中(60°C )，等待蜡块固定。
[0056]切片:将包埋好的组织蜡块切成5 μπι厚的组织薄片。
[0057]展片:将5 μm的组织薄片铺在室温的水面上，使组织充分展平。
[0058]捞片:将展平后组织薄片捞在预先备好的载玻片上。
[0059]将载玻片放在37°C的烘干机上烘干。
[0060]脱蜡:将烘干后的载玻片经过如下流程进行脱蜡处理:二甲苯溶液，5分钟，重复两次；100%无水乙醇，5分钟，一共重复两次；95%乙醇，5分钟，重复两次；70%乙醇，5分钟；蒸馏水5分钟。
[0061 ] 苏木素伊红中染色至适当颜色深度，流水冲洗。
[0062]脱水透明化，封片:浓度70 %酒精浸泡2分钟，重复两次；95 %酒精浸泡2分钟，重复两次。100%酒精2分钟，重复一次；二甲苯，5分钟，重复一次。中性树胶封片。
[0063]光镜下观察。
[0064]根据对胰蛋白酶敏感性的不同筛选出两种细胞，一种细胞对胰蛋白酶较敏感，2min时细胞即已经消化完全，而另外一种细胞在胰蛋白酶消化第4-5min时才完全消化，对以上两类细胞进行培养发现，容易被胰蛋白酶消化的细胞传代后细胞形态不均一，细胞体积较小且核不明显，细胞散在贴壁生长(如图2A)，而对5min时消化完全的细胞进行传代培养观察细胞形态均一，细胞为多边形，铺路石样排列，与正常口腔黏膜角质形成细胞相似(如图2B)。
[0065]疫组织化学染佴观察构律组织中CK14阳件细朐分布
[0066]组织片脱蜡:将组织切片依次放入三个盛有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸浸泡15分钟。依次放入两个装有无水乙醇溶液的玻璃缸中浸泡，每缸浸泡5分钟。依次放入两个装有95 %乙醇溶液的玻璃缸，每缸浸泡5分钟。依次放入90 %乙醇溶液、85 %乙醇溶液、75%乙醇溶液的玻璃缸中浸泡，每缸浸泡2分钟，取出。放入盛蒸馏水的玻璃缸中清洗三次。
[0067]抗原修复:将切片浸于IX柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压条件下煮沸后继续加热2分钟，停止加热后让切片自然冷却，避免骤冷后组织脱片。
[0068]封闭内源性过氧化氢酶:组织切片放于3% H202溶液的玻璃缸中，浸泡15分钟，然后放入蒸馏水的玻璃缸中清洗3次。再放入IX PBS缓冲液的玻璃缸中浸泡5分钟。
[0069]抗体杂交:
[0070]①去净PBS余液，将组织载玻片平辅于湿盒中，滴加正常山羊血清封闭液1滴约20 μ 1，室温放置20分钟，甩去多余液体。封闭液能阻断组织与抗体非特异性结合，降低组织的背景染色。
[0071]②滴加稀释好的一抗1滴约20-50 μ 1 (浓缩液要适当比例稀释，滴加量要根据组织大小进行相应调整)，同型对照管中加入CK14同型对照抗体，置于湿盒37°C下1-2小时或4°C过夜。之后置于1XPBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5分钟，更换PBS缓冲液，同法重复三次。
[0072]③加入二抗20-50 μ 1 (容积根据组织块大小进行相应调整)，放置于湿盒，37°C或室温放置30分钟。之后放于1XPBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5分钟，更换PBS缓冲液，同法重复三次，甩干。
[0073]显色:
[0074]①加入链亲和素-辣根过氧化物酶20-50 μ 1 (容积根据组织块大小进行相应调整)，湿盒内室温放置5-20分钟，甩干。之后放于1XPBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5分钟，更换PBS缓冲液，同法重复三次，甩干。
[0075]②滴加新鲜配制成的DAB工作液100 μ 1 (容积根据组织块大小进行相应调整，使其覆盖组织为宜)，镜下观察反应部位有无黄褐色变化，控制反应的时间，一般在3?5分钟，置于装有自来水玻璃缸中涮洗3次。
[0076]复染:苏木精溶液中复染载玻片，放置2min后，用自来水反复洗涤至水不变色，再用1%盐酸酒精分化l_2s后用自来水冲洗后，流水蓝化15分钟。
[0077]脱水、透明和封片:依次经乙醇脱水、二甲苯透明后滴加适量中性树胶，封片，晾干。
[0078]光镜下观察。
[0079]通过HE染色发现，Bl、B2、B3三组均未见细胞粘附于FB-ADM上面生长(图3中B)，其标本HE染色与空白对照组C组相同。
[0080]而Al、A2、A3三组中均见有细胞与FB-ADM粘附，但Al、A2组中只见有少量细胞粘附于FB-ADM，并且细胞形态不规则，细胞与细胞间分界不清，细胞核极不明显，未见铺路石样细胞存在(如图3中A1吉尔A2)。而A3组细胞能够在FB-ADM中粘附生长，细胞与细胞间的界限清晰，可见细胞核存在，细胞大部分为多边形并可形成复层结构(如图3中A3)，并且与FB-ADM发生粘附的细胞形态与其他细胞有结构上的差异，类似于正常口腔黏膜上皮中各细胞层之间的差异。
