【
技术领域：
】本发明涉及一种核酸提取方法，特别是涉及一种基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法。
背景技术：
：目前，核酸提取的原则一般为保证核酸一级结构的完整性，排除其它分子的污染。核酸提取应注意的问题：简化步骤，缩短提取时间，减少化学因素对核酸的降解，减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温，防止核酸的生物降解，核酸提取大致分为四个步骤：裂解、核酸富集、洗涤两次、洗脱纯化。常用提取方法操作复杂，且液体试剂不方便保存和运输。因此，有必要提供一种新的基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法来解决上述问题。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法，操作简单，样本被吸附在固相介质干燥后便于保存和运输，解决了目前临床样本运输不便的难题。本发明通过如下技术方案实现上述目的：一种基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法，其包括以下步骤，1)采样：采用纳米多向层析固相载体接触吸收额定饱和体积的体液样本；2)固化层析：避光静置5小时以上，直至层析固相基质自然干燥；3)洗脱：在温度为93～97℃的温浴条件下，用200ul～500ulte缓冲液震荡30min洗脱，得到核酸。进一步的，所述步骤1)中采用的所述纳米多向层析固相载体包括基材与渗入所述基材中的提取物，所述提取物包括位于第一层的盐酸胍、sds、edta混合物，位于第二层保护剂，位于第三层的盐酸胍、sds、edta混合物及位于第四层的保护剂，所述第一层的盐酸胍、sds、edta混合物与第三层的盐酸胍、sds、edta混合物含量不同。进一步的，所述保护剂为羟乙基淀粉。进一步的，所述步骤2)中的所述静置环境中，其温度为18～25℃、相对湿度为20±2％。进一步的，所述步骤3)中的震荡转速为1000～1200rpm。与现有技术相比，本发明一种基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法的有益效果在于：采用纳米多向层析固相载体来对液体样本进行采用，将液体样本进行固化，便于运输、保存，还可以将液体样本中的病毒或细胞破碎，便于完成核酸的提取和纯化；结合各种技术参数，如干燥时间、震荡程度、浸泡温度、浸泡时间以及洗脱溶液的确定，保障核酸提取完全；相比于原有提取步骤操作更简便。【具体实施方式】实施例一本实施例一种基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法，其包括以下步骤，1)采样：采用纳米多向层析固相载体接触吸收额定饱和体积的体液样本；2)固化层析：避光静置5小时以上，其中温度为18℃，相对湿度为18％，直至层析固相基质自然干燥，；3)洗脱：在温度为93℃的温浴条件下，用200ulte缓冲液震荡30min洗脱，震荡转速为1000rpm，得到核酸。所述步骤1)中采用的所述纳米多向层析固相载体包括基材与渗入所述基材中的提取物，所述提取物包括位于第一层的盐酸胍、sds、edta混合物，位于第二层保护剂，位于第三层的盐酸胍、sds、edta混合物及位于第四层的保护剂，所述第一层的盐酸胍、sds、edta混合物与第三层的盐酸胍、sds、edta混合物含量不同。所述保护剂为羟乙基淀粉。te是由tris(三羟甲基氨基甲烷)和edta(乙二胺四乙酸)配置而成的，主要用于溶解核酸，能稳定储存核酸。实施例二本实施例一种基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法，其包括以下步骤，1)采样：采用纳米多向层析固相载体接触吸收额定饱和体积的体液样本；2)固化层析：避光静置5小时以上，其中温度为21℃，相对湿度为20％，直至层析固相基质自然干燥，；3)洗脱：在温度为95℃的温浴条件下，用350ulte缓冲液震荡30min洗脱，震荡转速为1100rpm，得到核酸。所述步骤1)中采用的所述纳米多向层析固相载体包括基材与渗入所述基材中的提取物，所述提取物包括位于第一层的盐酸胍、sds、edta混合物，位于第二层保护剂，位于第三层的盐酸胍、sds、edta混合物及位于第四层的保护剂，所述第一层的盐酸胍、sds、edta混合物与第三层的盐酸胍、sds、edta混合物含量不同。所述保护剂为羟乙基淀粉。te是由tris(三羟甲基氨基甲烷)和edta(乙二胺四乙酸)配置而成的，主要用于溶解核酸，能稳定储存核酸。