前将细胞包入聚合物胶囊内。在另一个方面，本发明提供鉴定与生理异常相关的遗传多态性的方法，其如下实 施(a)从统计学上显著的个体群体分离DPMSCs，从该个体能获得表型数据；(b)从统计学 上显著的个体群体扩大DPMSCs以建立DPMSC培养物；(c)在培养的DPMSCs中鉴定至少一 个遗传多态性；(d)诱导培养的DPMSCs以分化；和(e)通过比较具有正常基因型的DPMSCs 显示的分化方式与具有鉴定的遗传多态性的DPMSCs显示的分化方式来表征与遗传多态性 相关的异常代谢过程。在另一个方面，本发明提供在需要其的个体中治疗癌症的方法，其如下实施(a) 从遗传上改变DPMSCs以表达杀肿瘤蛋白、抗血管生成蛋白或在癌细胞表面上表达的蛋白 和与对抗原的免疫应答刺激相关的蛋白；和(b)将有效地使癌细胞的生长停止或根除癌细 胞的量的从遗传上改变的DPMSCs导入到个体中。在另一个方面，本发明提供测定对生物或药理剂的细胞反应的方法，其如下实施 (a)从统计学上显著的个体群体分离DPMSCs ;(b)从统计学上显著的个体群体扩大DPMSCs 以建立多个DPMSC培养物；(c)将DPMSC培养物与一个或多个生物或药理剂接触；(d)鉴定 对一个或多个生物或药理剂的一个或多个细胞反应；和(e)比较DPMSC培养物的一个或多 个细胞反应以测定对生物或药理剂的细胞反应，该DPMSC培养物来自统计学上显著的群体 中的个体。在另一个方面，本发明提供在需要其的个体中治疗失明的方法，包括对个体施用 有效量的来自DPMSCs的视神经视网膜细胞。在一个实施方式中，失明与以下中的任何一个 或多个相关视神经视网膜病、黄斑变性、糖尿病性视网膜病、青光眼或色素性视网膜炎。在 另一个实施方式中，在遗传上修饰DPMSC以选择性地表达改善个体中失明的内源基因或转基因。在另一个方面，本发明提供在需要其的个体中治疗牙周病的方法，包括对个体施 用有效量的牙龈样物质，其中牙龈样物质来自DPMSCs。在另一个方面，本发明提供在需要其的个体中辅助植皮术和整形外科的方法，包 括对个体施用有效量的皮肤上皮组织，其中皮肤上皮组织来自DPMSCs。在另一个方面，本发明提供离体产生人造血细胞或血细胞的方法，包括以诱导 DPMSCs分化成造血细胞或血细胞的方式培养DPMSCs。
在另一个方面，本发明提供用于提供治疗辅助以在需要其的个体治疗心脏病的方 法，包括对个体施用有效地改善心力衰竭的量的来自DPMSCS的心肌细胞。在一些实施方式 中，心脏病选自心肌炎、心肌病、心力衰竭、由心脏病发作引起的损伤、高血压、动脉粥样硬 化和心脏瓣膜功能障碍。在另一个方面，本发明提供用于提供治疗辅助以在需要其的个体治疗神经疾病的 方法，包括对个体施用有效地辅助神经变性疾病的改善的量的DPMSCs或来自DPMSCS的神 经元相关的分化细胞。在一些实施方式中，神经疾病选自中风、阿尔茨海默氏病、帕金森氏 病、杭廷顿氏舞蹈病、AIDS伴随的痴呆、脊髓损伤和侵袭脑和或其它神经的代谢病。在另一个方面，本发明提供用于提供治疗辅助以在需要其的个体治疗关节或软骨 疾病的方法，包括对个体施用有效地辅助软骨变性疾病的改善的量的DPMSCs、来自DPMSCs 的软骨细胞或来自DPMSCs的成骨细胞。在一些实施方式中，关节或软骨疾病选自软骨撕 裂、软骨减薄、骨性关节炎、骨折、未愈的骨折、骨性关节炎和由播散到骨的癌性肿瘤引起的 骨中的孔穴。在另一个方面，本发明提供用于提供多能起源干细胞的基因概况数据库以辅助药 物发现的方法，其如下实施(a)测定来自至少一个个体的DPMSCs的基因概况，其中该基因 概况包括至少一个基因；和(b)在可取得的介质上储存基因概况(或多个)。发明详述本发明提供组合物、DPMSCs的分离方法、诱导细胞特定的分化的方法和由自其产 生的细胞群体。更具体地，本发明涉及DPMSCs的分离群体，它是高度同质的，从而显著百 分比或比例的DPMSCs群体共表达以下标记CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD49d、CD59、 CD73、CDw90、CD105、Oct-4 同种型 A 和 B、Nanog、Sox-2 和 SSEA-4，这样，在相同的群体内， 群体中低百分比的细胞表达CD34和CD45。高度同质的DPMSCs群体具有分化形成内胚层、 中胚层和外胚层的许多种细胞谱系的细胞的潜能。I. 一般技术本发明的实践将利用，除非另外指明，干细胞生物学、细胞培养、分子生物 学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术 是本领域的技术内的。文献中充分地说明了这样的技术，诸如，Molecular Cloning ALaboratory Manual, third edition(Sambrook et al. ,2001)Cold Spring Harbor Press ；Oligonucleotide Synthesis(P. Herdewijn, ed. ,2004) ；Animal Cell Culture(R. I. Freshney), ed. ,1987) ；Methods in Enzymology(Academic Press, Inc. ) ；Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir & C. C. Blackwel1, eds. ) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller&M. P. Calos, eds.,1987) ；Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel et al. , eds. ,1987) ；PCR :The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al. , eds. ,1994) ；Current Protocols in Immunology (J. E.Coligan et al. , eds. ,1991)Short Protocolsin Molecular Biology(Wiley and Sons,1999), Embryonic Stem Cells :A Practical Approach(Notaranni et al. eds., Oxford University Press 2006) ；Essentials of Stem Cell Biology(R. Lanza, ed., Elsevier Academic Press 2006) ；Stem Cell Assays(Methods in Molecular Biology) (Mohan C. Vemuri, Ed. , Humana Press ；first edition(August 10,2007) ；MesenchymalStem Cells :Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology) (DarwinJ. Prockop, Donald G.Phinney, Bruce A. Bunnell, Eds.，first edition(March 7,2008))； Handbook of Stem Cells (Robert Lanza, et al.，Eds.，Academic Press (September 14,2004) ；Stem Cell Culture Vol 86 :Methods in Cell Biology(Jennie P.Mather, Ed. , Academic Press，first edition(May 15,2008)) ；Practical Hematopoietic Stem Cell Transplantation(Andrew J.Cant, et al. Eds.，Wiley-Blackwell, first edition(January 22,2007)) ；Hematopoietic Stem Cell Protocols (Kevin D. Bunting, Ed.，Humana Press,2nd ed. edition(January 31,2008)) ；Bone Marrow and Stem Cell Transplantation(Methods in Molecular Medicine) (Meral Beksac, Ed.，Humana Press ；first edition(May 3,2007)) ；Stem Cell Therapy and Tissue Engineering for Cardiovascular Repair :From Basic Research to Clinical Applications(Nabil Dib，et al.，Eds.，Springer，first edition(November 16,2005)) ；BloodAnd Marrow Stem Cell Transplantation :Principles， Practice， And Nursing Insights(Kim Schmit-Pokorny (Author)and Susan Ezzone (Editor), Jones & Bartlett Publishers ； third edition(May 22，2006)) ；Hematopoietic Stem Cell Protocols(Christopher A.Klug and Craig T. Jordan,Eds. , Humana Press ；first edition(December 15,2001))； 禾口 Clinical Bone Marrow and Blood Stem Cell Transplantation(Kerry Atkinson，et al. , Eds. , Cambridge University Press ；third edition(December 8,2003))。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术 人员通常理解的相同的意义。如果该部分提出的定义与通过引用并入本文的专利、公开的专利申请和其它出版 物提出的定义相反或在其它方面不一致，在该部分提出的定义胜过通过引用并入本文的定 义。II.定义如本文所用，术语“来自牙髓的干细胞(DPSC) ”、“来自牙髓的祖细胞”、“牙髓髓相 似细胞”(DPMSC)可交换地使用，指高度同质的细胞群体，它在一组某些标记的共表达中是 相当一致的CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CDw90, CD105、Oct-4 同种 型A和B、Nanog、Sox_2、SSEA-4、CDiM和CD45。应理解为，除了上面的名单，其它的标记能 在DPMSCs上表达。如本文所用，术语DPMSCs的“高度同质的”和“同质的”群体指在一组某些标记的 共表达中是相当一致的 DPMSCs 群体CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、 CDw90、CD105、Oct-4 同种型 A 和 B、Nanog、Sox_2、SSEA-4, CD34 和 CD45。在一方面，显著 百分比或比例的本发明的DPMSCs群体共表达以下标记⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49a、 CD49d、CD59、CD73、CDw90、CD105、Oct-4 同种型 A 和 B、Nanog、Sox-2 和 SSEA-4，另外，在相 同的群体内，群体中低百分比的细胞表达⑶；34和⑶45。共表达本文描述的标记谱(marker profiles)的 DPSMCs 群体的百分比可以是约 40 %、50 %、60 %、70 %、75 %、80 %、85 %、 90 %、95 %、98 %或99 %中的任一个。在一些方面，共表达本文描述的标记谱的DPSMCs群体 的百分比可以是约 40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或 99% 中的 至少约任一个。为了培养、增殖或分化的目的，能将DPMSCs群体装到容器中，该容器不仅包括标准的细胞培养器皿，还包括本领域的技术人员将用来培养DPMSCs的基质和其它的材 料。如本文所用，术语多能DPMSCs的“群体”或“分离群体”指已被处理以提供基本 上无另外组分的细胞制备物的一种或多种的DPMSCs群体。在一些方面，按重量、体积或数 量计，细胞制备物至少约60%无产生或培养细胞时存在的其它组分。在各种不同的方面， 按重量、体积或数量计，细胞至少约75%、或至少约85%、或至少约90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、或至少约98%、或至少约99%是纯的。在一些方面，百分比指在细 胞培养物或群体中干细胞的百分比。举例来说，DPMSCs群体或分离群体能，例如，通过从天 然来源纯化，例如通过机械或物理或化学提取、荧光激活细胞分选术或熟练的技术人员已 知的其它技术获得。纯度能通过任何适当的方法，诸如荧光激活细胞分选术(FACQ或通过 目测测定。如所使用的以描述干细胞纯度的“纯度”不是指在组合物中只有干细胞的存在，而 是指已经处理干细胞，这样已将它们从其天然的组织环境中去除，和指它们与在所得的群 体中存在的其它细胞的关系。如本文所用，术语“多能的”指DPMSC分化成三个胚层内胚层(例如内部胃粘膜、 胃肠道、肺)、中胚层(例如肌肉、骨、血液、尿生殖管)或外胚层(例如表皮组织和神经系 统)的细胞的潜能。多能干细胞能产生任何胎儿或成体细胞类型。它们单独不能发育成胎 儿或成体动物，因为它们缺少对胚外组织有贡献的潜能(例如体内胎盘或体外滋养层)。“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方式中，脊椎动物是哺乳动 物。哺乳动物包括但并不限于灵长类(包括人类和非人灵长类)、宠物(例如狗、猫、兔子 等)、农业动物(例如奶牛、家畜等)、运动动物(例如马)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。 在某些实施方式中，哺乳动物是人。“治疗(treatment) ”或“治疗(treating) ”指用于获得包括临床效果在内的有益 或期望的效果的方法。对于本发明的目的，有益的或期望的结果包括但并不限于与病症相 关的症状的减轻、与病症相关的一个或多个症状的程度的减小、或与病症相关的症状恶化 的阻止。在一些方面，用一种或多种本文公开的细胞的治疗较目前可用的治疗没有伴随或 伴随较少的副作用。“接受治疗”包括最初的治疗和/或持续治疗。如本文所用，“延缓”疾病或病症的发展指推迟、阻碍、减慢、阻碍、稳定和/或延迟 疾病或病症的发展。该延缓可以是改变的时间长度，取决于被治疗的疾病和/或个体的历 史。对本领域的技术人员来说是明显的是，充分的或显著的延缓实际上能包括预防，因为个 体不发展疾病或病症。例如，当与不使用该方法相比时，该方法可在给定的期限里减小疾病 发展的概率和/或在给定的期限里减小疾病的程度。在一些方面，这样的比较是基于使用 统计学上显著数量的个体的临床研究。疾病发展可以是使用标准的临床技术可检测的。发 展还可指疾病进展，它可以是最初不能检测的，包括发生、复发和发病。“有效量”(当在治疗或预防背景中，或在减轻疼痛或减轻特定病症的症状的背景 中使用时)是足以引起包括临床效果在内的有益或期望结果的量。能在一个或多个施用中 给予有效量。对于本发明的目的，DPMSCs的有效量是细胞的一定量，其能减少正被治疗的 个体病症的症状中的一个或多个。DPMSCs的有效量包括当DMPSCs正在以其多能的、未分化的状态生长或增殖时的DPMSCs的使用，以及当DMPSCS已被进一步培养以诱导它们向着特 定途径(例如神经的、心肌细胞、软骨细胞等)分化时DPMSCs的使用。