一种上皮组织、以及体外构建上皮组织的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种上皮组织构建方法，尤其涉及一种以角化细胞为细胞来源构建上皮组织的方法。
【背景技术】
[0002]生物支架材料为细胞提供了一个良好的黏附、生长、迀移、增殖和分化的环境，目前应用于上皮组织构建的生物支架有脱细胞真皮基质、细菌纤维素、胶原类支架等。
[0003]Life scinece公司研制的Alloderm(ADM)已经成为一种商品化材料，可促进表皮细胞的生长、增殖。但是ADM来源有限，并有传播病毒性疾病的危险。Sanchavanakit在细菌纤维素上体外培养人角质形成细胞和成纤维细胞，结果发现细菌纤维素能支持两种细胞的生长，但是对成纤维细胞的粘附性较差，需进一步进行修饰。Jansen将胶原支架植入大鼠口腔腭部，发现支架能逐渐整合入大鼠体内，Moharamzadeh研究发现几种胶原膜交联处理后获得的胶原膜更适合细胞的粘附。Zou等以壳聚糖-胶原-硫酸软骨素为支架培养细胞，发现材料与细胞粘附性较好，生物相容性良好，并预测胶原类支架在口腔上皮修复中有很大的应用。但由于胶原物质脆性较高，限制了其在组织工程中的应用。
【发明内容】
[0004]针对目前组织工程支架材料应用中存在的缺陷，本发明提供了一种体外构建上皮组织的方法、以及该方法构建的上皮组织。
[0005]本发明第一个方面是提供一种体外构建上皮组织的方法，步骤包括:
[0006]将角化细胞在胰蛋白酶中进行消化，
[0007]收集、并筛选消化后的悬浮细胞；
[0008]筛选出的细胞接种于真皮基质上进行培养，得到上皮组织。
[0009]其中所述角化细胞优选为由如下任意一种或几种种子细胞诱导分化所得:角质形成细胞、脂肪来源的基质细胞、干细胞。
[0010]所述干细胞可以是胚胎干细胞，或胚胎干细胞以外的具有转分化为角化细胞的能力的干细胞，如骨髓间充质干细胞、毛囊干细胞及外周血干细胞。
[0011]其中，所述种子细胞优选为干细胞，更优选为胚胎干细胞。
[0012]其中，诱导分化方法优选为:
[0013]将干细胞(并优选为胚胎干细胞)加入到含有维甲酸、骨形成蛋白4以及抗坏血酸的诱导试剂中，进行诱导；
[0014]然后转移至角化细胞培养基中培养，得到角化细胞。
[0015]其中，诱导分化过程中，诱导时间优选为至少2天，更优选为3-15天，更优选为4-12天，更优选为5-10天，更优选为7-8天。
[0016]其中，诱导分化过程中，在角化细胞培养基中的培养时间优选为至少5天，更优选为至少10天，更优选为2-6周，更优选为4-5周。
[0017]在本发明的一种优选实施例中，所述消化过程中，胰蛋白酶重量浓度优选为0.01-0.5%,更优选为 0.02-0.4%，更优选为 0.05-0.2%。
[0018]在本发明的一种优选实施例中，所筛选的悬浮细胞为消化至少2分钟后的悬浮细胞，优选为消化3-10分钟内的悬浮细胞，更优选为消化4-8分钟内的悬浮细胞，更优选为消化5-6分钟内的悬浮细胞。
[0019]在本发明的一种优选实施例中，所述真皮基质优选为胎牛脱细胞真皮基质。
[0020]其中，所述真皮基质优选为经过Matrigel浸泡，更优选为经过F12稀释的Matrigel浸泡，然后置于角化细胞培养基中。
[0021]其中，所述浸泡优选为在25-40°C条件下进行，更优选为30-35°C条件下进行。
[0022]其中，所述浸泡的时间优选为至少20分钟，更优选为至少25分钟，更优选为25-60分钟，更优选为30-45分钟。
[0023]在本发明的一种优选实施例中，所述细胞接种可以是常规接种、局部注入。
[0024]更优选地，所述接种方法为:将细胞接种于真皮基质上之后，在已经接种的细胞上覆盖一层真皮基质。
[0025]在本发明的一种优选实施例中，在接种后，细胞培养时间优选为至少10天，更优选为2-6周，更优选为4-5周。
[0026]本发明第二个方面是提供一种上述任意体外构建上皮组织的方法所制备的上皮组织。
[0027]本发明细胞来源经过胰酶消化后，所得悬浮细胞与正常口腔黏膜角质形成细胞相似，通过接种培养，形成复层结构，所构建的组织中含有CK14阳性表达细胞，并且与正常口腔黏膜上皮组织中的基底细胞层中细胞类似。
【附图说明】
[0028]图1为不同消化时间细胞CK14阳性率，其中，图1A为阴性对照，图1B为消化2分钟，图1C为消化5分钟。
[0029]图2为对胰蛋白酶敏感性不同的两种细胞形态学观察，其中，A为对胰蛋白酶敏感的细胞的形态，B为5分钟时消化完全的细胞的形态；
