专利名称：海绵共附生土曲霉及制备(+)-terrein的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种绵共附生土曲霉及制备(+)-terrein的用途。
背景技术：
土曲霉已被广泛应用于降脂药物洛伐他汀以及化工原料衣康酸的生产，但尚未被用于(+)_terrein的生产。(+)_terrein是一种环戍烯酮类化合物，结构如图I所示，最初即从土曲霉发酵液中分离得到，近年来，人们发现(+hterrein的活性十分多样，不仅具有抗细菌、真菌、杂草的活性，还可以抑制肿瘤细胞血管新生素的分泌，抑制黑色素合成，抑制皮肤角质增生，抑制牙髓细胞炎症反应，促进成骨细胞与钛支架融合等。可以预见(+)-terrein将来在医疗、美容、农业等众多领域会有良好的应用前景。
化学合成制备(+)_terrein的技术往往有总产率不高，且需要采用高温高压等极端反应条件，需要昂贵的反应试剂，或是终产物不具备立体结构的选择性。而目前采用微生物发酵制备(+)-terrein的产量又十分有限，少则数百μ g/L(Phattanawasin P, etal. Weed growth inhibitors from Aspergillus fischeri TISTR 3272. Natural ProductResearch 2007 ;21 :1286-1291)，多则数百mg/L(M. Demasi，et al. Studies on (+) -terreinas a New Class of Proteasome Inhibitors.Journal of the Brazilian ChemicalSociety 2010 ；21 :229-305)，而未能达到具备生产价值的g/L量级。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海绵共附生土曲霉及制备(+)-terrein的用途。本发明的海绵共附生土曲霉分离自中国南海永兴岛Phakellia fusca海绵,其(+)_terrein产量相较于现有其他菌株有较大提高，可达到3. 71g/L。本发明是通过以下的技术方案实现的本发明的海绵共附生土曲霉菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)PF26已经于2011年8月31日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO. 5208。该微生物经分子生物学18S及ITS rDNA基因序列分析，结合形态学观察，确定其分类学地位属于曲霉属(Aspergillus)的土曲霉(Aspergillus terreus),菌株编号为PF26。所述的18S rDNA基因序列已提交GenBank,序列号为JN831364,最相似序列为土曲霉序列⑶227345，最大相似度为99%，以18S rDNA基因序列同源性为基础构建形成包括菌株PF26在内的相关真菌系统发育树如图2所不。所述的ITS rDNA基因序列已提交GenBank,序列号为JN831365,最相似序列为土曲霉序列JN194186，最大相似度为100%，以ITS rDNA基因序列同源性为基础构建形成包括菌株PF26在内的相关真菌系统发育树如图3所不。
18S rDNA基因与ITS rDNA基因的鉴定结果吻合，最相似序列均为土曲霉序列，且在两个系统发育树上PF26的序列也均与土曲霉序列聚类在一起，因此通过分子生物学的鉴定可以说明PF26是一株土曲霉。本发明还涉及上述的海绵共附生土曲霉菌株在制备化合物(+)-terrein中的用途。优选的，所述制备包括将海绵共附生土曲霉菌株进行发酵的步骤。优选的，所述发酵具体为将发酵培养基于115°C灭菌30min ;将土曲霉PF26的孢子接入灭菌后的所述发酵培养基中，接种量为4 X IO6个孢子/mL，于28°C，ISOrpm的摇床培养24天。优选的，所述发酵培养基的配置方法包括如下步骤取葡萄糖28.41g、麦芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麦芽提取物8. 52g、谷氨酸钠10. 00g、氯化铵10. 00g，之后溶于IL 人工海水中，即得所述发酵培养基。优选的，所述人工海水的配置方法包括如下步骤将26. 518g氯化钠、2. 447g氯化镁、3. 305g硫酸镁、I. 141g氯化钙、0. 725g氯化钾、0. 202g碳酸氢钠以及O. 083g溴化钠溶解于IL蒸馏水中，即得，所述配制好的人工海水的pH值为7. O 7. 2。本发明具有的有益效果为本发明提供了海绵共附生土曲霉(Aspergillusterreus)PF26CGMCC NO. 5208 ;其用于化合物(+)-terrein 的生产时，(+)-terrein 的产量相较于现有其他菌株有较大提高，可达到3. 71g/L。