当在“辅助治疗”的 背景中使用时，有效量增强治疗方案(与缺少DPMSCs的方案相比)，象这样，提供有益或期 望的效果。如本文所用，“需要其(in need thereof) ”包括具有病症或疾病或在病症或疾病 “危险中”的个体。如本文所用，“在危险中”的个体是在病症发展的危险中的个体。“在危 险中”的个体可或可不具有可检测到的疾病或病症，和在本文描述的治疗方法之前可或可 没显示可检测到的疾病。“在危险中”指个体具有一个或多个所谓的危险因素，这些危险因 素是与疾病或病症的发展相关的可测量的参数，并是本领域已知的。具有这些危险因素中 的一个或多个的个体较没有这些危险因素(或多个)的个体具有较高的发展疾病或病症的 概率。这些危险因素包括但并不限于年龄、性别、饮食、先前的病史、先前疾病的存在、遗传 的(即遗传性的)考虑、交配方案和考虑，和环境暴露。“药学上可接受的载体”指当与有效成分组合时，基于熟练的执业医师的知识，允 许该成分保留生物活性和不引起不能接受的免疫应答(例如严重的变态反应或过敏性休 克)的任何材料。例子包括但并不限于标准的药用载体诸如羧甲基纤维素(CMC)、磷酸 盐缓冲盐水溶液、水、乳剂诸如油/水乳剂，各种类型的湿润剂中的任一种。用于气雾剂 或胃肠外给药的示例性的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水或生理盐水(0.9%)。用于细胞输注 的示例性的载体是CMC。包括这样的载体的组合物是用熟知的常规方法配制的(参见， 例如，Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed. , Mack Publishing Co.,Easton,PA, 1990 ；禾口Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing，2000，它们每一个在此以其全部通过引用被并入，特别地关于 配制)。通常提到“该组合物”或“组合物”包括和适用于本发明的组合物。本发明还提供 包括本文描述的组分的药物组合物。如本文所用，除非另外表明，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the) ”包括复 数的指示物。例如，“一(a)” DPMSC包括一个或多个牙髓髓相似细胞。提到“约”，值或参数本文包括(和描述)涉及那个值或参数本身的方面。例如，提 到“约X”的描述包括“X”的描述。应理解为本文描述的方面和本发明的方面包括“包括(comprising)”、“组成 (consisting)，，方面禾口“基本上由方面组成(consisting essentially of)，，。III.牙髓髓相似细胞(DPMSCs)群本发明提供同质的牙髓髓相似细胞(DPMSCs)群，其能分化成来自多个层(例如外 胚层、中胚层和内胚层)的许多类型的细胞。这些细胞显示出分化成来自身体不同层的多 个类型细胞的能力的巨大可塑性。DPMSCs显示类似于胚胎干细胞的分化表型。本文描述的 本发明的细胞具有分化形成中胚层、外胚层和内胚层来源的至少一个、两个或三个分化的 细胞类型的能力。鉴于相对高百分比的表达特定标记的细胞群(或相对低百分比的不表达 其它特定标记的细胞群)，本发明的DPMSCs群体的表型较本领域中描述的其它干细胞培养 物更同质，所述其它干细胞培养物往往是相当异质的，因为，就整体而言，那些干细胞群显 示宽的表型变化。
A.来自牙髓的DPMSCs能通过使用用于培养的牙髓的起始来源获得DPMSCs。在本发明的一个方面，牙髓 的来源可以来自儿童(例如作为失去乳牙的一部分而失去的牙)。在本发明的另一个方面， 牙髓的来源可以来自失去乳牙之后生长的恒牙。在另一个方面，起始来源可来自牙器官。在 一方面，脱落的牙髓单核细胞来自牙髓。能从任何脊椎动物获得本发明的DPMSCs。在本发明的一个方面，从哺乳动物诸如 人获得DPSMCs。在本发明的其它方面，从非人获得DPMSCs。在本发明的其它方面，DPSMCs 从灵长类(包括人类和非人灵长类)、宠物(例如狗、猫、兔子等)、农业动物(例如奶牛、家 畜等)、运动动物(例如马)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在所有的情况下，没有人类 胚胎在获得本发明的DPMSCs的过程中被破坏。相应地，本发明提供人DPMSCs、非人DPMSCs、灵长类DPMSCs以及来自不同动物物 种的DPMSCs的组合物(例如群或分离群)。在本发明的一个方面，DPMSCs可以是牙髓的亚 群，从而，在本文描述的实验条件下，DPMSCs主要地和选择地增殖。在本发明的其它方面， 牙髓片和培养基之间的倾斜度能充当载体，其将细胞引向它们认为损伤位点的地方，这能 导致它们在培养皿中连续的和选择性的迁移。B. DPMSCs 的表型能用各种表型描述本发明的DPMSCs群。在一方面，能依据某些标记共表达中的同 质性描述DPMSCs群。这些标记可以在细胞表面上并通过本领域中的标准方法(例如流式 细胞术)检测到。可选地，DPMSCs群能用细胞内某些基因的表达来描述，并用本领域中的 标准检测(例如rt-PCR)来测量。在另一个备选中，还能用DPMSCs核型(例如正常核型) 或其生物学特性来描述DPMSCs。生物活性的非限制的例子包括细胞倍增时间、端粒末端转 移酶活性和分化能力。在本发明的一方面，能用本领域中的标准试验(例如FISH)测量DNA含量。能用 本领域中的标准试验(例如TRAP-检测/TRAPeze试剂盒)测定端粒末端转移酶活性的检 测。在本发明的另一个方面，能用本领域中的标准试验(例如Von Kossa、核固红(Nuclear Fast Red))染色细胞。能用本领域中的标准试验(例如碱性磷酸酶染色)测量碱性磷酸酶 活性。在本发明的另一个方面，能用本领域中的标准试验(例如过碘酸-Schiff染色)检 测糖原。能用本领域中的标准试验(例如ELISA)测定白蛋白浓度，能用本领域中的标准试 验(例如QuantiChromTM尿素试验)测定尿素浓度。在实施例2中能发现这里描述的标准 试验的详述。相应地，在一方面，本发明的DPMSCs群在标记，诸如，但不限于CD10、CD13、CD29, CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CD90、CD105、0ct-4 同种型 A 和 B、Nanog、Sox_2 和 SSEA-4 的共表达中是同质的。同质性(homogeneity)指在给定的DPMSCs群内表达相同标记谱的 细胞百分比。在一些方面，本发明提供同质的DPMSCs群，其中群体中约40 %、50 %、60 %、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98% 或 99% 的细胞共表达 CD10、CD13、CD29、CD44、 CD49a、CD49d、CD59、CD73、CD90、CD105、0ct-4 同种型 A 和 B、Nanog、Sox_2 和 SSEA-4。在其 它的方面，本发明提供同质的DPMSCs群，其中群体中至少约40%的细胞共表达⑶10、⑶13、 CD29、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CD90、CD105、Oct-4 同种型 k 和 B、Nanog、Sox-2 和 SSEA-4。优选地，DPMSCs群是同质的，达到这样的程度，群体中至少约50 %、至少约60 %、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98% 或至少约 99% 的 DPMSCs 共表达 CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CD90、 CD105、Oct-4 同种型 A 和 B、Nanog、Sox-2 和 SSEA-4。在其它的方面，约 90-99% 的 DPMSCs 群共表达这些标记。在另一个方面，DPMSCs群中低百分比(例如< )的细胞显示标记诸如⑶34和 ⑶45的表达。在相同的同质群中，其中显著百分比或比例(例如至少约90%)的DPMSCs群 共表达 CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CD90、CD105、0ct-4 同种型 A 和 B、 Nan0g、S0X-2和SSEA-4，14-20个细胞倍增之后获得的低百分比或比例(例如0. 25%-1%) 的人DPMSCs群具有⑶34和⑶45的表达。在本发明的另一个方面，DPMSCs群中低百分比 的细胞表达 CD66e、KDR、CD133、VE-Cad 和 CD117。本发明者发现DPMSC群表达的SSEA-4与其它的免疫组织化学和细胞荧光测定一 致，这显示以2-107cm2接种密度生长的人DPMSCs解冻之后表达SSEA-4 (KannagiR、EMBO J. 2 :2355-61,1983)。在本发明的另一个方面，DPMSCs群还表达信使RNA表达的某些概况。能通过 rt-PCR对DPMSCs群的进行分析以测定增殖期期间信使表达。能在本发明的DPMSC群中 检测到的信使表达的非限制的例子包括0ct-4、MDR-U Abcg-2、Msx_2、PPAR- γ , c_Met、 CK-19、碱性磷酸酶、骨钙素、骨结合素、BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMPr-Ia、BMPr-Ib、Cbfa-II 型、 Cbfa-III 型、Dlx-5、胶原 I、FGFr-I、FGFr-II、聚集蛋白聚糖、dermo-I、牙基质蛋白、G-Fap、 磷脂酰肌醇[蛋白]聚糖、β 3微管蛋白、轻、中、重分子量的神经丝、NSE、武藏(musashi)、波 形蛋白、N-nos、ASA、SMA、心肌动蛋白、心肌素(myocardin)、ANP、Gata-4、Nkx_2. 5、Mef_2a、 c-Tnl和肌球蛋白重链。另一方面，DPMSCs群表达最低水平至没有水平的MHC-α ,MHC-β、 KDR、TRT、骨桥蛋白、BMPr-II、胶原II、Map_2、V-Mlc和cTnT的信使RNA。在本发明的一个 方面，DPMSCs群共表达以下中每一个的mRNA Oct-4同种型A和B、Nanog、Sox-2, SSEA-4、 c-Myc、Klf_4 和 Rex-I。表征本发明的DPMSCs群的另一个方式是通过蛋白表达。能测定蛋白表达的一个 方式是通过增殖期DPMSCs的免疫荧光。能在本发明的DPMSCs群中检测的蛋白表达的非限 制的例子包括聚集蛋白聚糖、胶原I、FGFr-I, FGFr-II, c_TnT、胶原II、SMA、轻分子量神 经丝、G-Fap, NSE、VWF、Cbfa-I、Gata-4、Msx_2、Neuro D、Nanog、Oct-4, SSEA-4 免疫印迹 也能被用于测定增殖期期间DPMSCs的蛋白表达。能在本发明的DPMSCs群中检测的蛋白表 达的非限制的例子包括ASA、Serca, β 3微管蛋白、突触囊泡蛋白、Msx_2、0ct_4、连接蛋白 43, Dlx-5, Neuro-D, Ca 通道和 Cbfa-I。DPMSCs表达POU结构域转录因子0ct_4的mRNA，它是维持胚胎干(ES)细胞/胚 胎癌(EC)细胞的未分化状态所需要的。Oct-4是在原肠形成前期胚胎、早期卵裂期胚胎、 胚泡的内细胞团的细胞和胚胎癌(EC)细胞中表达的转录因子(Nichols J,et al Cell95 379-91，1998)，当细胞被诱导分化时，其被下调。0ct_4的表达在测定胚胎发生和分化中的 早期步骤中发挥重要作用。Oct-4与Rox-I结合引起Si指蛋白Rex-I的转录激活，Rex-I也 是维持 ES 未分化所需要的(Rosfjord E,Rizzino A. ,Biochem Biophys Res Commun 203 1795802,1997 ；Ben-Shushan E, et al, Mol Cell Biol 18:1866-78,1998)。此外，需要在 ES/EC中，但也在其它更加分化的细胞中表达的Sox-2与Oct-4 —起来保持ES/EC的未分化状态(Uwanogho D.，et al.，Mech Dev 49 :23-36,1995)。本发明的人DPMSCs表达SSEA-4和用SSEA-4染色阳性。超过40个细胞倍增，在 人DPMSCs培养物中0ct_4蛋白水平趋于降低，未受理论限制，其结果可归因于未分化表型 的部分丢失。因此，与SSEA-4结合的Oct-4的存在是与DPMSC培养物中最原始细胞的存在 相关的标记。取决于从来自牙髓来源的培养的开始已发生倍增的多少，本发明的DPMSCs显示 不同的增殖速度。相应地，在一方面，本发明包括DPMSCs分离群，对于最初的十个细胞倍 增，其具有约30-40小时的平均倍增时间。对于DPMSCs群最初的十个细胞倍增，平均倍增 时间可以是约30、31、32、33、34、；35、36、37、38、39或40小时。在一个实施方式中，对于最初 的十个细胞倍增，倍增时间是约36小时。最初的十个细胞倍增之后，细胞倍增时间可以是 约28小时，直到约30-35个细胞倍增，然后速度此后缓慢地降低。本发明的DPMSCs包括 DPMSCs分离群，对于DPMSCs的增殖，如在培养时间内所平均的，其具有25-40小时的平均倍 增时间。在本发明的另一个方面，平均倍增时间可以是在1. 25-2. 5%人血清培养基中约观 小时，在0. 25-0. 5%人血清培养基中约四或30小时。启动最初培养细胞的估计的数目可 以是约80至800。本发明的DPMSCs群能作为未分化的、多能DPMSCS增殖持续至少一个月，优选地约 两个月，甚至更优选地约三个月或更长。可选地，从来自牙髓来源的培养的开始后，本发明 的DPMSCs群能作为未分化的、多能DPMSCS增殖持续至少约10个倍增，优选地至少约20个 倍增，甚至更优选地至少约30、40、50、60或更多个倍增。本发明还包括已从冷藏的DPMSCs 生长的DPMSCs群。在本发明另一个方面，与作为端粒活性测量的内对照相比，DPMSCs群体还显示端 粒长度的减少。如在作为本发明的一个实施方式的实施例中所进一步描述的，来自两个供 体(年龄6岁)的、以2 X IO3细胞/cm2的再接种密度培养的DPMSCs的端粒长度是10_201Λρ 之间。估计内对照1301细胞系的端粒长度是100%。与对照相比，DPMSCs的平均端粒长度 是18. 4% Ρ2和17. 1% Ρ5(解冻之后)。相应地，本发明的DPMSCs包括DPMSCS的分离群， 其具有小于对照细胞系75%的端粒长度，优选地小于约65%，优选地小于约55%和更优选 地小于约45%。本发明的DPSMCs群具有分化成外胚层、内胚层或中胚层谱系的一个或多个(诸如 两个或所有三个)细胞类型的能力。在另一个方面，本发明的DPMSCs群具有分化成以下中 的任何一种或多种的能力成骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经胶质细胞、 神经元细胞和肝细胞。在另一个方面，本发明的DPMSCs群具有分化成以下中的任何一种或 多种的能力骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经胶质细胞、神经元细胞、皮肤 上皮细胞、肝上皮细胞、胰上皮细胞、胰内分泌细胞、胰岛细胞、胰外分泌细胞、肠上皮细胞、 肾上皮细胞、表皮相关的结构、毛囊、包围牙齿的软组织、牙本质(牙齿)、釉质(牙齿)和牙 骨质(牙齿)。如在上面的部分和本文别处所描述的，本发明考虑任何和所有上面的参数， 以任何组合来描述和表征DPMSCS。IV.分离和/或培养牙髓髓相似细胞的方法可使用本发明的方法从上面所描述的牙髓来源开始培养本文所描述的分离的牙 髓髓相似细胞(DPMSCs)。牙髓可以是酶促解集的或非酶促解集的(例如解集分离)。在一方面，不对解集的混合的细胞群进行任何类型的耗竭技术(例如免疫耗竭或物理或化学 耗竭)。