实施例三一种基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法，其包括以下步骤，其包括以下步骤，1)采样：采用纳米多向层析固相载体接触吸收额定饱和体积的体液样本；2)固化层析：避光静置5小时以上，其中温度为25℃，相对湿度为22％，直至层析固相基质自然干燥，；3)洗脱：在温度为97℃的温浴条件下，用500ulte缓冲液震荡30min洗脱，震荡转速为1200rpm，得到核酸。所述步骤1)中采用的所述纳米多向层析固相载体包括基材与渗入所述基材中的提取物，所述提取物包括位于第一层的盐酸胍、sds、edta混合物，位于第二层保护剂，位于第三层的盐酸胍、sds、edta混合物及位于第四层的保护剂，所述第一层的盐酸胍、sds、edta混合物与第三层的盐酸胍、sds、edta混合物含量不同。所述保护剂为羟乙基淀粉。te是由tris(三羟甲基氨基甲烷)和edta(乙二胺四乙酸)配置而成的，主要用于溶解核酸，能稳定储存核酸。为了验证采用本实施例基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法提取的核酸效果是否理想，本实施例针对不同的条件进行了核酸提取效果的对比，其结果如表1-表4所示。表1不同干燥时间下的hivrna提取结果表2不同干燥时间下的ctdna提取结果由表1与表2可以看出，干燥时间为5-6小时后抽提的结果明显好于干燥时间小于5小时的样本。若干燥不完全一定会影响核酸的抽提效果，因此，在干燥过程中，一定要保证干燥时间为5小时以上。表3不同体积的各洗脱溶液下的提取结果表3中针对不同体积的各洗脱溶液的提取测试中，其他条件为：温度56℃、震荡转速为1000rpm、温浴1小时。由表3可知，200ul与500ul目前看起来差异不是很大，但考虑到浓缩效果，优先选择200ul。表4各洗脱溶液在不同震荡速度下的提取结果表4中针对各洗脱溶液在不同震荡速度下的提取测试中，其他条件为：温度56℃、洗脱体积为200ul、温浴1小时。由表4可知，1000rpm震荡速度洗脱结果优于500rpm和静置。表5各洗脱溶液在不同温浴时间下的提取结果表5中针对各洗脱溶液在不同温浴时间下的提取测试中，其他条件为：温度56℃、洗脱体积为200ul、震荡转速为1000rpm。由表5可知，10min的温浴时间无法满足需求，30min与1h针对不同洗脱液各有优劣。表6各洗脱溶液在不同温浴温度下的提取结果表6中针对各洗脱溶液在不同温浴温度下的提取测试中，其他条件为：洗脱体积为200ul、震荡转速为1000rpm、温浴30min。由表6可知，室温无法满足需求，95℃温浴优于56℃。表7各洗脱溶液与柱提法的核酸提取结果样本名称柱提法其它公司洗脱液生理盐水te缓冲液试子样本131.9132.7330.2630.31试子样本233.3931.6830.2831.77试子样本331.7931.9130.2730.13试子样本430.9630.4730.1629.87试子样本532.6130.1830.2333.8试子样本632.4130.1530.1629.83试子样本731.730.4429.6730.63试子样本830.8330.1830.5829.74ntcn/an/an/an/a表7中针对各洗脱溶液在洗脱体积为200ul、震荡转速为1000rpm、温浴30min、温浴温度为95℃条件下得到的核酸提取结果。本实施例基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法的原理为：固相介质可在接触并吸收体液样本的同时对体液中的细胞、病毒等进行固定保护，避免核酸降解；在随后的脱水过程中，预制配方组分通过多向层析作用多层次逐次释放、渗透、浓缩，在固相表面及内部限制容积中，对体液样本中的细胞、病毒等核酸样本实现富集、纯化、分离杂质等核酸提取过程。利用基质材料的表面特性、内部结构特性及限制容积特性，通过多向层析等“自动”物理化学过程，在基质材料中实现了按顺序分步添加功能处理组分、容积转换、混合/吸附/分离等核酸提取过程。本实施例基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法的有益效果在于：采用纳米多向层析固相载体来对液体样本进行采用，将液体样本进行固化，便于运输、保存，还可以将液体样本中的病毒或细胞破碎，便于完成核酸的提取和纯化；结合各种技术参数，如干燥时间、震荡程度、浸泡温度、浸泡时间以及洗脱溶液的确定，保障核酸提取完全；相比于原有提取步骤操作更简便。以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。当前第1页12