[0081]体外构建的组织中有CK14阳性表达的细胞，并且发现CK14阳性表达的细胞与周围的FB-ADM紧密接触(如图4中A、B)，类似于正常口腔黏膜上皮组织中的基底细胞层中细胞(如图4中C、D)。
[0082]免疫荧光观察构律组织中CK15分布
[0083]包埋好的标本用切片机切石蜡切片(5微米)，并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。载玻片上的组织切片经烘片、二甲苯梯度脱蜡、乙醇梯度复水后进行抗原修复、正常山羊血清封闭后孵一抗，一抗于37°C条件下孵育1小时或4°C孵育过夜后洗涤，加入荧光二抗室温下于湿盒中避光孵育1小时，PBS洗涤3次，每次5分钟，滴加DAPI避光条件下孵育2分钟，再对标本进行显核，蓝色荧光。PBS洗涤3次后封片，在荧光显微镜下立即观察。
[0084]通过对CK15进行免疫荧光标记发现，接种后CK15阳性细胞散在分布于构建组织中(如图5中A和B)，其分布于正常口腔黏膜组织中CK15的分布(如图5中C和D)类似。
[0085]扫描电子显微镜观0察细胞间连接
[0086]在人工构建的组织中，细胞与细胞间可见桥粒连接(图6中A、B)
[0087]本发明采用胎牛脱细胞真皮基质经过Matrigel处理，细胞更容易与此材料发生粘附，可见其具有一定的生物相容性，这是由于此材料在制作过程中，真皮基质中胶原物质的水解产物受热后消除了本身的抗原性。由于制成的真皮基质具有一定的韧性，解决了单纯使用胶原做生物支架脆性较大的问题。同时它具有三维空间结构，上能够引导细胞生长和血管化，促进组织再生。
[0088]同时发现，夹层法相比其他两种方法也能促进细胞与FB-ADM的粘附，这可能是因为夹层法降低了细胞接种后悬浮的概率，同时扩大了细胞与FB-ADM的接触面积，最终促使了更多细胞与FB-ADM发生粘附并增殖、生长。
[0089]本发明构建的组织中有CK14阳性表达的细胞，并且发现CK14阳性表达的细胞与周围的FB-ADM紧密接触，类似于正常口腔黏膜上皮组织中的基底细胞层中细胞。接种后CK15阳性细胞散在分布于构建组织中，其分布于正常口腔黏膜组织中CK15的分布类似。
[0090]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种体外构建上皮组织的方法，其特征在于，步骤包括: 将角化细胞在胰蛋白酶中进行消化， 收集、并筛选消化后的悬浮细胞； 筛选出的细胞接种于真皮基质上进行培养，得到上皮组织； 其中，所述真皮基质为经过Matrigel浸泡的胎牛脱细胞真皮基质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化过程中，胰蛋白酶重量浓度为0.01-0.5% ο3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所筛选的悬浮细胞为消化至少2分钟后的悬浮细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所筛选的悬浮细胞为消化4-8分钟内的悬浮细胞。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浸泡在25-40°C条件下进行，所述浸泡的时间至少20分钟。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种方法为:将细胞接种于真皮基质上之后，在已经接种的细胞上覆盖一层真皮基质。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述角化细胞由如下任意一种或几种种子细胞诱导分化所得:角质形成细胞、脂肪来源的基质细胞、干细胞。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述干细胞选自骨髓间充质干细胞、毛囊干细胞及外周血干细胞。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述干细胞为胚胎干细胞。10.一种权利要求1所述体外构建上皮组织的方法所制备的上皮组织。
【专利摘要】本发明提供了一种体外构建上皮组织的方法，所述方法包括：将角化细胞在胰蛋白酶中进行消化，收集、并筛选消化后的悬浮细胞；筛选出的细胞接种于真皮基质上进行培养，得到上皮组织。本发明还提供了上述方法构建的上皮组织，本发明构建的组织中有CK14阳性表达的细胞，并且发现CK14阳性表达的细胞与周围的FB-ADM紧密接触，类似于正常口腔黏膜上皮组织中的基底细胞层中细胞。接种后CK15阳性细胞散在分布于构建组织中，其分布于正常口腔黏膜组织中CK15的分布类似。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105255813
【申请号】CN201510501770
【发明人】周海文, 赵厚明
【申请人】上海交通大学医学院附属第九人民医院
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年8月14日