在另一个方面，该方法不包括耗尽表达以下标记⑶3、⑶14、⑶19、⑶38、⑶66b和 CD45+血型糖蛋白A的细胞(例如单核细胞)。然后能将细胞平板接种到，例如，一个或多个任何类型的培养器皿中，诸如塑料培 养皿，并保持在添加了各种生长因子的增殖培养基中。生长因子可选自血小板衍生的生长 因子(例如PDGF-BB)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子b(FGF-b)、胰岛素样生 长因子(IGF)、胰岛素、地塞米松、亚油酸、抗坏血酸和硒以获得DPMSCs群。在一个实施方 式中，可向培养基添加所有这些组分。在一个实施方式中，在实施例中描述了增殖培养基， 这里指在Mid-free培养基中。能使用的生长因子包括但并不限于l-50ng/ml (优选地约 5-15ng/ml)血小板衍生的生长因子BB(PDGF-BB)、l_50ng/ml (优选地约5_15ng/ml)表皮生 长因子(EGF)、l-50ng/ml (优选地约5-15ng/ml)胰岛素样生长因子(IGF)、50ng/ml (优选 地约5-15ng/ml)成纤维细胞生长因子b (FGF-b)，具有10,至10_1地塞米松或其它适当的 类固醇、0-1 μ g/L亚油酸和10-50mg/L抗坏血酸。在本发明的另一个方面，本发明的DPMSCs在包括约10至约50 μ g/ml浓度的胰岛 素、大于0但小于约10 μ g/ml浓度的转铁蛋白、约0. 1至约5 μ g/ml浓度的硒、约0至约 1 μ g/m浓度的亚油酸、约0. 005至0. 15 μ M浓度的地塞米松、约10_50mg/L浓度的L-抗坏 血酸、约5至约15ng/ml浓度的血小板衍生的生长因子、1至约15ng/ml浓度的表皮生长因 子、1至约15ng/ml浓度的胰岛素样生长因子和约15ng/ml浓度的成纤维细胞生长因子bl 的培养基中培养。在本发明的另一个方面，本发明的DPMSCs在由增殖培养基组成的培养基中培养， 该增殖培养基含有F-12C00n改良的/Ambesi改良的/培养基199/CMRL 1066，添加了约 1. 25%人血清、浓度约1至约50ng/ml的血小板衍生的生长因子BB、浓度约1至约50ng/ml 的表皮生长因子、浓度约1至约50ng/ml的胰岛素样生长因子I和浓度约1至约50ng/ml 的成纤维细胞生长因子、浓度约10,至约10_8M的地塞米松、浓度约20至约100 μ g/L的亚 油酸、浓度约10至约50mg/L的抗坏血酸和浓度约0. 5ml/L的庆大霉素。在本发明的另一 个方面，将DPMSCs放在，任选地解离的，含有浓度约1000U/mL的胶原酶II和CTC溶液的培 养基中。该CTC溶液含有体积百分数约0. 5%的胰蛋白酶、浓度约22U/mL的胶原酶II和体 积百分数约0.2%的鸡血清。在本发明的另一个方面，不将细胞的牙髓群进行任何类型的耗 竭技术(例如免疫耗竭或物理或化学耗竭)，当原代培养中的集落发展达到汇合时，能将细 胞用CTC溶液分离并在增殖培养基中传代培养。将培养保持半汇合以防止细胞分化。在一个备选中，能将DPMSCs放在具有细胞外基质(ECM)底物的细胞培养容器中。 在另一个备选中，能将DPMSCs放在没有细胞外基质(ECM)底物的细胞培养容器中。在另一 个备选中，能将DPMSCs放在细胞培养容器中，以至于它定居和形成三维结构。如本领域的 技术人员所知的，三维结构诸如支架(包括生物支架)能用于培养DPMSCs和/或将DPMSCS 分化成细胞和/或组织。例如，能将DPMSCs与支架培养以生长气管、血细胞、脑组织、肾、胰、 肝、心、肺、脊髓、神经(或多个)、神经细胞、神经元、软骨、骨和能在再生医学中使用的其它 细胞和/或组织。在低血清培养基中的培养优选将细胞维持在未分化状态。根据被分离的DPMSCs 的物种，血清可以是人血清或非人血清。人血清可以是自体的。如本文所使用的低血清指体积百分数约0. 5-2. 5%的水平。在一方面，本发明提供分离DPMSCs和随后增殖其的方法，包 括加入含有胰岛素、硒、亚油酸、地塞米松和血小板衍生的生长因子的低的1. 25%人血清培 养基。低人血清培养基可以是与M-199和CMRL-1066混合的F12。胰岛素可任选地以约1 至约5μ g/ml的浓度存在。低血清培养基可含有有效量的转铁蛋白，其浓度大于0但小于约 10μ g/ml，硒可以约0. 1至约5 μ g/ml的浓度存在，亚油酸可以约0至约1 μ g/m的浓度存 在，地塞米松可以约10,至10_8M的浓度存在。低血清培养基可含有约10-50mg/L的L-抗 坏血酸。低血清培养基可含有约5至约15ng/ml的血小板衍生的生长因子、1至约15ng/ml 的表皮生长因子、1至约15ng/ml的胰岛素样生长因子和1至约15ng/ml的成纤维细胞生长 因子b。本发明还考虑添加上面列出的生长因子组分中的任何一种或全部的无血清培养基 的使用。干细胞领域的技术人员能通过使用本文描述的培养基条件常规地培养本发明的 DPMSCS用于增殖。一旦在培养中建立了，能将细胞冷冻和贮存为冻存物。在一个实施方式 中，使用具有10% DMSO的本文描述的增殖培养基冷冻和贮存细胞。制备培养的细胞的冻存 物的其它方法也是本领域技术人员已知的。除了培养DPMSCS用于增殖外，还能将DPMSCS 群在添加了其它因子的培养基中培养以诱导分化成后代细胞。本发明还包括通过本文描述的培养方法(或多种)产生的DPMSC群。本发明还包 括在本文描述的条件下培养的细胞，包括最初培养的(例如，导入到培养基之后)和在培养 过程的任何点培养的细胞。在本发明的另一个方面，通过本发明呈现的独特的扩大/选择方法能分离具有宽 分化潜能以及中胚层、内胚层和外胚层衍生谱系的牙髓细胞群，所述方法包括低百分比自 体人血清的使用。III.诱导DPMSCS分化形成定向祖细胞和组织特异性细胞类型和其用途本发明进一步提供来自本文描述的多能DPMSCs的分化的细胞以及诱导这些细胞 分化的方法。在一方面，本发明包括能分化成脏壁中胚层细胞、肌肉细胞、神经元细胞、心 肌细胞和肝细胞中的任何一种或多种的DPMSCs。在另一个方面，本发明包括能分化成骨细 胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经胶质细胞、皮肤上皮细胞、肝上皮细胞、胰上皮 细胞、胰外分泌细胞或胰岛细胞、胰内分泌细胞、肠上皮细胞、肾上皮细胞或表皮相关的结 构(例如毛囊)中的任何一种或多种的DPMSCs。在另一个方面，本发明包括能分化成后代 细胞的DPMSCs，该后代细胞能形成包围牙齿的软组织或可形成牙齿(例如牙本质、釉质和 牙骨质)。在另一个方面，本发明包括能分化成成骨细胞和肌细胞中的任何一种或多种的 DPMSCs。本发明还提供如本文所描述的分离的多能DPMSCs，其中细胞的基因组还未通过预 选择的分离的DNA的插入、用预选择的分离的DNA替代细胞基因组的区段、或通过细胞基因 组的至少部分缺失或失活而被改变。使用如本文所描述的和/或本领域的技术人员已知的适当的生长因子、趋化因子 和细胞因子，能将本发明的DPMSCs诱导分化形成许多细胞谱系，包括例如，中胚层来源的 各种细胞，以及来自神经外胚层来源(例如神经胶质细胞、少突胶质细胞和神经元)和内胚 层来源(例如肝细胞)的细胞。本发明包括这些方法。A.脏壁中胚层
可通过使用本发明的同质DPMSCs群长成脏壁中胚层。在一个实施方式中，为了长 成成骨细胞，能用约10_6至IO-8M(优选地约IOOnM)地塞米松、β -磷酸甘油和0. 5_3mM(优 选地ImM)抗坏血酸培养20，000细胞/cm2的DPMSCs。为了证明成骨细胞的存在，约3个月 的培养之后，能使用Von Kossa染色(CaPo4的银还原)，或抗骨结合素、骨桥蛋白和骨钙素 的抗体(免疫组织化学/Western/rt-PCR)。还能使用X线衍射图形和红外光谱来评价羟基 磷灰石形成的存在。B.肌肉在分化诱导之前通过平板接种汇合的DPMSCs能诱导DPMSCs经历分化成任何肌肉 表型。在一方面，为了诱导肌肉细胞分化，能用具有IBMX 0. l-lmM(优选地0. 5mM)和VEGF 5-20ng/mL (优选地 10ng/mL)的 DMEM 5% FBS 处理约 10，000 细胞 /cm2DPMSCs 细胞。能 使用蛋白质印迹和免疫荧光评价分化。能通过检测肌形成蛋白、辅肌动蛋白、骨骼肌动蛋白 和骨骼肌球蛋白的相继激活——通过使用本领域技术人员已知的标准技术和商业上可获 得的抗体的免疫组织化学或蛋白质印迹分析——而证明体外骨骼肌分化。在早到诱导之后 15天能检测到骨骼肌动蛋白、肌浆网/内质网钙离子ATP酶(Serca) 2a、Ca通道和Msx_2， 在40天能检测到骨骼肌球蛋白。通过免疫组织化学，14天之后，约70-80%的细胞能表达 成熟肌肉蛋白。在15天的培养期间，用分化培养基的处理能导致ASA、Ca通道、SMA、c-TnT、 连接蛋白43、feita-4、肌球蛋白重链、肌形成蛋白、Nkx-2. 5、N-caderin、Serca-2aATP酶的 表达。此外，在40天时，能组织骨骼肌球蛋白和与ASA共表达，如辅肌动蛋白。平滑肌肌动 蛋白能在诱导两天之后检测到并持续。兰诺定受体可能不被表达。C.神经元细胞能将DPMSCs诱导以经历分化到神经元细胞。如实施例中一个实施方式所进一步 描述的，通过在神经分化培养基中培养DPMSCs能诱导神经发育。神经分化培养基能诱导极 限必需培养基，诸如DMEM-HG。神经分化培养基典型地含有一种或多种另外的添加剂，诸如 抗生素、生长因子、营养物或其组合。这样添加剂的特异的非限制的例子包括NT-3(从约 lng/ml 至约 100ng/ml)、NGF (从约 lng/ml 至约 100ng/ml)、BDNF (从约 5ng/ml 至约 500ng/ ml)、胰岛素(从约0. 1 μ g/ml至约10 μ g/ml)、IBMX (从约0. 1 μ M至约100 μ Μ)和吲哚美 辛(从约10 μ M至约500 μ Μ)。在另一个方面，该培养基能包括DMEM-HG、1 X ITS和FGF (例 如以约0.5-100ng/mL、优选地约lOng/mL)中的任何一种或多种。为了诱导分化成某些 细胞类型，该培养基还可含有以下细胞因子中的一种或多种用于获得多巴胺能神经元的 5-50ng/mL BDNF(优选地约16ng/mL)。诱导DPMSCs分化成神经细胞的生长因子的选择能 基于在神经系统的胚胎发育中所知道的或来自体外评价CNS分化的研究。在本发明的一个方面，神经特化通过在具有10% FBS的DMEM高葡萄糖中以约 3，000细胞/cm2温育DPMSC细胞而诱导。M小时之后用神经定向培养基替换该培养基，神 经定向培养基含有DMEM高葡萄糖、具有B27的10% FBS、约lOng/ml浓度的EGF、约20ng/ ml浓度的bFGF，持续15天。将细胞1 3传代并放在具有浓度约20ng/ml的NT-3、浓度约 20ng/ml的NGF、浓度约50ng/ml的BDNF、浓度约20 μ M的ΒΗΑ、浓度约50 μ M的ΙΒΜΧ、浓度 约1 μ M的ATRA和浓度约20ηΜ的孕酮的神经定向培养基中。在本发明的另一个方面，神经分化通过将神经定向细胞与神经分化培养基接触而 诱导，该神经分化培养基由DMEM、浓度约20ng/ml的NT-3、浓度约20ng/ml的NGF、浓度约50ng/ml的BDNF、浓度约5 μ g/ml的胰岛素、浓度约200 μ M的吲哚美辛和浓度约0. 5mM的 IBMX组成。神经定向DPMSC细胞在神经分化培养基中温育约1天。在本发明的一方面，能允许DPMSC细胞沉到培养皿的底部以形成3D结构。可期望 发生神经分化，例如，在37°C在95%空气、5% CO2的100%湿润的大气中。可在约4周检测 到神经分化。在本发明的另一个方面，神经诱导的DPMSC细胞的形态学非常类似成熟神经 元的形态学它们具有大量的神经突，从分化之后约3至约4周起增加，并具有显著的分枝。约2-4周之后，能检查细胞的培养以测定星形细胞和神经元的生长。能将星形细 胞识别为神经胶质-原纤维-酸性蛋白(glial-fibrilar-acidic-protein) (GFAP)阳性细 胞，能将少突胶质细胞识别为葡糖脑苷脂阳性(GalC)并将神经元识别为以连续的方式表 达NeuroD、微管蛋白IIIB (Tuji)、突触囊泡蛋白和神经丝68、160_200kDa的细胞。在一个非限制的实施例中，每个神经元的神经突的数目从分化之后2、3周至4周 起能从3士 1增加到5士 1和7士2。分化成具有神经元特征的细胞能通过用蛋白质印迹显 示GFAP、神经丝160、突触囊泡蛋白、β 3微管蛋白的存在而证实。免疫荧光的使用能显示突 触囊泡蛋白、Synapsyn I、神经丝160、β 3微管蛋白、N-caderin、酪氨酸羟化酶、Neuro-D、 N-钙黏着蛋白、神经丝68和NSE的存在。rt-PCR的使用能显示细胞表达β 3微管蛋白、神经丝_68、-160、_200kDa、波形 蛋白、NSE、β 3微管蛋白、G-Fap、磷脂酰肌醇[蛋白]聚糖、武藏、n-Nos，但不表达MAP-2。 特异地在脑中表达和能影响体内和体外神经发育其它生长因子包括脑源性神经营养因子 (BDNF)、胶质细胞衍生的神经营养因子(⑶NF)和睫状神经营养因子(CNTF)。BDNF是神经 生长因子家族的成员，它促进NSC、人室管膜下细胞和神经元前体体外分化成神经元和促进 体内海马干细胞的神经突突起。在一个非限制的实施例中，用5-20ng/mL(优选地16ng/mL) BDNF和EGF处理的DPMSCs能分化成酪氨酸羟化酶阳性神经元，与BDNF的已知功能一致以 支撑黑质多巴胺能神经元的存活。在本发明的一个方面，神经干前体标记，波形蛋白，在增殖和神经分化中均表达， 但在诱导期间，它较少地被组织。神经-内分泌核因子，Neuro-D/Beta-2只在增殖期间表 达。巢蛋白一一另一种神经丝神经干标记的表达从增殖到诱导阶段降低。分化之后β 3微 管蛋白在约99%的DPMSC细胞中表达。结构神经丝NF-160和NF-200只在分化期间表达， NF-160表达的阳性是约50%，而NF-200是较小的程度，这与成熟的神经表型一致。相比之 下，NF-68蛋白在增殖期间和神经诱导之后表达，如NSE所显示的。在本发明的另一个方面，突触小泡运输标记Synapsyn-I和突触囊泡蛋白在分 化之后在所有神经诱导的DPMSC细胞中表达，同时，只在诱导之后检测到酪氨酸羟化酶、 N-caderin和p75_NGFr的表达。不表达少突胶质细胞标记4。星形胶质细胞标记G-Fap，在 增殖和神经分化期间表达，但在诱导期间较少被组织。共表达GFAP和beta3_微管蛋白。D.心肌细胞心肌细胞能在分化的诱导之前通过平板接种汇合的DPMSC而获得。在一方面，为 了诱导心肌细胞细胞分化，汇合的(例如10，000细胞/cm2) DPMSC细胞能用具有FBS (从约
至约 10% )、IBMX(从约 0. ImM 至约 IOmM)和 VEGF(从约 lng/ml 至约 20ng/ml)的 DMEM HG来处理并在有利于分化的条件，例如，在37°C在95 %空气、5 % (X)2的100 %湿润的大气中 培养。心肌细胞分化能在2周至约3个月之间检测到。体外肌肉分化能通过检测辅肌动蛋白、骨骼和心肌动蛋白和骨骼肌球蛋白的相继激活——通过使用商业上可获得的抗体和特 异引物的免疫组织化学或蛋白质印迹和rt-PCR分析——而证明。ASA、Ca通道DHPR、SMA, c-TnT、连接蛋白43、Msx-2、肌球蛋白重链、Gata-4, Serca 2A的表达也能被测定为沿着心 肌细胞途径分化的指征。在本发明的另一个方面，能在分化的诱导之前通过以11，000细胞/cm2平板接种 DPMSC而实现分化成任何肌肉表型。为了诱导心肌细胞细胞分化，能用具有约5% FCS、浓度 约10ng/mL的bFGF、浓度约10ng/mL的VEGF和浓度约10ng/mL的IGF-I的DMEM处理汇合 的DPMSC细胞。能将细胞培养以达到汇合持续约2周至约3个月，每4天更换培养基。可期望发生心肌细胞分化，例如，在37°C在95%空气、5% CO2的100%湿润的大 气中。在本发明的一个方面，可在约2周至约3个月之间检测到心肌细胞分化。在该分化 期期间，细胞变长和不规则。增殖和分化期间能检测到心房钠尿肽(ANP)、平滑肌肌动蛋白 (SMA)、骨骼肌肌动蛋白(SKMA)、心肌动蛋白(CA)、心肌钙蛋白T(c-TNT)、MioCyte增强子因