[0030]图3为本发明一种实施例中体外构建的上皮组织HE染色观察结果，其中，A1为常规接种，A2为局部注入，A3为夹层法接种，B为未经Matrigel处理的真皮基质接种；
[0031]图4为本发明一种实施例中体外构建的上皮组织细胞中CK14表达检测结果(A和B分别为100和200倍放大结果)，以及正常口腔黏膜组织基底膜细胞层CK14表达检测结果(C和D分别为100和200倍放大结果)；
[0032]图5为本发明一种实施例中免疫组织化学检测P63表达的分布；
[0033]图6为本发明一种实施例中体外构建的上皮组织中CK15表达的免疫荧光检测结果，以及正常口腔黏膜组织基底膜细胞层CK15表达的免疫荧光检测结果检测结果；
图7为本发明一种实施例中体外构建的上皮组织扫描电子显微镜观察超微结构照片(A、B分别为不同倍数放大照片)。
【具体实施方式】
[0034]步骤1、将角化细胞在胰蛋白酶中进行消化
[0035]向角化细胞中加入0.05%胰蛋白酶，放入细胞培养箱培养，每分钟显微镜下观察细胞消化情况，收集经消化后悬浮的细胞，再对收集后的细胞进行流式细胞术检测CK14阳性率，比较CK14阳性率最高的那组胰蛋白酶消化时间与其他组之间的差异，从而得出CK14阳性率最高的那组胰蛋白酶胰蛋白酶消化时间，根据胰蛋白酶敏感性筛选出所需细胞。
[0036]通过实验发现，作用2min后便有部分细胞呈悬浮状态，收集这部分细胞，剩余细胞在4min内未悬浮，在消化第5min时细胞呈悬浮状态，故将这两部分细胞分别通过流式细胞仪进行检测，检测结果显示，2min内消化完全的细胞CK14阳性率为1.05%,5min时消化完全的细胞CK14阳性率为74.80%。如图1所示，其中，A:阴性对照组；B:细胞经胰蛋白酶消化2min时悬浮细胞中CK14阳性细胞比例为1.05%，说明此时悬浮细胞中仅有少量细胞表达CK14 ;大部分细胞不表达CK14，提示此部分细胞大部分为非角化细胞；C:细胞经胰蛋白酶消化5min时悬浮细胞中CK14阳性细胞比例较大，说明此时被胰蛋白酶消化下的细胞多具有角化细胞的特征。
[0037]因此，筛选胰蛋白酶消化5分钟时的悬浮细胞。
[0038]步骤2、接种构建上皮组织
[0039]组织工程支架选择胎牛脱细胞真皮基质(FB-ADM，海澳口腔修复膜，烟台正海生物有限公司)，FB-ADM经浓度为100单位/ml青链霉素的PBS洗涤5_7次后，吸净真皮基质中的 PBS。
[0040]研究分组:A1、A2、A3组:将FB-ADM浸泡在F12稀释的Matrigel液体中30摄氏度存放30min，然后取出FB-ADM，加入KSFM培养液。B1、B2、B3组:不用Matrigel稀释液浸泡直接放于KSFM培养基中处理，两组脱细胞真皮基质处理后均置于细胞培养箱中过夜，备用。
[0041]先通过HE染色初步观察细胞与不同处理的FB-ADM粘附情况，根据细胞与FB-ADM粘附情况作其他进一步检测。为了促进接种后细胞与FB-ADM表面的接触并进一步发生粘附，我们采用了三种不同的细胞接种方法，其中夹层法是指细胞接种于FB-ADM后，再在细胞上面盖一层FB-ADM，目的是防止接种后细胞悬浮致使细胞数量减少，同时上下两层真皮基质扩大了细胞与FB-ADM的接触面积，更有利于细胞与FB-ADM的粘附，详细分组如下:
[0042]A1:E-KCs常规消化后接种于Matrigel处理的FB-ADM
[0043]A2:E-KCs细胞悬液局部注入Matrigel处理的FB-ADM
[0044]A3:采用夹层法观察细胞接种后与Matrigel处理的FB-ADM的粘附情况
[0045]对照组:
[0046]B1:E-KCs常规消化后接种于无Matrigel处理的FB-ADM
[0047]B2:E-KCs细胞悬液局部注入无Matrigel处理的FB-ADM
[0048]B3:采用夹层法观察细胞接种后与无Matrigel处理的FB-ADM粘附情况
[0049]空白对照组:C:无细胞接种的FB-ADM。
[0050]组织学检杳
[0051]以上研究细胞接种于FB-ADM 4周后，分别对各组标本进行组织学检查，步骤如下:
[0052]取各组标本，放入装有10%甲醛固定液的管子中固定。
[0053]组织脱水:将固定后的组织依次放入如下试剂中:70%酒精30分钟；95%酒精90分钟，重复一次；100%酒精90分钟，一共重复两次。
[0054]透明:将脱水后的组织放入二甲苯溶液中，浸泡15-20分钟，一共重复两次。
[0055]包埋:将透明后的组织浸于融化的石蜡