本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种中华大蟾蜍溶菌酶。
背景技术：
抗生素滥用在当今世界引发的生态环境灾难以及它们导致的对人类健康的影响已经越来越引发世界的关注。寻找活性更好和特异性更高的抗生素替代品成为当务之急的事情，因此，具有抗菌活性的多肽类物质-抗菌肽(amp)成为新的研究热点，其中，以maganin为代表的两栖动物源amp尤其引人瞩目。两栖类动物皮肤分泌物的研究多集中在多肽类物质的鉴定和功能上。如非洲爪蟾xenopyslaevis的抗菌多肽magainin及中国大蹼铃蟾bombinamaxima的抗菌多肽maximin在极低浓度就对肿瘤细胞显示杀伤作用，并且它们可选择性地作用于肿瘤细胞而对机体正常组织细胞无影响。此外还有更多的两栖类皮肤分泌多肽在很低浓度水平就显示强大而广谱的抗菌活性，如中国大蹼铃蟾的抗菌肽maximin3在1.5μg/ml的含量水平时就可以完全抑制大肠杆菌、巨大芽孢杆菌bacillusmagaterium以及痢疾杆菌shigelladysenteriae的生长。也有一些肽类对肌体具有一定的副作用，如中国大蹼铃蟾的maximinh抗菌肽、日本沼蛙的brevinin-1抗菌肽以及东方铃蟾bombintororientalis的bombininh抗菌肽均具有很强的溶血活性。因此，两栖类动物的皮肤分泌多肽是一类多样性极为丰富且功能非常显著的活性物质，极具研究价值和广阔的应用前景。
中华大蟾蜍皮肤分泌物经干制后称为蟾酥，是我国传统中药，在我国历史上长期用于强心、麻醉、抗菌消炎、止咳等用途，进而发现蟾酥具有抑制肿瘤的功效。现代药理学研究发现蟾酥中含有的强心甾体化合物和吲哚生物碱类化合物对肿瘤细胞具有较强的细胞毒性和抑制活性，并陆续发现了蟾毒灵、华蟾毒精等具有抗肿瘤活性的单体化合物。近期，来源自中华大蟾蜍的cathelicidin-bg被报道具有抗革兰氏阳性细菌活性，这是首次报道来源中华大蟾蜍的活性抗菌多肽。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种中华大蟾蜍溶菌酶，该溶菌酶重组表达产物对两种革兰氏阳性细菌、两种革兰氏阴性细菌和两种真菌生长的抑制。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种中华大蟾蜍溶菌酶，其具有seqidno：1所示的核苷酸序列。
该溶菌酶重组表达产物对两种革兰氏阳性细菌、两种革兰氏阴性细菌和两种真菌生长具有抑制作用。
其中，所述溶菌酶重组表达产物通过以下步骤合成：
s1、用trlzol试剂法提取中华大蟾蜍的腺体组织的总rna，用revertraaceqpcrrtkit(toyobo，japan)反转录试剂盒将总rna反转录为cdna；
s2、用添加酶切位点的引物
5’-ccggaattcaagtatgaaaaatgcgaacttgcta-3’和
5’-cccttcgaattaaagtttgcatccttgagtcca-3’为引物；
以以上步骤合成的cdna为模板扩增中华大蟾蜍溶菌酶功能域编码序列片段；
s3、将克隆片段用dna纯化试剂盒进行纯化，纯化后的dna片段与pet-28空质粒均用ecori和hindiii进行双酶切，反应条件是37℃放置8h；反应结束后将酶切产物再次用dna纯化试剂盒进行纯化，并将纯化后的dna片段和pet-28空质粒的片段用t4dna连接酶进行连接。
本发明具有以下有益效果：
该溶菌酶重组表达产物对两种革兰氏阳性细菌、两种革兰氏阴性细菌和两种真菌生长具有抑制作用。
附图说明
图1为本发明实施例中溶菌酶的抑菌实验结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中，所使用的中华大蟾蜍(100-130g)采集自杭州市临安，将耳后皮肤腺用75％的乙醇进行表面消毒，然后解剖其中的腺体组织。
实施例
用trlzol试剂法提取中华大蟾蜍的腺体组织的总rna，用revertraaceqpcrrtkit(toyobo，japan)反转录试剂盒将总rna反转录为cdna；
用添加酶切位点的引物
5’-ccggaattcaagtatgaaaaatgcgaacttgcta-3’和
5’-cccttcgaattaaagtttgcatccttgagtcca-3’为引物，
以以上步骤合成的cdna为模板扩增中华大蟾蜍溶菌酶功能域编码序列片段。
将克隆片段用dna纯化试剂盒进行纯化，纯化后的dna片段与pet-28空质粒均用ecori和hindiii进行双酶切，反应条件是37℃放置8h。反应结束后将酶切产物再次用dna纯化试剂盒进行纯化，并将纯化后的dna片段和pet-28空质粒的片段用t4dna连接酶进行连接。
连接后的重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，铺板于加入硫酸卡那霉素的lb固体培养基平板，37℃放置12h后，随机挑取单菌斑，用pcr检测有插入片段的阳性克隆菌斑。
将含有重组质粒的bl21(de3)菌液调整浓度为od630＝0.2，并加入终浓度为1mm的iptg，置摇床上28℃、210rpm摇菌及诱导溶菌酶表达8h。
将诱导表达后的菌液8000rpm离心5min，弃上清，沉淀用pbs缓冲液重悬浮，并用反复冻融同时超声裂解的方法裂解细菌细胞，将裂解后的上清液用镍元素亲和柱进行处理以纯化其中含有六聚his融合标签蛋白的融合蛋白。
活性检测
铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌和酵母菌等微生物菌株均购自atcc，四种细菌均用lb培养基培养，两种真菌均用改良马丁培养基培养。
微生物菌液调整浓度为od630至0.1-0.2之间，按照每孔100微升的量加入到96孔酶标板，加入浓度分别为0、0.1、1、10、100μg/ml的多肽，37℃培养24h后用酶标仪测定od630的值。
结果与分析
1溶菌酶成熟肽序列分析
成熟肽编码核苷酸序列为
aagtatgaaaaatgcgaacttgctagggttctgaaaaagggaggacttggcggcttcagaggttacagtctggaaaattggatttgtaccgcatactatgagagtggcttcaacacagccagcacaaactacaatccacctgacaagagcactgattatggcatttttcaaataaatagtcgatggtggtgcaatgataacaagacccccggaagtaaaaatgcttgcaatatcaactgcaaagtactgttaggtggcgatataagtcaagctataaaatgtgcaaagcgtgttgtgagtgatcccaacggcatgggtgcatgggttgcatggagaaatcactgtaagggcaaaaacttatcaaagtggactcaaggatgcaaactt
肽段序列为
mkwqihilgglllllaiasgkkyekcelarvlkkgglggfrgyslenwictayyesgfntastnynppdkstdygifqinsrwwcndnktpgsknacninckvllggdisqaikcakrvvsdpngmgawvawrnhckgknl5kwtqgckl
2溶菌酶重组表达产物对两种革兰氏阳性细菌、两种革兰氏阴性细菌和两种真菌生长的抑制。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。