和肌球蛋白重链(Mhc)的共表达。在本发明的另一个方面，Gata-4和Nkx_2. 5的mRNA表达水平在增殖和分化期都 低，而MsX-2m-RNA表达高。分化之后心肌素的表达降低。在本发明的另一个方面，细胞能 组织α-辅肌动蛋白、α-肌节肌动蛋白和肌球蛋白重链的丝。能在分化细胞的部分中共 表达和组织α-肌节肌动蛋白和肌球蛋白重链。在本发明的一个方面，能通过在靠近细胞对细胞接触位点处连接蛋白43的存在 证明缝隙连接。还能在分化的细胞中鉴定L型钙通道、krca-2ATP酶泵、c-TNT。增殖期 期间SMA能以高水平表达，诱导之后，表达降低而没有失去丝状结构。从增殖期到分化期， Msx-2的表达不断地降低，而心肌细胞诱导之后失去了 GATA-4表达。E.肝细胞在一方面，向肝细胞分化能通过在诱导分化之前用DMEM低葡萄糖FCS、 肝细胞生长因子(HGF)(从约lng/ml至约100ng/ml)、制癌蛋白(OSM)(从约lng/ml至约 100ng/ml)、烟酰胺(从约 ImM 至约 IOOmM)、LDL (从约 0. 1 μ g/ml 至约 10ng/ml)、FGF_4 (从 约lng/ml至约100ng/ml)、胰岛素(从约1 μ g/ml至约10 μ g/ml)、亚油酸(从约180 μ g/ L至约lmg/L)和葡萄糖(从约lg/L至约10g/L)平板接种汇合的(例如20，000细胞/cm2) DPMSC，并在有利于分化的条件下培养而实现。通过观察表达和分泌白蛋白的小上皮样细 胞，本领域的技术人员能确定到肝细胞的分化途径。此外，能检测细胞HGF受体、细胞角蛋 白19、六13(^-2、1 )1 -1、转铁蛋白、促生长素抑制素、红细胞生成素和细胞色素？-450亚基
的mRNA的表达。此外，白蛋白、尿素、细胞角蛋白-8-18-19、HNF-3 β和HNF-4 α的存在和 分泌也可表示可能分化为肝细胞。在本发明的另一个方面，肝细胞分化能通过温育汇合的DPMSCs与DMEM低葡萄糖 FCS、浓度约20ng/mL的肝细胞生长因子、浓度约lOng/ml的制癌蛋白、浓度约IOmM的
烟酰胺、浓度约1. 25 μ g/mL的LDL、浓度约10ng/mL的FGF-4、胰岛素(从约1 μ g/ml至约 10 μ g/ml)、浓度约0. 00018g/L的亚油酸和浓度约1. 25g/L的葡萄糖持续约14至约37天 而实现。可期望发生肝分化，例如，在37°C在95%空气、5% CO2的100%湿润的大气中，约 5周之后可检测到肝分化。在本发明的另一个方面，约14至约37天之后，分化的细胞能呈现具有偏心核的球形。增殖至分化期期间，这些细胞能显示白蛋白、转铁蛋白、促生长素抑制素、红细胞生成素 和细胞色素P-450亚基2el增加的表达，c-MET/HGF-r、Abcg-2、MDR-I持久的表达和细胞角 蛋白-19降低的表达。在本发明的另一个方面，与小的纤维状构造一起分化之后，对于肝上 皮特异的细胞角蛋白8、18和19，大百分比的细胞能被染成阳性。肝诱导之后，细胞能表达 肝细胞核因子4 α和3β。在另一个方面，细胞能获得几个肝细胞功能诸如如通过PAS染色 所证明的贮存糖原的能力和如通过测试培养上清中这些因子的浓度和剂量所检查的产生 白蛋白和尿素的能力。IV.含有DPMSCs或DPMSC分离和培养会目分的i式剂念能以试剂盒和适当的包装材料提供本发明的DPMSCS (和/或来自本发明的DPMSCS 的分化细胞)。例如，能将DPMSCS作为冻存物提供(在适当的保存培养基中，例如，如本文 所描述的)，伴随独立包装的适当的因子和培养基，如本文先前所描述的，用于在非分化状 态的培养。另外，还能提供用于诱导分化的独立包装的因子，如本文先前所描述的。本发明还提供含有有效量的用于干细胞(诸如来自患者的那些干细胞)分离和培 养的适当因子的试剂盒。从个体(诸如患者)获得牙髓之后，技术人员使用本文描述的方 法(或多个)或使用试剂盒中提供的、基于本文描述的DPMSCS标记谱(例如抗CD45和坑 血型糖蛋白A)的一个或多个选择工具来选择干细胞，然后使用作为试剂盒组分的细胞培 养基培养细胞，如本发明的方法(或多个)所描述的。本文先前已描述了基础培养基的组 成。该试剂盒还可含有指引培养、分化或使用如本文所描述的细胞中的任何一个或多个方 法的说明书。V.使用DPMSCs和来自DPMSCs的分化细胞的方法本发明的DPMSCs具有许多用途，以其未分化的状态以及以其分化的状态。本发明 提供将DPMSCs施用给需要这样的治疗的个体。相应地，在本发明的一些方面，能将DPMSCS 施用给个体用于治疗辅助。在下面列出的所有状况中，应理解为DPMSCs和来自DPMSCS的 分化细胞不但能用于治疗目的，还能用于辅助这些状况的治疗。当DPMSCs群正被使用时， 本领域的技术人员可容易地测定DPMSCs群应处于的适当的状态(分化的对未分化的)，例 如，为了治疗的目的来治疗状况(例如组织修复和/或协助或辅助治疗)。在某些情况下， 以其未分化、多能的状态使用DPMSCs。可任选地处理(例如从遗传上)DPMSCs以对个体提 供增加的好处。在其它的例子中，以沿着特定的途径诱导分化的方式培养DPMSCs可能是适 当的，其中需要的个体能从这样的细胞获得益处。DPMSCs和用于本发明的DPMSC选择的培养基，在变性和遗传疾病治疗的临床修复 医学中持有强的预兆，并免于ES细胞的使用引起的伦理关注。自体的离体扩大的DPMSC细 胞能用于自体植入，旨在修复损伤的、年老的或患病的组织和器官。用特定基因稳定地转导 DPMSC细胞的能力还能使自体细胞的基因操作用于变性的和先天性疾病的治疗。已被诱导分化形成骨细胞的本发明的DPMSCs能用作骨质疏松症、派杰病、骨折、 骨髓炎、骨坏死、软骨发育不全、成骨不全、遗传性多发性外生骨疣、多发性骨骺发育不良、 马方综合征、粘多糖贮积症、神经纤维瘤病或脊柱侧凸、局部畸形的重建外科、脊柱裂、半脊 椎或融合的椎骨、肢体异常、肿瘤损伤组织的再建和感染诸如中耳感染之后的再建中的组 织再生的细胞治疗和/或辅助细胞治疗。能将DPMSCs诱导分化形成用于细胞治疗和/或辅助细胞治疗的骨骼肌细胞，该细胞治疗是针对杜兴肌营养不良、Becker型肌营养不良、肌强直性营养不良、骨骼肌病的治疗 中的组织修复，和重建性外科手术以修复骨骼肌损伤。能将DPMSCs诱导分化形成用于胃 肠系统发育异常诸如食管闭锁、肠闭锁和肠套叠的治疗中的细胞治疗或组织修复的平滑肌 细胞，以及用于肠梗塞或结肠结肠吻合术的手术之后组织替换的平滑肌细胞。从本发明的 DPMSCs形成的平滑肌细胞还能用于膀胱或子宫的重建，用于新血管形成，用于损伤的，例如 动脉粥样硬化或动脉瘤损伤的血管的修复。平滑肌前体细胞(系膜细胞)能用作肾小球疾 病的体外模型或糖尿病性神经病变中的细胞治疗或组织再生的体外模型。平滑肌前体还能 用于修复远曲小管或球旁组织的致密斑，其在血压调节中起作用。来自DPMSCS的心肌细胞对用于组织修复的细胞治疗和/或辅助细胞治疗能是有 用的，该组织修复用于治疗瓣膜换置术期间，心肌梗塞与充血性心力衰竭后由先天性心脏 异常，或因心肌病或心内膜炎引起的损伤的心脏组织。为了增加的有效性，能将细胞局部递 送，尤其通过注射。从DPMSCS分化的小神经胶质细胞能用于治疗脊髓损伤和神经变性疾病，诸如杭 廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、多发性硬化症和阿尔茨海默氏病，以及侵袭中枢神经系统的 传染病期间损伤的组织的修复。已被从遗传上改变的以产生细胞因子的小神经胶质细胞 也能用于针对中枢神经系统中传染病的治疗的移植，在中枢神经系统中，由于血脑屏障， 进入受限。神经胶质细胞也能用于产生生长因子或生长因子抑制剂，用于中风之后神经 组织的再生以及用于脊髓损伤之后的再生，中风是多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症 (amylotropic lateral sclerosis)禾口脑癌的结果。能将从DPMSCs分化的小神经胶质细胞诱导分化成神经外胚层的细胞和用于治疗 脊髓损伤和神经变性疾病，诸如杭廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、多发性硬化症和阿尔茨海默 氏病，以及侵袭中枢神经系统的传染病期间损伤的组织的修复。已被从遗传上改变的以产 生细胞因子的小神经胶质细胞也能用于针对中枢神经系统中传染病的治疗的移植，在中枢 神经系统中，由于血脑屏障，进入受限。神经胶质细胞也能用于产生生长因子或生长因子抑 制剂，用于中风之后神经组织的再生以及用于脊髓损伤之后的再生，中风是多发性硬化症、 肌萎缩性侧索硬化症(amylotropic lateral sclerosis)和脑癌的结果。诱导的以形成 少突胶质细胞和星形细胞的DPMSCs，例如，能用于移植进脱髓鞘的组织，尤其是脊髓，在那 它们的功能是对周围的神经组织生成髓鞘。该技术已在小鼠中证明是有效的，使用胚胎干 细胞作为少突胶质细胞和星形细胞前体的来源(Brustle, 0.，et al.，Science (1999) 285 754-756)。本发明的DPMSCs能显示胚胎细胞的宽范围的分化特性，但提供有助于用于移植 的自体细胞的附加优点。相应地，本发明的DPMSCs或其神经元相关的分化细胞能用于治疗 具有神经缺陷或变性的疾病，包括但并不限于中风、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、杭廷顿 氏舞蹈病、AIDS伴随的痴呆、脊髓损伤和侵袭脑和或其它神经的代谢病。本发明的细胞的其它用途包括通过进行DPMSCs群在子宫内的移植来形成细胞或 组织嵌合体以在移植之后在出生前或出生后的人或动物中产生人类细胞而提供治疗用酶、 蛋白或其它生物制品，其中该细胞在人或动物中产生治疗用酶、蛋白质或其它生物制品，以 便医治遗传缺陷。本发明包括为需要其的人类个体中的损伤组织提供治疗的方法，包括(a)培养 DPMSCs以增殖它们；和(b)将有效量的扩大的DPMSCs与所述个体的损伤组织接触以辅助治疗。可通过局部注射或通过全身注射将细胞导入到个体的身体中。可将细胞与合适的基 质植入物一起导入到个体的身体中。该基质植入物提供另外的遗传物质、细胞因子、生长因 子或其它因子以促进细胞的生长和分化。在导入到个体的身体中之前可将细胞包入胶囊， 诸如聚合物胶囊内。本发明还提供使用DPMSCs鉴别与生理异常相关的遗传多态性的方法，包括从统 计学上显著的个体群体分离DPMSCs，从该个体能获得表型数据；从统计学上显著的个体群 体扩大DPMSCs以建立DPMSC培养物；在培养的DPMSCs中鉴别至少一个遗传多态性；诱导培 养的DPMSCs以分化；和通过比较具有正常基因型的DPMSCs显示的分化方式与具有鉴别的 遗传多态性的DPMSCs显示的分化方式来表示与所述至少一个遗传多态性相关的异常代谢 过程的特征。本发明进一步提供治疗个体中癌症的方法(或在一些实施方式中，将治疗用蛋白 递送给患有癌症的个体的方法)，通过如下进行从遗传上改变DPMSCs以表达杀肿瘤蛋白、 抗血管生成蛋白或在肿瘤细胞表面上表达的蛋白和与对抗原的免疫应答刺激相关的蛋白， 和将有效地产生抗癌作用(例如改变培养的细胞并以不同的方式使用它们以使癌细胞的 生长停止或杀死癌细胞)的量的遗传改造的DPMSCs导入到个体中。本发明提供使用DPMSCs以表征对生物或药理剂的细胞反应的方法，通过如下进 行从统计学上显著的个体群体分离DPMSCs，从统计学上显著的个体群体扩大DPMSCs以建 立多个DPMSC培养物，将DPMSC培养物与一种或多种生物或药理剂接触，鉴别对一种或多 种生物或药理剂的一个或多个细胞反应，和比较DPMSC培养物的一个或多个细胞反应，该 DPMSC培养物来自统计学上显著的群体中的个体。在另一个方面，本发明的DPMSCs细胞能用于产生用于牙疾病治疗的牙齿组分材 料。在另一个方面，本发明的DPMSCs细胞能用于发育来自多能干细胞的皮肤上皮组织，其 能用于植皮术和整形外科。在另一个方面，本发明的DPMSCs细胞能用于增强肌肉，诸如在 阴茎或心脏。在另一个方面，本发明的DPMSCs细胞能用于离体产生用于治疗用途的血液， 或用于在出生前或出生后动物中产生用于人类使用的人造血细胞和/或血液。在另一个方 面，本发明的DPMSCs细胞能用作治疗剂以辅助患者从癌症治疗的化学疗法或放射疗法、自 身性免疫疾病的治疗中恢复，以在受体中诱导耐受。在另一个方面，本发明的DPMSCs细胞 能用于治疗AIDS或其它的传染病。在另一个方面，本发明的DPMSCs细胞能用于治疗心脏病，包括但并不限于心肌 炎、心肌病、心力衰竭、由心脏病发作引起的损伤、高血压、动脉粥样硬化和心脏瓣膜功能障 碍。遗传上设计的多能哺乳动物来源的干细胞或其分化的后代能用于治疗与CNS缺陷或损 伤相关的疾病。DPMSCs群或其分化的后代诸如间质细胞能用于体外或体内支撑其它细胞类型的 生长和分化，包括但并不限于造血细胞、胰岛或β细胞、肝细胞等。干细胞或软骨分化的后 代能用于治疗关节或软骨疾病，包括但并不限于软骨撕裂、软骨减薄、骨性关节炎。而且，干 细胞或其成骨细胞分化的后代能用于辅助对骨具有有害作用的方法的改善，包括但并不限 于骨折、未愈的骨折、骨性关节炎、由播散到骨的肿瘤诸如前列腺、乳腺、多发性骨髓瘤等引 起的骨中的“孔穴”。本发明还包括提供如本文所描述的DPMSCs的至少一个基因概况的数据库的方法，和该数据库辅助药物发现的用途。相应地，在一方面，本发明提供方法，该方法提供多能 起源的干细胞的基因概况的数据库以辅助药物发现，其如下实施(a)测定来自至少一个 个体的DPMSCs的基因概况，其中该基因概况包括至少一个基因；和(b)在可取得的介质上 储存基因概况(或多个)。本发明的细胞能在细胞置换治疗和/或基因治疗中使用以治疗先天神经变性疾 病或贮积病诸如，例如，粘多糖贮积症、脑白质营养不良(球样细胞脑白质营养不良)岩藻 糖苷贮积病、GM2神经节苷脂沉积症、尼-皮二氏(Niemarm-Pick)、桑菲列普综合征、Wolman 病和Tay Sacks。它们还能用于创伤性疾病诸如中风、CNS出血和CNS创伤；用于外周神经 系统疾病诸如脊髓损伤或脊髓空洞症；用于视网膜病诸如视网膜剥离、黄斑变性和其它变 性视网膜病和糖尿病视网膜病变。本发明还提供使用特异分化的细胞用于治疗的方法，包括将特异分化的细胞施用 给需要其的个体。它还提供遗传上设计的多能干细胞选择性地表达内源基因或转基因的用 途，和提供体内生长的DPMSCS移植/施用进个体以治疗疾病的用途。例如，来自多能干细 胞或DPMSCS的视神经视网膜细胞能用于治疗失明，由但不限于视神经视网膜病引起的失 明，视神经视网膜病由但不限于黄斑变性、糖尿病性视网膜病、青光眼或色素性视网膜炎引 起。该细胞能用于将细胞植入给个体，包括对哺乳动物施用自体的、同种的或异种的细胞以 恢复或纠正组织特异性代谢的、酶促的、凝固、结构或其它功能。该细胞还能用于将细胞植 入给个体，引起细胞类型的体内分化，并用于将分化的干细胞施用到哺乳动物内。该细胞， 或其体外或体内分化的后代能用于医治遗传病、变性疾病、心血管疾病、代谢蓄积病、神经 或癌症疾病过程。几个方法可用于移植以阻止免疫排斥。对于万能供体细胞能将DPMSC处理以充 当万能供体细胞，用于细胞和基因治疗以治疗遗传或其它疾病，和代替酶。未分化的DPMSCs 表达HLA-I型、HLA-II型的mRNA和非常低的蛋白质百分比。DPMSCs能通过除去HLA-I型 和HLA-II型抗原和潜在地导入来自预期受体的HLA抗原而被修饰以充当万能供体细胞，从 而避免该细胞变成NK介导的杀伤的容易靶标，或变的对无限制的病毒复制和/或恶性转化 易感。HLA抗原的去除能通过同源重组或通过在启动子区中导入点突变或通过在抗原的起 始外显子中导入点突变以导入终止密码子而完成，诸如用chimeroplasts。