图I 为(+)-terrein 的结构图；图2为土曲霉PF26与相关真菌18S rDNA基因序列系统发育树图；图3为土曲霉PF26与相关真菌ITS rDNA基因序列系统发育树图；图4为土曲霉PF26分生孢子丝的400倍放大光镜照片；图5为土曲霉PF26分生孢子头的扫描电镜照片。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例本实施例是采用土曲霉(Aspergillusterreus)PF26CGMCC NO. 5208 制备化合物(+)-terrein,包括如下步骤I、取海绵共附生土曲霉菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)PF26CGMCCNO. 5208所述土曲霉PF26的形态学特征如下(a)在人工海水察氏培养基上28°C培养时，菌落平坦，质地致密，菌落黄色与浅褐色相间，菌落周围可产生黄色水溶性色素，生长较为缓慢，培养4天菌落直径达到2. 9cm, 7天可达6. Ocm ；(b)在人工海水PDA培养基上28°C培养时，菌落平坦，质地致密，菌落褐色，分生孢子更多，菌落周围可产生黄色水溶性色素，生长较快，培养4天菌落直径达到5. 7cm, 7天可布满平板；(C)该菌株的显微特征在于菌丝有隔，分生孢子头的顶囊半球形，小梗双层，第一层短，第二层长，呈放射状排列，分布顶囊表面2/3，顶端有链形孢子，如图4、5所示；(d) 土曲霉PF26的发酵特征在于该菌株在含有葡萄糖28. 41g、麦芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麦芽提取物8. 52g、谷氨酸钠10. 00g、氯化铵10. OOg及IL人工海水的发酵培养基中，可以产生单一结构的(+)-terrein，当接种量为4X IO6个孢子/mL，在28°C，180rpm的摇床培养24天，(+)-terrein的产量可以达到3. 71g/L。前述中的人工海水，其配置方法包括如下步骤将26. 518g氯化钠、2. 447g氯化镁、3. 305g硫酸镁、I. 141g氯化钙、O. 725g氯化钾、O. 202g碳酸氢钠以及O. 083g溴化钠溶 解于IL蒸馏水中，即得，所述配制好的人工海水的pH值为7. O 7. 2。2、制备发酵培养基所述发酵培养基的配置方法包括如下步骤取葡萄糖28. 41g、麦芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麦芽提取物8. 52g、谷氨酸钠10. 00g、氯化铵10. OOg,之后溶于IL人工海水中，即得所述发酵培养基；3、发酵制备化合物(+)-terrein培养基在250mL三角瓶中装液量为IOOmL,于115°C灭菌30min ;将土曲霉PF26的孢子接入灭菌后的培养基，使接种量为4X IO6个孢子/mL，在28°C、180rpm的恒温摇床中培养，pH自然；培养24天，发酵液上清中的(+)-terrein产量可以达到3. 71g/L。培养结束后将发酵液抽滤，分离上清与菌体。上清用等体积乙酸乙酯萃取3轮，减压蒸馏回收乙酸乙酯后，得到乙酸乙酯提取物。该提取物经ODS柱水甲醇=7 3(v/v)洗脱及反相HPLC纯化制备得到纯化的主发酵产物。该主发酵产物经质谱测定分子量为154. 1，其核磁数据如表I所示，其0. 1%和1%(w/v)的水溶液的比旋光值分别为[a ]D =+168° (c = 0. 1,H20)和[a ]D =+163。(c =I，H2O)，与文献数据比对，可以确定该主发酵产物为(+)-terrein。表I.发酵产物的核磁数据(400MHz，DMS0_d6)
权利要求
1.一种海绵共附生土曲霉菌株，其特征在于，所述海绵共附生土曲霉菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)PF26CGMCC NO. 5208。
2.一种海绵共附生土曲霉菌株在制备化合物(+hterrein中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述制备包括将海绵共附生土曲霉菌株进行发酵的步骤。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述发酵包括如下步骤将发酵培养基于115°C灭菌30min ;将土曲霉PF26的孢子接入灭菌后的所述发酵培养基中，接种量为4 X IO6个孢子/mL，于28°C，180rpm的摇床培养24天。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述发酵培养基的配置方法包括如下步骤取葡萄糖28. 41g、麦芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麦芽提取物8. 52g、谷氨酸钠10. 00g、氯化铵10. 00g，之后溶于IL人工海水中，即得所述发酵培养基。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述人工海水的配置方法包括如下步骤将26. 518g氯化钠、2. 447g氯化镁、3. 305g硫酸镁、I. 141g氯化钙、0. 725g氯化钾、0. 202g碳酸氢钠以及0. 083g溴化钠溶解于IL蒸馏水中，即得，所述配制好的人工海水的pH值为.7.O 7. 2。
全文摘要
本发明公开了一种海绵共附生土曲霉及制备(+)-terrein的用途。所述海绵共附生土曲霉菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)PF26CGMCC NO.5208。所述海绵共附生土曲霉菌株用于制备化合物(+)-terrein时包括将海绵共附生土曲霉菌株进行发酵的步骤，具体为将发酵培养基于115℃灭菌30min；将土曲霉PF26的孢子接入灭菌后的所述发酵培养基中，接种量为4×106个孢子/mL，于28℃，180rpm的摇床培养24天。本发明的海绵共附生土曲霉分离自中国南海永兴岛Phakellia fusca海绵，其(+)-terrein产量相较于现有其他菌株有较大提高，可达到3.71g/L。
文档编号C12R1/66GK102827777SQ20121000794
公开日2012年12月19日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者殷颖, 李志勇, 张风丽, 孙伟, 余智生, 丁博 申请人:上海交通大学