宿主HLA抗原 的转移能通过反转录病毒的、慢病毒的、腺相关病毒或其它病毒的转导，或通过用HLA抗原 cDNA转染靶细胞而实现。DPMSCs能用于建立和设定身体或血液中蛋白质的量或给定的范 围或水平。对于子宫内移植以防止免疫识别DPMSCs能在子宫内移植环境中使用以医治遗 传异常或在免疫系统发育之前导入将被宿主耐受的细胞。这可以是在动物中大量制造人类 细胞，诸如血液的方法，或它能用作通过移植制备正确蛋白质或酶的细胞而医治人胚胎遗 传缺陷的方法。本发明还提供使用DPMSCs用于在需要治疗性治疗的个体中的基因治疗的方法， 包括通过将分离的预选择的编码期望基因产物的DNA导入进细胞而从遗传上改变细胞，在 培养物中扩大细胞，和将该细胞导入到个体的身体以产生期望的基因产物。直到现在，用于 基因治疗的人类细胞已基本上限制于骨髓和皮肤细胞，因为其它类型的细胞不能从身体提 取、在培养物中生长、从遗传上改变、然后成功地再植进从中获取组织的患者。参见，例如，Anderson, W. F. ，Nature (1998) 392 30 ；Anderson, W. F. ，Scientific American (1995) 273 15 ；Anderson, W. F. Science (1992) 256 :808-813)。本发明的 DPMSCs 能从身体提取和分离， 以非分化的状态在培养物中生长或在培养物中诱导分化，并使用许多种技术，尤其是病毒 转导进行从遗传上改变。遗传物质的摄取和表达是可证明的，贯穿发育，外源DNA的表达 是稳定的。用于将外源DNA插入进干细胞的反转录病毒和其它载体是本领域技术人员已 知的。参见，例如 Mochizuki，H.，etal.，J. Virol (1998) 72 (11) :8873-8883 ；Robbins, P.， et al·，J.Virol· (1997)71(12) :9466-9474 ；Bierhuizen, Μ. , et al. , Blood (1997) 90 (9) 3304-3315 ；Douglas, J.，et al.，Hum. Gene Ther. (1999) 10(6) :935-945 ；Zhang, G.，et al.，Biochem. Biophys. Res. Commun. (1996)227(3) :707-711)。一旦使用反转录病毒载体转 导，增强的绿色荧光蛋白(eGFP)表达在末期分化的肌肉细胞和来自分离的DPMSCs的内皮 中持续，证明导入进DPMSC的反转录病毒载体的表达在整个分化期间持续。尽管在分化潜能中受限，但是造血干细胞显示对于基因治疗的实用性(参见 Kohn, D. B.，Curr. Opin. Pediatr. (1995)7 :56-63)。本发明的细胞提供较宽范围的分化细 胞类型，当末期分化时其能保持转导或转染的DNA，如这样的事实所证实的，该事实是尽管 反转录病毒载体已导入进非分化的干细胞，但是末期分化的肌肉细胞、内皮和c-Kit阳性 细胞保持增强的绿色荧光蛋白表达。本发明的DPMSCs还提供超过造血干细胞的用于基因治疗的其它优点。本发明的 干细胞从局部麻醉下获得的骨髓抽出物相对容易地分离，易于在培养物中扩大，并易于用 外源基因转染。用于相同目的的足够数目的造血干细胞必须从至少一升骨髓中分离，并且 细胞难于在培养物中扩大(参见Prockop, D. J.，Science (1997) 276 :71-74)。用于基因治疗的候选基因包括，例如，编码载脂蛋白E(其已与阿尔茨海默氏病和 心血管病的危险相关)、MTHFR(其变体已与增加的同型半胱氨酸水平和中风的危险相关)、 因子V(其已与血栓形成的危险相关)、ACE(其变体已与心脏病的危险相关)、CKR-5(其已 与对HIV的抵抗力相关)、HPRT (次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，其缺乏导致累-奈二 氏病(Lesch-Nyhan disease))、PNP (嘌呤核苷磷酸化酶，其缺乏导致严重的免疫缺陷病)、 ADA(腺苷脱氨酶，其缺乏导致严重联合免疫缺陷病)、p21 (其已作为用于运动失调性毛细 血管扩张症治疗的候选基因被提出)、p47(其缺乏与具有慢性肉芽肿病的患者的中性白细 胞中氧化酶活性的缺乏相关，GenBank登录号M55067和M3875Q、Rb (与肿瘤形成相关的视 网膜母细胞瘤易感基因，GenBank登录号M15400) ,KVLQTl (钾通道蛋白，具有与心律不齐相 关的异常型，GenBank登录号U40990)、营养不良基因(与杜兴肌营养不良相关，GenBank登 录号M18533、M17154和M18026)、CFTR(与囊性纤维化相关的跨膜传导调节子，GenBank登 录号iC8668)、磷脂酰肌醇3-激酶(与运动失调性毛细血管扩张症相关，GenBank登录号 U26455)和VHL(蛋白的丢失或突变与希-林二氏病(Von-Hippel Lindau disease)相关 Latif, F. ,et al.，Science (1993) 260 1317-1320)的基因。使用这些遗传改造的细胞能有 效治疗的其它疾病包括因子IX缺乏、腺苷脱氨酶缺乏症(与严重联合免疫缺陷病或SCIDS 相关)和糖尿病和葡糖脑苷脂酶α-艾杜糖醛酸酶缺乏。这些新的基因能被诱导型启动子驱动，以便能调节酶的水平。这些诱导型启动子 系统可包括粘附到将被产生的蛋白上的人雌激素受体(ER)的突变配体结合域。这将需要 个体摄取他莫昔芬以允许蛋白的表达。替代物是四环素开或关系统，RU486和雷帕霉素可诱导系统。获得相对选择性表达的另外的方法是使用组织特异性启动子。例如在脑中，能导 入由神经元特异的烯醇化酶启动子(Ad-NSE)或神经胶质原纤维酸性蛋白质启动子(GFAP) 启动子驱动的转基因，这将允许在脑组织中几乎排他的表达。同样，内皮的表达只可通过使 用Tec启动子或VE-钙粘蛋白启动子而获得。能将遗传改造的DPMSCs局部地导入或全身性地输入。当用因子IX的基因转染 时，在全身性的输入到SCID小鼠之后，具有更有限的分化潜能的人干细胞分泌蛋白质持续 至少8周。参见，例如Keating，A.，et al.，Blood(1996)88 :3921。较其它非胚胎干细胞具 有更宽分化潜能的本发明的DPMSCs提供全身或局部施用的附加优点，因为它们能迁移到 许多种组织，在那里细胞因子、生长因子和其它因子诱导细胞的分化。分化的细胞，现在是 周围组织的一部分，保持其产生导入的基因的蛋白产物的能力。在帕金森氏病中，例如，临床试验已显示从人胚胎尸体获得的中脑多巴胺神经元 能在具有帕金森氏病的患者脑中存活和起作用。PET扫描已显示移植之后在细胞移植物 周围的区域[18F]氟多巴(fluorodopa)摄取增加，在一些患者中保持如此持续至少六年。 参见，例如 Dunnett，S.和 A. Biorklund，Nature (1999) 399 (Suppl. )A32-A-39 ；Lindval 1, 0. ，Nature Biotech. (1999) 17:635-636 ；Wagner, J. ，et al. ，Nature Biotech. (1999) 17 653-659。与胚胎细胞不同，如本发明所描述的分离的DPMSCs提供用于移植的现成的细胞， 而保持分化潜能，其使胚胎细胞移植治疗成为用于疾病治疗的有吸引力的替代物。对于AIDS治疗，能将本发明的DPMSCs遗传上改造成产生Rev M10，Rev的反式显性 阴性突变体，其阻断HIV感染细胞中产生的野生型Rev的功能。参见，例如BeveC，D. et al.， Proc. Natl. Acad Sci. USA (1992) 89 :9870-9874 ；Ranga, U. ， et al. ，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95 (3) 1201-1206。一旦被诱导分化成造血谱系细胞和导入进患者中，DPMSCs能 重新住入(r印opUlate)HIV感染患者的耗竭的T细胞供应。由于遗传改造的细胞具有突变 体Rev M110，它们将最有可能对大多数的HIV毒株引起的感染的致死作用有抵抗作用。遗传改造的DPMSCs还能被包入到惰性载体中以允许细胞免于宿主免疫系统的损 害同时产生分泌的蛋白。用于细胞微囊化的技术是本领域的技术人员已知的，参见，例如， Chang, P.，et al.，Trends in Biotech. (1999) 17(2) :78-83)。用于细胞微囊化的材料包 括，例如，聚合物胶囊、藻酸盐-聚-L-赖氨酸-藻酸盐微胶囊、钡聚-L-I赖氨酸-藻酸盐 胶囊、钡藻酸盐胶囊、聚丙烯腈/聚丙烯腈(PAN/PVC)中空纤维和聚醚砜(PES)中空纤维。 例如，美国专利号5，639，275出肪丨86』.,et al.)描述了生物学上有活性的分子的长期、稳 定表达的改进的装置和方法，其使用含有遗传上改造的细胞的生物相容性胶囊。这样的生 物相容性免疫隔离胶囊结合本发明的DPMSC，提供了治疗包括，例如，糖尿病和帕金森氏病 在内的许多生理疾病的方法。在糖尿病患者中，例如，能将已被遗传上改变以在生理学治疗水平产生胰岛素的 异源干细胞封入胶囊用于在患者组织内的递送。可选地，自体干细胞能来自患者自己的骨 髓抽出物，该抽出物用于如先前所描述的用反转录病毒载体的转导。一旦被遗传上改变以 产生生理学治疗水平的胰岛素，如Chang或Baetge所描述的，能将这些细胞封入胶囊，并导 入进患者的组织，在那里它们保持产生胰岛素持续延长的时期。本发明的细胞微囊化的另一个优点是将许多种细胞掺入微胶囊的机会，每种细胞 产生生物学上治疗用分子。能诱导本发明的DPMSCs以分化成多个不同的谱系，能从遗传上改变每个谱系以产生治疗上有效水平的生物学上有活性的分子。能将携带不同遗传元件的 DPMSCs 一起封入胶囊以产生许多种生物学上有活性的分子。 能离体从遗传上改变本发明的DPMSCs以表达一个或多个期望的基因产物。然后 能离体筛选或选择DPMSCs以鉴别已被成功改变的那些细胞，能将这些细胞局部地或全身 地再导入进个体。可选地，能从遗传上改变和培养DPMSCs以诱导分化来形成用于移植的特 异的细胞谱系。在任一个情况下，移植的DPMSCs提供能表达期望的基因产物的细胞的稳定 转染来源。尤其是当患者自己的骨髓抽出物是DPMSCs的来源，该方法提供产生移植细胞的 免疫学上安全的方法。该方法能用于糖尿病、心肌病、神经变性疾病和腺苷脱氨酶缺乏症的 治疗，仅举许多例子中的一些。在糖尿病中，例如，能分离、从遗传上改变DPMSCs以产生胰 岛素，然后将DPMSCs移植进遭受疾病痛苦的患者中。该疾病与自身免疫相关，为了避免免 疫监视，能从遗传上改变DPMSCs以表达改变的MHC或不表达MHC。使用表达病毒基因组E3 区的腺病毒载体已成功地进行了移植的胰岛细胞中MHC表达的抑制。如发明人已证明的， 能稳定地转染或转导本发明的细胞，因此能提供用于移植进糖尿病患者的更持久的胰岛素 来源。 供体DPMSCs，特别是如果遗传上被改变以改变MHC表达，和自体的DPMSCs，如果遗 传上被改变以表达期望的血红蛋白基因产物，在用于镰状细胞贫血和地中海贫血的治疗的 细胞治疗中能是特别有效的。从遗传上改变DPMSCs的方法通过本领域的技术人员已知的许多种方法将DNA或RNA导入进细胞能从遗传上 改变用本文描述的方法分离的细胞。通常将这些方法分成四个主要类型(1)病毒转移， 包括DNA或RNA病毒载体的使用，病毒载体诸如例如反转录病毒(包括慢病毒)、猿猴病 毒40(SV40)、腺病毒、辛德比斯(Sindbis)病毒和牛乳头状瘤病毒；( 化学转移，包括磷 酸钙转染和DEAE葡聚糖转染方法；(3)膜融合转移，使用装载DNA的膜质小泡诸如例如脂 质体、红细胞血影和原生质体；和(4)物理转移技术，诸如显微注射、电穿孔或直接的“裸露 的” DNA转移。通过预选择的分离的DNA的插入、通过用预选择的分离的DNA替代细胞基因组的 区段、或通过细胞基因组的至少部分缺失或失活能从遗传上改变DPMSCs。能通过许多种手 段完成细胞基因组的至少部分缺失或失活，手段包括但并不限于例如遗传重组，通过反义 技术(其能包括肽核酸或PNAs的使用)、或通过核酶技术。能通过同源重组或通过病毒整 合进宿主细胞基因组而完成一个或多个预选择的DNA序列的插入。还能使用质粒表达载体 和核定位序列将期望的基因序列掺入进细胞，特别地掺入进细胞核。将多核苷酸指向细胞 核的方法已在本领域中描述了。使用启动子能导入遗传物质，该启动子将允许使用某些化 学药品/药物正或负地诱导感兴趣的基因，给定的药物/化学药品的施用之后除去感兴趣 的基因，或能将感兴趣的基因加标记以允许被化学药品(包括但并不限于他莫昔芬反应的 突变的雌激素受体)诱导在特定细胞小室(包括但并不限于细胞膜)表达。同源重组依赖质粒DNA/钙离子的沉淀物的磷酸钙转染能用于将含有靶基因或多核苷酸的 质粒DNA导入分离的或培养的DPMSCs。简言之，将质粒DNA混合进氯化钙溶液，然后加入 到已被磷酸盐缓冲的溶液中。一旦沉淀物已形成，将该溶液直接加入到培养的细胞中。用DMSO或甘油处理能用于提高转染效率，使用双羟乙基氨基乙磺酸盐(BES)能提高稳定转染 子的水平。磷酸钙转染系统是商业上可获得的(例如PmFection ，来自！Iomega Corp., Madison, Wis.)。DEAE葡萄糖转染，其也是本领域的技术人员已知的，可优于磷酸钙转染，其中瞬时 转染是期望的，由于它通常更有效。由于本发明的细胞是分离的细胞，对于将遗传物质转移进细胞，显微注射可能是 特别有效的。简言之，将细胞放到光学显微镜的载物台上。借助于显微镜提供的放大倍数， 将玻璃微量加液器引导进细胞核以注射DNA或RNA。该方法是有利的，因为它提供期望的遗 传物质直接递送到细胞核，避免了注射的多核苷酸的细胞质和溶酶体的降解。该技术已被 有效地用于完成转基因动物中的种系修饰。还能使用电穿孔从遗传上改变本发明的细胞。将靶DNA或RNA加入到培养的细胞 的悬液中。将DNA/RNA-细胞悬液放到两个电极之间并经受电脉冲，引起细胞外膜中的瞬时 通透性，这通过跨膜的孔的出现而证明。该靶多核苷酸通过膜中的开孔进入细胞，当中断电 场时，孔在大约1至30分钟内关闭。使用阳离子脂质体能进行DNA或RNA的脂质体递送以从遗传上改变细胞，阳离 子脂质体与多核苷酸形成稳定的复合体。为了脂质体复合体的稳定，能加入二油酰基磷 脂酰乙醇胺(DOPE)或二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)。用于脂质体转移的推荐的试剂是 Lipofectin (Life Technologies, Inc.)，它是商业上可获得的。例如，Lipofectin 是阳 离子脂质N-[l-(2，3-二油基氧)丙基]-N-N-N-三甲基氯化铵和DOPE的混合物。使用 脂质体递送能体外或体内完成线性DNA、质粒DNA或RNA的递送，由于脂质体能携带较大 的DNA片段，能通常保护多核苷酸不受降解，和能被靶向特定细胞或组织的事实，脂质体 递送可以是优选的方法。依赖脂质体技术的许多其它递送系统也是商业上可获得的，包 EffecteneTM(Qiagen) > DOTAP (Roche Molecular Biochemicals) 、FuGene 6 (Roche Molecular Biochemicals)禾口 Transfectam (Promega)。 在 Abe, A. , et al. (J. Virol. (1998)72 :61596163)的方法中，阳离子脂质介导的基因转移效率能通过整合纯化的病毒 或细胞包膜组分，诸如纯化的水疱性口炎病毒包膜(VSV-G)的G糖蛋白而提高。已显示使用脂多氨包被的DNA有效将DNA递送进原始的和建立的哺乳动物细胞系 中的基因转移技术能用于将靶DNA导入进DPMSCs。Loeffler，J.和Behr，J.，Methods in Enzymology (1993) 217 :599-618 总体上描述了该技术。能将裸质粒DNA直接注射进由来自分离的DPMSCs的分化细胞形成的组织块。该 技术已显示在将质粒DNA转移到骨骼肌组织中是有效的，单次肌内注射之后已观察到在小 鼠骨骼肌中的表达持续超过19个月。更快速分裂的细胞吸收裸质粒DNA更有效。因此，在 用质粒DNA处理之前刺激细胞分裂是有利的。微粒基因转移还能用于体外或体内将基因转移进DPMSCs。J. Wolff在Gene Therapeutics (1994)的195页描述了微粒基因转移的基本操作。简言之，将编码靶基因 的质粒DNA包到微珠上，通常是1-3微米大小的金或钨粒。将包被的颗粒放到插入到排 出室(discharge chamber)上面的载体板上。一旦排出，将载体板向着阻滞筛加速。阻 滞筛形成使载体板停止进一步运动的障碍，而允许包被多核苷酸的颗粒向着靶表面被推 进——通常通过氦流推进，靶表面诸如由分化的DPMSCs形成的组织块。微粒注射技术先前已被描述，方法是本领域的技术人员已知的(参见Johnston, S. Α.，et al.，Genet. Eng. (NY) (1993) 15 :225-236 ；Williams, R. S.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1991)88 2726-2730 ；Yang, N. S.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87 :9568-9572)。如 Sebestyen，et al. (Nature Biotech. (1998) 16 :80-85)所描述的，为了更有效 的表达，能将信号肽连接到质粒DNA以将DNA引导到细胞核。将病毒载体用于从遗传上改变本发明的DPMSCs和它们的后代。使用病毒载体将 一个或多个，例如，靶基因、多核苷酸、反义分子或核酶序列递送进细胞，这是先前描述的物 理方法。病毒载体和使用它们将DNA递送到细胞的方法是本领域的技术人员熟知的。能用 于从遗传上改变本发明的细胞的病毒载体的例子包括但并不限于腺病毒载体、腺相关病毒 载体、反转录病毒载体(包括慢病毒载体)、甲病毒属载体(例如辛德毕斯载体)和疱疹病 毒载体。尽管也已发展了许多反转录病毒载体以有效地将DNA转移进非分裂细胞，但是反 转录病毒载体对转导快速分裂细胞是有效的(Mochizuki, H.，et al.，J.Virol. (1998)72 8873-8883)。用于反转录病毒载体的包装细胞系是本领域的技术人员已知的。包装细胞系 提供病毒载体的壳体产生和病毒粒子成熟需要的病毒蛋白。大体上，这些包括gag、pol和 erw反转录病毒基因。适当的包装细胞系选自已知的细胞系以产生嗜亲性的、嗜异性的或双 嗜性的反转录病毒载体，对反转录病毒载体系统提供一定程度的特异性。反转录病毒DNA载体通常与包装细胞系一起使用以在细胞内产生期望的靶序列/ 载体组合。简言之，反转录病毒DNA载体是含有两个反转录病毒LTRs的质粒DNA，该反转录 病毒LTRs放置在多克隆位点和SV40启动子附近，以便第一 LTR位于SV40启动子的5端， 其可操作地连接到克隆进多克隆位点的靶基因序列，接下来是端3第二 LTR。一旦形成，如 先前所描述的，使用磷酸钙介导的转染能将反转录病毒DNA载体转移进包装细胞系。病毒 生产大约48小时之后，收获现在含有靶基因序列的病毒载体。Martin, F.，et al.，(J.Virol. (1999)73 :6923-6929)证明了将反转录病毒载体靶 向特异细胞类型，其使用针对融合到双嗜性鼠白血病病毒包膜以靶向载体的表面糖蛋白高 分子量黑素瘤相关抗原的单链可变片段抗体，以将靶基因递送到黑素瘤细胞。靶向的递送 是期望的，例如，当分化的细胞是遗传改变的期望对象时，融合到抗体片段的反转录病毒载 体能用于将递送靶向作用于那些细胞，该抗体片段指向从本发明的DPMSCs分化的每个细 胞谱系表达的特异标记。慢病毒载体也用于从遗传上改变本发明的细胞。许多这样的载体已在文献中描 述了并是本领域的技术人员已知的。Salmons，B. and Gunzburg，W. H.，“ Targeting of Retroviral Vectors for Gene Therapy, " Hum. Gene Therapy (1993) 4 :129-141。这些 载体对从遗传上改变人造血干细胞已是有效的(Sutton，R.，et al.，J.Virol. (1998)72 5781-5788)。已描述了对慢病毒载体的包装细胞系(参见Kafri，Τ.，et al.，J.Virol. (1999)73 :576-584 ；Dull, Τ.，et al.，J. Virol. (1998)72 :8463-8471)。重组的疱疹病毒，诸如单纯疱疹病毒I型(HSV-I)已被成功地用于将DNA递送 靶向作用于表达红细胞生成素受体的细胞(Laquerre, S.，et al.，J.Virol. (1998)72 9683-9697)。这些载体还能用于从遗传上改变本发明的细胞，本发明人已证明该细胞被病 毒载体稳定地转导。
腺病毒载体具有高转导效率，能整合DNA插入片段达8Kb，并能感染复制和分化 的细胞。许多腺病毒载体已在文献中描述了并是本领域的技术人员已知的(参见，例如， Davidson, B.L. , et al. , Nature Genetics(1993) 3:219-223；Wagner, Ε. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89 :6099-6103)。将靶DNA插入进腺病毒载体的方法是基因治疗 领域的技术人员已知的，它们是使用重组的腺病毒载体以将靶DNA导入进特异细胞类型的 方法(参见 Wold, W. , Adenovirus Methods 禾口 Protocols, Humana Methods in Molecular Medicine (1998)，Blackwell Science, Ltd·)。已通过病毒载体纤维序列的修饰证明了对 某些细胞类型的结合亲和力。已描述了允许基因转移中调节的蛋白表达的腺病毒载体系 统(Mol in, Μ.，et al.，J.Virol. (1998)72 :8358-8361)。还描述了增殖具有遗传上修饰 的受体特异性的腺病毒载体的系统，以提供对特异细胞类型的转导的靶向作用(Douglas， J.，et al.，Nature Biotech. (1999) 17 :470-475)。最近描述的绵羊腺病毒载体通过预存 体液免疫甚至表达干扰成功的基因转移的潜能(Hofmann, C.，et al.，J.Virol. (1999)73 6930-6936)。腺病毒载体也是可获得的，使用分子结合载体，其提供靶向基因转移和稳定的基 因表达，该分子结合载体是通过压缩质粒DNA构建的，该质粒DNA含有具有聚赖氨酸的靶基 因，聚赖氨酸连接到复制缺陷型腺病毒(Schwarzenberger,P.，et al.，J.Virol. (1997)71 8563-8571.)。甲病毒属载体，特别是辛德毕斯病毒载体也可用于转导本发明的细胞。这些载 体是商业上可获得的(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)和已被描述在，例如，美国专利 号 5,843,723，以及由 Xiong, C.，et al.，Science (1989) 243 :1188-1191 ；Bredenbeek, P. J. ，etal. ，J. Virol. (1993) 67 :6439-6446 禾口 Frolov，I. ，et al. ，Proc. Natl. Acad Sci. USA(1996) 93 :11371-11377 描述。本发明的干细胞还能用于组织修复。本发明人已证明本发明的DPMSCs分化形成 许多细胞类型，包括成纤维细胞、成骨细胞、(骨骼肌、平滑肌、心肌)细胞。例如，能将用本 文先前描述的方法诱导分化成成骨细胞的DPMSCs植入骨以增进修复过程，以加强变弱的 骨或以重铺关节。基质也用于将本发明的细胞递送到特定的解剖部位，在那掺入到基质中的、或在 质粒上编码的特定生长因子能用于指导原始细胞群体的生长，该质粒掺入到基质中以被细 胞摄取。能将DNA掺入到基质的孔内，例如，在某些聚合物基质的形成中使用的发泡过程期 间。当在发泡过程中使用的聚合物膨胀，它捕获孔内的DNA，允许质粒DNA的控制的和持续 的释放。Shea, et al.，在 Nature Biotechnology (1999) 17 :551-554 中描述了这样的基质 制备方法。^nBonadio, J. ，et al. ，Nature Medicine (1999) July 5(7) :753-759 所描述的， 能将编码细胞因子、生长因子或激素的质粒DNA捕获在聚合物激活的基因基质载体内。然 后将生物可降解的聚合物植入断骨附近，例如，在那植入DPMSCs和摄取DNA，这使得DPMSCS 产生高局部浓度的细胞因子、生长因子或激素，从而加速损伤组织的愈合。本发明提供的细胞，或本发明的方法分离的DPMSCs能用于产生用于移植的组织 或器官。Oberpenning, et al. (Nature Biotechnology(1999) 17 149-155)报导 了通过 如下形成工作膀胱培养来自外部犬膀胱的细胞和来自犬膀胱内部的衬细胞，制备来自这些培养物的组织片，和用肌肉细胞在外面包被小的聚合物球体，用衬细胞在内部包被小的 聚合物球体。然后将该球体插入到狗的泌尿系统，在那它开始充当膀胱。Nicklason，et al.，Science (1999) 284 :489-493报导了来自培养的平滑肌和内皮细胞的血管移植材料段 的产生。从培养的细胞形成组织层的其它方法是本领域的技术人员已知的(参见，例如， Vacanti, et al.，美国专利号5，855，610))。当与本发明的细胞组合使用时，这些方法可以 是特别有效的，本发明的细胞较先前描述的非胚胎干细胞具有更宽的分化范围。本发明的DPMSCS通过直接注射进组织损伤的区域或通过全身注射能用于重新住 入心肌细胞，允许细胞返回到心脏组织。如果与血管发生联合，该方法可以是特别有效的。 注射的方法和促进血管发生的方法是本领域的技术人员已知的。本发明的DPMSCS提供较 宽的分化范围以为利用这些技术的心脏或其它组织修复提供更多样来源的细胞。本发明的DPMSCs对于，例如，在高剂量化学疗法之后重新住入骨髓的目的也是有 用的。化学疗法之前，从患者获得DPMSCs。干细胞用本发明的方法分离，并在培养物中生长 和被诱导分化。然后将分化和未分化的细胞混合物再导入到患者的骨髓腔中。为了该目的 使用造血干细胞的临床试验目前正在进行中。然而，本发明的DPMSCs提供进一步分化的另 外的好处，以形成能替代在其它组织以及在骨髓中因化学疗法损伤的那些细胞的细胞。可选地，Lawman，et al. (W0 98/42838)描述的方法能用于改变来自一个或多个同 种异型供体供体的干细胞的组织相容性抗原。使用该方法，能产生多组可用的骨髓移植物 用于冻存物、贮存物的制备和对患者的施用，该患者不能，如在白血病患者中，例如，提供他 们自己的骨髓用于重建。患者的免疫系统细胞或血液细胞的重新住入能通过，例如，分离来自患者的自体 干细胞，培养这些细胞以扩大群体，然后将这些细胞再导入到患者中来完成。在免疫系统或 骨髓细胞必须被用于治疗目的的辐照和/或化学疗法耗竭的地方，该方法可能是特别有效 的，诸如例如，在被诊断具有多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、自身免疫性疾病或实体瘤 癌症的患者的情况下。对于白血病、自身免疫性疾病或遗传疾病诸如镰状细胞性贫血或地中海贫血的治 疗，患者的血液或免疫系统细胞的重新住入能用本发明的或用本发明的方法分离的同种异 型细胞进行，特别是当组织相容性抗原已以Lawman，et al. (W0 98/42838)描述的方式改变 时。为了本文描述的目的，能将本发明的自体的或同种异型的DPMSCs施用给患者，以 分化的或未分化的形式，遗传上被改变的或未被改变的，通过直接注射到组织位点、全身性 地，在可接受的基质表面上或周围，或与药学上可接受的载体结合。DPMSCs提供用于研究分化途径的模型系统本发明的DPMSCs群的另一个用途是作为研究工具。本发明的细胞对发育过程的 进一步研究也是有用的。Ruley，et al. (W0 98/40468)，例如，已描述了抑制特定基因表达 的载体和方法，以及获得那些被抑制的基因DNA序列的方法。能用载体诸如Ruley描述的 那些载体处理本发明的细胞，该载体抑制能被DNA序列分析鉴别的基因的表达。然后能将 细胞诱导分化，能表征改变的基因型/表型的作用。Hahn, et al. (Nature (1999)400 :464468)证明，例如，当先前与癌症相关的基因的 组合被导入细胞时，正常的人上皮成纤维细胞能被诱导以经历致瘤转变。
使用含有诱导型表达元件的载体进行的基因表达的控制提供研究细胞分化之后 某些基因产物的作用的方法。诱导型表达元件是本领域的技术人员已知的。一个这样的系 统是 No，D.，et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93 :3346-3351 描述的蜕皮激素诱导型 系统。DPMSCs能用于研究特定的基因改造、毒性物质、化学治疗剂或其它药剂对发育途 径的影响。本领域的技术人员已知的组织培养技术允许来自不同个体的成千上万个细胞样 品的大量培养，提供机会以进行怀疑是，例如，致畸的或致突变的化合物的快速筛选。为了研究发育途径，能用特定的生长因子、细胞因子或其它药剂，包括可疑的致畸 化学药品，处理DPMSCs。还能使用先前描述的方法和载体遗传上改变DPMSCs。此外，能使 用反义技术或用导入细胞以改变天然基因序列的蛋白处理来改变DPMSCs。信号肽序列，例 如，能用于将期望的肽或多肽导入细胞。Rojas，et al.在NatureBiotechnology (1998) 16 370-375中已描述了将多肽和蛋白质导入细胞的特别有效的技术。该方法产生多肽或蛋 白质产物，其能被导入培养基并跨过细胞膜易位到细胞的内部。能以该方式使用任何数 目的蛋白质以测定靶蛋白对细胞分化的效果。可选地，Wielan et al. (Nature Biotech. (1998) 16 :440-443)描述的技术能用于将疱疹病毒蛋白VP22连接到功能蛋白，用于进入细 胞。为了检测潜在的化学治疗剂或基因治疗载体的有效性，还能通过外源DNA的导入 或通过沉默或切除基因组DNA而遗传上改造本发明的细胞，以产生具有缺陷表型的分化细 胞。DPMSCs提供用于高通量筛选的许多种分化的和未分化的培养的细胞类型本发明的DPMSCs能在，例如，96孔或其它多孔培养平板中培养以为高通量筛选， 例如，药物基因组学或药物遗传学中的靶细胞因子、趋化因子、生长因子或药物组合物提供 系统。本发明的DPMSCs提供独特的系统，其中细胞能被分化形成来自相同个体的特定的细 胞谱系。与大多数原代培养不同，这些细胞能在培养物中维持和随着时间被研究。能用感 兴趣的因子处理来自相同个体和来自不同个体的多个培养细胞物以测定是否细胞因子对 具有相同基因构成的某些类型的分化细胞，或对来自遗传上不同个体的相似类型的细胞的 效果存在差异。细胞因子、趋化因子、药物组合物和生长因子，例如，能因此以及时的和具有成本 效益的方式被筛选以更清楚地阐明它们的作用。从大量个体分离的，和就遗传多态性，特 别是单核苷酸多态性的存在或缺乏表征的细胞能储存在细胞培养库中，用于许多种筛选技 术中。例如，来自统计学上显著的个体群体的牙髓髓相似细胞——其根据本领域的技术人 员已知的方法能被测定，为高通量筛选提供理想的系统以鉴别与对一系列物质的增加的正 反应或负反应相关的多态性，这些物质诸如，例如，药物组合物、疫苗制剂、细胞毒性化学药 品、诱变剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、抑制性化合物、化学治疗剂和许许多多其 它化合物或因子。从这样的研究获得的信息对于传染病、癌症和许多代谢疾病的治疗具有 广阔的含意。在使用DPMSCs以表征对生物或药理剂或这样的药剂的组合文库的细胞反应的方 法中，从统计学上显著的个体群体分离DPMSCs，扩大培养，和将其与一个或多个生物或药理 剂接触。DPMSCs能被诱导分化，培养扩大之前或之后，分化的细胞是某个生物或药理剂的期望的靶标。通过比较来自统计学上显著的群体中个体的DPMSC培养物的一个或多个细胞 反应能测定生物或药理剂的作用。可选地，遗传上相同的DPMSCs或从那里分化的细胞能用 于筛选单独的化合物，诸如组合文库中的化合物。已描述了用于与基于细胞的高通量筛选 结合使用的基因表达系统(参见 Jayawickreme，C.和 Kost，Τ.，Curr. Opin. Biotechnol. (1997)Oct 8,5 :629-634). Rice,et al.已描述了用于识别内皮细胞活化的抑制剂的高容 量筛选技术，该技术利用用于原代人脐静脉内皮细胞的细胞培养系统(Rice，et al. ,Anal. Biochem. (1996)241 :2M_259.)。本发明的细胞为用于识别许多靶生物或药理剂的高通量 筛选技术提供许多种细胞类型，终末分化的和未分化的。重要的是，本发明的细胞提供来自 许多种遗传上多样的个体的培养细胞来源，该个体可对生物或药理剂反应不同。DPMSCs 和遗传序型分析(Genetic Profiling)遗传性变异对疾病易感性可能具有间接和直接作用。在直接的情况下，甚至导致 单核苷酸多态性(SNP)的单个核苷酸改变能改变蛋白质的氨基酸序列和直接地对疾病或 疾病易感性起作用。所得的蛋白质中的功能改变经常能在体外检测到。例如，某些APO-载 脂蛋白E基因型已与一些个体中阿尔茨海默氏病的开始和进展相关。DNA序列异常能通过动态等位基因特异性杂交、DNA芯片技术和本领域的技术人 员已知的其它技术检测。蛋白质编码区已被估计只代表人基因组的约3%，并且据估计，有 大概200，000至400，000个定位在编码区的共有SNPs。使用SNP相关的遗传分析的先前的研究设计已包括从大量的个体获得用于遗传 分析的样品，针对这些个体能进行表型鉴定。令人遗憾的是，以这个方式获得的遗传相关限 于与可容易识别的表型相关的特定多态性的鉴定，不提供疾病潜在原因的进一步的信息。本发明的DPMSCs能提供必需的元件以跨过与疾病相关的遗传元件的鉴别和在遭 受疾病的人中注意到的最后表型表达之间的距离。简言之，从统计学上显著的个体群体分 离 DPMSCs，从该个体能获得表型数据(参见 Collins，et al. ,Genome Research (1998)Dec, 8(12) :12^-1231)。然后将这些DPMSCs样品扩大培养，将这些传代培养物储存为冻存物， 其能用于为随后的发育研究提供培养物。从扩大的细胞群体，能进行多个遗传分析以识别 遗传多态性。例如，使用目前的技术，诸如本领域的技术人员已知的DNA芯片技术，在相对 短的时期里能在大样本群体中识别单核苷酸多态性(Wang，D.，et al. , Science (1998) 280 1077-1082 ；Chee, M.，et al.，Science(1996) 274:610-614 ；Cargill, M.，et al.，Nature Genetics(1999) 22 :231-238 ；Gilles, P. ， et al. ， NatureBiotechnology(1999) 17 365-370 ；Zhao, L.P.，et al.，Am. J. Human Genet. (1998)63 :225-240)。SNP 分析的技 术也已被 Syvanen (Syvanen，Α.，Hum. Mut. (1999) 13 :1-10)、Xiong (Xiong, Μ.和 L. Jin, Am. J. Hum. Genet. (1999) 64 :629-640)、Gu (Gu, Ζ. , et al. , Human Mutation(1998) 12 221-225)、Collins(Collins，F. , et al.，Science(1997)278 :1580-1581),Howell(Howell, W. , et al. , Nature Biotechnology (1999) 17 :87-88)、Buetow (Buetow, K. , et al., Nature Genetics(1999)21 :323-325)禾口 Hoogendoom(Hoogendoom,B. ,et al. , Hum. Genet. (1999) 104 :89-93)描述。当某些多态性与特定的疾病表型相关时，来自被鉴定为多态性载体的个体的细胞 能用于研究发育异常，使用来自非载体的细胞作为对照。本发明的DPMSCs为研究与特定的 遗传疾病呈现相关的发育异常提供实验系统，特别地，由于使用本文描述的某些方法和本领域的技术人员已知的某些其它方法，它们能被诱导分化形成特定的细胞类型。例如，如 果特定的SNP与神经变性疾病相关，未分化的DPMSCS和分化形成神经元前体、神经胶质细 胞或神经起源的其它细胞的DPMSCS能用于表征多态性的细胞作用。分化过程期间能跟随 着显示某些多态性的细胞以识别遗传元件，该遗传元件影响药物敏感性、趋化因子和细胞 因子反应、对生长因子、激素和抑制剂的反应，以及对受体表达和/或功能改变的反应。该 信息在设计用于遗传起源的疾病，或用于有遗传易感性的疾病的治疗方法学中可能是无价 的。在使用DPMSCS以识别与生理异常相关的遗传多态性的本方法中，从统计学上显 著的个体群体分离DPMSCS，从该个体能获得表型数据(统计学上显著的个体群体被本领域 的技术人员定义为足以包括具有至少一个遗传多态性的成员的群体大小)和扩大培养以 建立DPMSC培养物。来自培养的细胞的DNA然后用于识别来自群体的培养的DPMSCS中的 遗传多态性，并诱导细胞以分化。通过比较具有正常基因型的DPMSCS显示的分化方式与具 有鉴别的遗传多态性或对假定药物的反应的DPMSCS显示的分化方式来识别和表征与特定 的遗传多态性相关的异常代谢过程。DPMSCS提供较安全的疫苗递送当被从遗传上改变以产生抗原蛋白时，本发明的DPMSCs细胞还能用作抗原递呈 细胞。使用多个改变的自体或同种异体的祖细胞，例如，和提供本发明的祖细胞——结合用 于延长释放的包埋在生物可降解基质中的质粒以转染伴随的细胞，能引出对一个或多个抗 原的免疫反应，通过抗原递呈细胞的连续释放可能改进免疫反应的最终效果。本领域已知， 一些抗原在延长时期中的多次施用在最后的抗原攻击之后产生加强的免疫反应。可选地， 在 Zhang，et al. (Nature Biotechnology (1998) 1 :1045-1049)的方法中，DPMSCs 能用作抗 原递呈细胞以诱导对特异抗原的T-细胞耐受。许多目前的疫苗制剂掺入加入的化学药品和其它物质，诸如抗生素(以阻止疫苗 培养物中细菌的生长)、铝(佐剂)、甲醛(以灭活类毒素疫苗的细菌产物)、谷氨酸一钠 (稳定剂)、卵蛋白(使用鸡含胚卵制备的疫苗组分)、亚硫酸盐(稳定剂)和柳硫汞(防腐 剂)。部分由于这些加入的组分，存在当前的广基的对疫苗制剂安全性的公共关注。柳硫汞， 例如，含有汞，并由氯化乙基汞、硫代水杨酸、氢氧化钠和乙醇的组合制备。而且，一些研究， 尽管是非结论性的，但是已提示一些疫苗组分与潜在的并发症诸如通常与自身免疫相关的 那些疾病之间的可能联系。因此，需要更有效的疫苗治疗，如果存在接种方法的较大程度的 舒适，与疫苗主动性的公共合作将较容易促进。本发明的DPMSCS能被分化形成树突细胞，其将抗原递呈给T细胞并由此激活它们 以对外来生物体起反应。使用先前描述的技术能从遗传上改变这些树突细胞以表达外来抗 原。该疫苗递送方法的特别优点在于超过一个的抗原能由单个遗传改造细胞递呈。异种来源的分化或未分化的DPMSC疫苗载体提供通过外来细胞表面标记刺激免 疫系统的附加优点。疫苗设计实验已显示使用多个抗原刺激免疫反应能引出疫苗制剂内对 某些单独抗原的加强的免疫反应。已鉴定了针对，例如甲型肝炎、乙型肝炎、水痘、脊髓灰质炎、白喉、百日咳、破伤 风、莱姆病、麻疹、腮腺炎、风疹、B型流感嗜血菌(Hib)、BCG、日本脑炎、黄热病和轮状病毒 的免疫学上有效的抗原。
能通过如下步骤进行使用本发明的DPMSCs诱导对人类个体中传染原的免疫反应 的方法在培养物中扩大牙髓髓相似细胞的克隆群，从遗传上改变扩大的细胞来表达一个 或多个预选择的抗原分子以引出对传染原的保护性免疫反应，和将有效诱导免疫反应的量 的遗传改造细胞导入个体中。施用遗传改造细胞的方法是本领域的技术人员已知的。有效 诱导免疫反应的遗传改造细胞的量是产生期望抗原的充足表达以产生可测量的抗体反应 的细胞的量，该抗体反应是如用本领域技术人员已知的方法所测定的。优选地，抗体反应是 保护性抗体反应，该抗体反应能通过用适当的传染原攻击之后对疾病的抵抗力来测定。DPMSCs和癌症治疗本发明的DPMSCs为癌症治疗提供新的载体。例如，DPMSCs能被诱导分化形成内 皮细胞或前体，当被局部或全身递送时，这些细胞将返回到内皮组织。这些细胞参与血管 的形成以供应新形成的肿瘤(血管发生)，并相应地在内皮组织分裂或增殖。通过从遗传 上设计这些细胞以在用外部递送的元件的刺激之后经历凋亡，能破坏新形成的血管并能消 除到肿瘤的血流。外部递送的元件的一个例子将是抗生素四环素，其中在四环素应答元件 的控制下，已用促进凋亡的基因，诸如半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)或BAD， 转染或转导细胞。文献中已描述了四环素应答元件(Gossen，Μ. & Bujard，H.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89 :55475551)，其提供在内皮细胞中的体内转基因表达控制(Sarao， R. & Dumont, D.，Transgenic Res. (1998)7 :421427),并是商业上可获得的(CL0NETECH Laboratories, Palo Alto, Calif.)。可选地，未分化的DPMSCs或分化的以形成组织特异性细胞谱系的DPMSCs能被从 遗传上改变以产生产物，用于输出到细胞外环境，该产物对肿瘤细胞是有毒的，或其破坏 血管发生(诸如Dawson，et al.，Science (1999) 285 :245-248描述的色素上皮衍生因子 (pigment epithelium-derived factor) (PEDF))。例如，Koivunen，et al.描述了环月太，其 含有选择地抑制MMP-2和MMP-9 (与肿瘤发生相关的基质金属蛋白酶)的氨基酸序列、在动 物模型中阻止肿瘤生长和侵入并在体内特异地靶向血管发生的血管(Koivunen，Ε.，Nat. Biotech. (1999) 17 :768774)。如果期望细胞被递送到肿瘤位点，产生肿瘤抑制产物，然后被 破坏，在诱导型启动子的控制下细胞能被进一步从遗传上改变以掺入促进凋亡的蛋白。由于能将DPMSCs从患者分离、离体培养、离体从遗传上改变以表达适当的抗原， 特别地结合与对抗原的增加的免疫反应相关的受体，和再导入个体以激活对表达在肿瘤细 胞上的蛋白的免疫反应，DPMSCs还提供用于癌症疫苗递送的载体。实施例实施例也描述和详述上面讨论的本发明的多个方面，实施例期望纯粹是本发明示 例性的和因此不应被认为以任何方式限制本发明。缩写BDNF =脑源的神经营养因子，β 2/NeuroD =神经原的分化转录因子(也是， β细胞E盒反式激活蛋白2)，bFGF =碱性成纤维细胞生长因子，BHA = 丁基化羟基茴香醚， BMP-受体=IB骨形态生成蛋白受体，IB型，c-Met = HGF受体，DMEM =达尔伯克氏改良的 伊格尔培养基，ECM =细胞外基质，EGF =表皮生长因子，ES =胚胎干细胞，FACS =荧光激 活细胞分选术，FBS =胎牛血清，FN =纤连蛋白，GFAP =神经胶质原纤维酸性蛋白，HGF = 肝细胞生长因子，MAPCs =多能成体祖细胞，NF-M =神经丝160-kDa，NF-L =神经丝68kDa， NF-H = 200kDa神经丝200kDa，NGF = β -神经生长因子，NT-3 =神经营养蛋白3，NTRK3 =NT-3受体，Osc =骨钙素，Osp =骨桥蛋白，Runx2 = runt同源结构域转录因子，SSEA-4 = 阶段特异胚抗原4，Trk-A=酪氨酸激酶受体A(也是NGF受体)，TuJl = β_ΙΙΙ_微管蛋白 III。实施例1ADPMSC的分离细胞培养从具有供体知情同意的5至7岁儿童(10个患者)正常剥落的人乳牙提取牙髓。 使用针提取牙髓，将其转移到添加了 1. 25%人血清和添加了 l-50ng/ml (优选地约5-15ng/ ml)血小板衍生的生长因子-BB(PDGF-BB)、l-50ng/ml (优选地约l-15ng/ml)表皮生长因 子(EGF)、l-50ng/ml (优选地约l-15ng/ml)胰岛素样生长因子(IGF)、l-50ng/ml (优选地 约l-15ng/ml)成纤维细胞生长因子_b (FGF_b)、10_1(1至1θΛ 地塞米松或其它适当的类固 醇、0-1 μ g/mL亚油酸和10-50mg/L抗坏血酸的；35-讓培养皿F12/培养基199/CMRL 1066。 牙髓的组织外植体用于分离未成熟的DPMSC。将DPMSC的生长培养物在这些条件下保持1 天，然后将这些细胞放到，任选地分离的，胶原酶/胰蛋白酶/鸡血清(CTC)培养基中和接 种到35-mm培养皿。CTC培养基的使用帮助已发育了更多细胞对细胞连接接点(例如紧密 连接和桥粒)的细胞的分离，并比单独的胰蛋白酶更好地分离具有这样连接的细胞。为了阻止细胞的分化，将该培养物保持半汇合，将细胞每3天传代，培养基一周更 新两次。7天之后，贴壁细胞的小集落产生了。2周之后，DPMSC细胞是显示减少的细胞质的 小的高度增生细胞。生长曲线证实DPMSC在具有2. 5-1. 25-0. 5%人血清(HS)的培养基中都 增殖，但是在0. 5% HS中，培养基需要每天或每两天更换。估计倍增时间在1. 25% -2. 25% HS培养基中是28小时，在0. 25% -0. 5% HS培养基中是四_30小时。DPMSCs显示正常核 型。
表1i首养基平板效率复制时间饥饿之前的天数1-培养基2.5% HS135%28小时5天2-培养基1.25% HS101%28小时4天3-培养基0.5% HS58%29小时3天4-培养基0.25% HS48%30小时2天表1显示平板效率、复制时间和培养基饥饿之前需要的天数的指数。对于冷冻，将细胞以5X IO5细胞/ml重悬浮在含有添加了 1. 25%人血清、生长因 子和 10%二甲基亚砜(Sigma, St. Louis, Mo.，USA)的 F12/ 培养基 199/CMRL 1066 的培养 基中，将温度以每分钟1°C的速度缓慢地和逐渐地降低直到达到最终温度-70°C。此后，将 细胞转移到液氮中。对于解冻具有DPMSC的冷冻小瓶，将小瓶放到37°C水浴中2分钟，此后 用添加了 1.25%人血清的F12/培养基199/CMRL 1066洗两次，并放到培养物中。所有的培 养物在37°C、5% CO2和高湿度环境中温育。尽管高密度的细胞脱离牙髓，但是分化和减慢的增殖都未观察到，如可对培养细 胞的汇合所期望的，特别是缺少特异的生长因子的情况下。同时，胰蛋白酶消化之后，在随 后的铺满培养期间注意到分化和减慢的增殖。不受理论约束，可能是在用胰蛋白酶消化的最初传代之前，外植牙髓作为旁枝培养物可阻止任何干细胞经历过早的分化。t施例IB分离和/或培养DPMSC的方法从具有供体知情同意的5至7岁儿童(10个患者)正常剥落的人乳牙提取牙髓。 使用针提取牙髓，将其转移到具有增殖培养基的35-mm培养皿(Falcon，BD-Biosciences, Italy)，该增殖培养基由添加了 1. 25 %人血清、l-50ng/ml血小板衍生的生长因 子-BB(PDGF-BB，Immunotools, Germany)、l_50ng/ml 表皮生长因子(EGF，Immunotools, Germany)、l_50ng/ml 姨岛素样生长因子-I (IGF-I, Immunotools, Germany)、l_50ng/ml 成纤维细胞生长因子-I(FGF-b，Immunotools, Germany)、10-10 至 10-8M 地塞米松(MP)、 20-100 μ g/L 亚油酸(Sigma，Germany)、10-50mg/L 抗坏血酸(Sigma)和 0. 5ml/L 庆大霉素 (Gibco)的 F-12Coon，s 改良的/Ambesi，s 改良的(Gibco)/ 培养基 199 (Sigma Aldrich, Germany) /CMRL 1066 (Sigma Aldrich, Germany)组成。将 DPMSC 的生长培养物在这些条件 下保持1天，然后将这些细胞放到，任选地分离的，含有胶原酶II 1000U/mL(ffortington, USA)加上CTC溶液(胰蛋白酶0. 5%，Sigma)胶原酶II 22U/mL(Wortington)和鸡血清 0.2% (Gibco)的培养基中。然后将细胞接种到35-mm培养皿。牙髓细胞群不遭受任何类型的耗竭技术(例如免疫耗竭或物理或化学耗竭)，当 2-3周之后原代培养中产生的集落达到汇合时，将细胞用CTC分离，并在增殖培养基中传代 培养到IOOmm皿中。为了阻止细胞的分化，将该培养物保持半汇合，并将细胞以2 · IO3细 胞/cm2的密度每3天传代。实施例2A DPMSC细胞群的表型分析的方法免疫荧光、流式细胞术、FISH和免疫印迹在4%缓冲的多聚甲醛或甲醇/丙酮固定的细胞上进行免疫荧光和FISH分析，而 在P3-P5细胞上进行FACS分析，P3-P5细胞是通过在CTC中短时间温育从培养衬底分离的。 使用适当结合的一抗或用未结合的一抗进行染色，接下来与结合的二抗温育。透化步骤之 后利用htrastain Fixation和透化试剂盒(Dako，Danmark)，遵循制造厂商的说明书，进 行细胞内染色。用共聚焦激光显微镜(LeicaTCS-SP2，Leica Microsystems, Italy)，利用 63X 油浸物镜(数值孔径1. 40)或40X油浸物镜(数值孔径1. 25)进行图象采集。利用活细 胞成像专用系统获得表面荧光和相差图像，该系统由连接到Leica DFC350FX照相机(Leica Microsystems, Italy)的Leica DMI 6000B显微镜组成。为了该目的，采用IOX物镜(数 值孔径0. 25)。利用连接到 Olympus DP50 照相机(Olympus, Italy)的 01ympusAX70 显微 镜捕捉明视野。为了该目的，采用IOX物镜(数值孔径0. 40)。利用AdobePhotoshop软 件构成、覆盖图像和调节对比度(Adobe，USA)。遵循制造厂商的说明书，利用X-和Y-染色体探针(Vysis)进行FISH(荧光原位 杂交)。测定乙醇固定的和普罗匹定碘化物染色的细胞的DNA含量。如制造厂商所推荐的，使用TRIzoI试剂(Gibco，Italy)收集用于免疫印迹的裂 解物，然后用BCA蛋白质含量测定试剂盒(Pierce)和LABSYSTEMS GENESIS V2. 16程序 对其定量。将样品在SDS-PAGE凝胶上电泳并转移到聚偏氟乙烯膜或硝化纤维素转移膜 (Protran nitrocellulose transfer membrane ;Schleicher&Schuell)。 >1夺月莫在具有 BSA 和 0. 5-1% Tween 的 Tris 缓冲的盐水中封闭。使用 ECL 试剂(Amersham Biosciences)检测抗体/抗原复合物。RT-PCR 分析如制造厂商所推荐的，使用TRIzol试剂(Gibco，Italy)从在扩大或分化培养基中 生长的2. 5 X IO6DPMSC细胞提取总RNA。用DNase I (Ambion, USA)处理之后，使用随机的六 核苷酸和M-MLV反转录酶(Invitrogen)用2 μ g总RNA进行第一链cDNA合成。使用80ng 至 150ng 量的 cDNA、10mM Tris-HCl pH 9.0、L5mM MgCl2、0. 2mMdNTPs、每个引物 25pmol 禾口 2U Taq I聚合酶(Amersham，Italy)在50 μ 1的终体积中进行PCR扩增。在表2中描述了 PCR条件。确定最适条件和循环数以允许在PCR线性期内进行样品的扩增。在1-2%琼脂糖 凝胶上分析反应产物。TRAP 测定遵循制造厂商的说明书，利用TRAPeze试剂盒(Chemicon International)进行端 粒末端转移酶活性的检测。核型分析从单细胞衍生的克隆制备中期分裂染色体(Metaphase spreads)，将其在增殖培 养基中培养72小时。根据标准程序，分别使用QFQ和RBA显带技术在400-650带分辨率进 行染色体分析。Von Kossa 染色在直接放到60-W灯前面的透明玻璃科普林缸中用2%硝酸银(Sigma)处理在4% 多聚甲醛中固定20分钟的细胞1小时。将载玻片在蒸馏水(dH20)中漂洗，用2. 5%硫代硫 酸钠(Sigma)固定5分钟，并在ClH2O中洗。用核固红(Sigma)复染细胞1分钟并在自来水 中漂洗。碱性磷酸酶染色将在ostogenic培养基中分化28天的细胞在_20°C在甲醇中固定2分钟，并在 IOOmM Tris-HCl,pH 9. 5、100mM NaCl 和 IOmM MgCl2 缓冲液(Sigma)中洗 10 分钟。然后用 耐久的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐4和氮蓝四唑碱性磷酸酶底物(Sigma)染色载玻片5 至10分钟并在dH20中漂洗。用于糖原检测的过碘酸-Schiff染色将载玻片在过碘酸中氧化5分钟和在ClH2O中漂洗三次。然后用Schiff ’ s试 剂处理载玻片15分钟，在dH20中漂洗5-10分钟，用Mayer’ s苏木素染色1分钟并在dH20 中漂洗。白蛋白和尿素产生分化17天之后，去除培养基。加入新鲜的培养基之前，用HBSS洗细胞。4天之 后，收集上清液并立即速冻。遵循制造厂商的说明书，用ELISA测定法(人白蛋白Elisa Quantitation Kit Bethyl-Montgomery，TX)测定白蛋白浓度。遵循制造厂商的说明书，用 QuantiChromTM尿素测定试剂盒(BioAssay Systems Hayward)测定尿素浓度。实施例2B DPMSC细胞群的表型分析RT-PCR显示 Oct-4 同种型 A-B、Sox-2、Nanog、Klf-4、c_Myc 和 Rex-1 的表达。DPMSC 表达 Rex-I (低)、Klf-4、0ct-4iso A-isoB、Sox_2、Nanog 和 c_Myc 的 mRNA。应指出的是，体细胞中Klf-4、0ct-4iso A-isoB、Sox-2和c_Myc的过量表达能允许它们返回到未分化的 干阶段。比较 DPMSC 中干性转录因子(sternness transcription factors)的 mRNA 表达与 NTERA2胚胎干细胞系。用抗体染色证实约99%的细胞对0ct_4、Sox-2和Nanog是强阳性 的。用流式细胞术进一步证实了 Oct-4和Nanog表达的均一性，而如所预期的，人原始成纤 维细胞对该标记是阴性的。DPMSC细胞在增殖中观察到99%的0CT-4表达，该信号具有细胞质和核定位。免 疫印迹显示具有对照+细胞NTERA-2的相同等级表达的Oct-4两个同种型的存在。免疫荧 光分析显示约96%的DPMSC细胞群表达Oct-4。FACS分析也显示约99%的细胞群在增殖 中表达DPMSC细胞的Sox-2表达，该信号具有细胞质和核定位。约99%的DPMSC细胞在增 殖中表达Nanog，该信号是专有地核定位。在这方面应指出，只有小部分羊膜干细胞显示Oct-4阳性，而根据m-MAPC中的O2 浓度，Oct-4-阳性细胞的百分比从< 0. 01变化至80% (Jiang et al.，2002)。高百分比 的Oct-4、Sox-2和Nanog阳性细胞显示非常均一的干细胞群体。与该观察结果一致，如下 面所显示的，我们注意到全体干细胞群体向着相同组织类型的均一的分化。其它ES标记、 SSEA-3、SSEA-4 和 TRA-1-60、TRA-1-81 和 ALP 在 DPMSC 细胞中较不均一地表达，但 SSEA-I 不是。进行了实验，测定DPMSCs中ALPmRNA表达可与NTERA2细胞相比。在碱性磷酸酶 测定和BICP/NBT底物转化中，DPMSCs显示在增殖期高的酶活性。DPMSCs显示对SSEA-I没 有可检测到的信号和在99%的细胞中对SSEA-3的低但存在的信号。DPMSCs在FACS分析 中对SSEA-4和SSEA-4抗体染色DPMSC同样是92%阳性。针对TRA-1-60的免疫荧光研究 导致对DPMSCs的低但完整的阳性信号。针对TRA-1-81的免疫荧光研究导致对DPMSCS的 低但完整的阳性信号。另外，通过FACS突起细胞对人间质干细胞特异的抗原是均一地阳性并表达高水 平(> 90-95% )的 CD10、CD29、CD13、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CDw90、CD105 和 Oct-4。突起细胞表达低水平的CD66e、KDR、CD133、VE-Cad和CD117。表型是更同源的， 解冻之后获得相同的结果，但是它们的蛋白水平在人DPMSC培养物中降低超过40个细胞倍 增，这可能是由于未分化表型的部分丢失。非常小的百分比(例如< )的DPMSCs的确 表达⑶34和⑶45。以下标记在DPMSC细胞群体中的表达水平如下
权利要求
1.牙髓髓相似细胞(DPMSC)的分离群体，其中所述群体中至少90%的所述细胞共表 达以下标记中的每一种CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CD90、CD105、 Oct-4 同种型 A 和 B、Nanog、Sox-2 和 SSEA-4。
2.权利要求1所述的群体，其中所述群体中至少95%的所述细胞共表达以下标记中的 每一种CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CD90、CD105、Oct-4 同种型 A 和 B、Nanog、Sox-2 和 SSEA-4。
3.权利要求1所述的细胞群体，其中约90-99%的所述细胞群体表达以下标记中的每 一种CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CD90、CD105、Oct-4 同种型 A 和 B、 Nanog、Sox-2 和 SSEA-4。
4.权利要求1-3中任一项所述的群体，其中所述群体中0.25-1%的所述细胞共表达 CD34 和 CD45。
5.权利要求1-3中任一项所述的群体，其中所述群体的所述细胞共表达以下每一个的 mRNA Oct-4 同种型 A 和 B、Nanog、Sox-2, SSEA-4, c_Myc、Klf-4 和 Rex_l。
6.权利要求1-3中任一项所述的群体，其中所述群体具有约观-30小时的平均倍增速度。
7.权利要求1-3中任一项所述的群体，其中所述DPMSCs具有分化成外胚层、内胚层或 中胚层谱系中的一种或多种细胞类型的能力。
8.权利要求1-3中任一项所述的群体，其中所述DPMSCs具有分化成外胚层、内胚层或 中胚层谱系中的至少两种细胞类型的能力。
9.权利要求1-3中任一项所述的群体，其中所述DPMSCs具有分化成外胚层、内胚层或 中胚层谱系中的所有三种细胞类型的能力。
10.权利要求1-3中任一项所述的群体，其中所述DPMSCs是人DPMSCS。
11.来自人牙髓的细胞分离群体，其中所述群体中至少90%的所述细胞共表达以下标 记中的每一种CD10、CD29、CD13、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CDw90、CD105、Oct-4, Nanog、Sox-2和SSEA-4 ；其中所述群体中0. 25_1 %的所述细胞共表达⑶34和⑶45 ；其中 所述细胞具有正常核型；其中所述群体中的所述细胞具有分化成外胚层、内胚层或中胚层 谱系中的至少两种细胞类型的能力。
12.权利要求1-3或11中任一项所述的群体，其中所述细胞具有分化成以下中的任何 一种或多种的能力成骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经胶质细胞和神经元 细胞。
13.权利要求1-3或11中任一项所述的群体，其中所述DPMSCs来自牙齿器官。
14.权利要求12所述的细胞群体，其中所述牙齿器官来自儿童。
15.权利要求12所述的细胞群体，其中所述牙齿器官来自成人。
16.一种细胞分离群体，其已被培养以诱导分化，其中所述起始群体是权利要求1的 DPMSCs，其中所述分化导致所述DPMSC变成选自骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细 胞、神经胶质细胞、神经元细胞、皮肤上皮细胞、肝上皮细胞、胰上皮细胞、胰内分泌细胞、胰 岛细胞、胰外分泌细胞、肠上皮细胞、肾上皮细胞、表皮相关的结构、毛囊、包围牙齿的软组 织、牙本质(牙齿)、釉质(牙齿)和牙骨质(牙齿)的分化细胞。
17.权利要求1-3或11中任一项所述的群体，其中所述群体中的所述细胞的所述基因组还未通过预选择的分离的DNA的插入、通过用预选择的分离的DNA替代所述细胞基因组 的区段、或通过所述细胞基因组的至少部分缺失或失活而被改变。
18.获得权利要求1的DPMSCs群体的方法，包括在添加了选自血小板衍生的生长因子、 胰岛素、硒、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、地塞米松、亚油酸和抗坏血酸 的生长因子的培养基中培养牙髓源，以获得获得权利要求1的DPMSCs群体。
19.权利要求18所述的方法，其中所述DPMSCs是人DPMSCs，所述牙髓源来自人。
20.权利要求18所述的方法，其中共培养贴壁细胞和非贴壁细胞，而没有通过免疫耗 竭、物理耗竭或化学耗竭进行选择。
21.权利要求20所述的方法，其中所述方法不耗竭细胞的所述起始来源或共表达CD3、 ⑶14、⑶19、⑶38、⑶66b和⑶45血型糖蛋白A的单核细胞的所述细胞培养物。
22.权利要求20所述的方法，进一步包括将所述细胞放到细胞培养容器中，其中所述 细胞培养容器不包括细胞外基质(ECM)底物。
23.权利要求20所述的方法，其中血清百分比占约0.5-2. 25%。
24.权利要求18所述的方法，其中所述胰岛素以约10至约50μg/ml的浓度存在，转铁 蛋白以大于0但小于约10 μ g/ml的浓度存在，硒以约0. 1至约5 μ g/ml的浓度存在，亚油 酸以约0至约1 μ g/m的浓度存在，地塞米松以约0. 005至0. 15 μ M的浓度存在，L-抗坏血 酸以约10-50mg/L的浓度存在，血小板衍生的生长因子以约5至约15ng/ml的浓度存在，表 皮生长因子以1至约15ng/ml的浓度存在，胰岛素样生长因子以1至约15ng/ml的浓度存 在，成纤维细胞生长因子b以1至约15ng/ml的浓度存在。
25.将治疗辅助提供给需要其的个体的方法，包括将有效辅助治疗的量的DPMSCs施用 给所述个体。
26.DPMSCs群体，由权利要求18-24中的任一项所述的培养方法产生。
全文摘要
本发明提供分离的牙髓髓相似细胞的分离群体和分离和使用这些细胞的方法。DPMSCs群对CD10、CD29、CD13、CD44、CD49a、CD49d、CD59、CD73、CDw90、CD105、Oct-4同种型A和B、Nanog、Sox-2和SSEA-4是高度同质的。
文档编号C12N5/00GK102131918SQ200980133565
公开日2011年7月20日 申请日期2009年6月26日 优先权日2008年6月26日
发明者F·费罗 申请人:乌迪内大学