一种通过无细胞蛋白合成系统制备骨骼肌受体酪氨酸激酶的方法与流程

本发明涉及蛋白制备领域，具体涉及一种通过无细胞蛋白合成系统制备骨骼肌受体酪氨酸激酶的方法。

背景技术：

骨骼肌受体酪氨酸激酶(musk)是存在于哺乳动物体内的一种抗原蛋白，musk是一种与乙酰胆碱受体相关的跨膜蛋白，在骨骼肌的发展中，musk是建立突触后膜时组建主要突触骨架的首要要求，重症肌无力(myastheniagravis，mg)是一种由自身抗体引起的、累及神经肌肉接头(nmj)处的自身免疫性疾病，肌肉特异性激酶抗体(muskab)在重症肌无力中的起病和病情发展中起着很重要的作用。目前关于musk抗体在重症肌无力中的作用仍是国际上研究的热点之一，该研究对musk蛋白有着一定的需求量，但是该蛋白在普通的表达系统中很难表达，由于较强的疏水性，几乎是不表达的。

天然内膜蛋白质存在于生物膜的脂类环境中，但是目前研究内膜蛋白质的技术是首先把它们分散在水溶液的环境中，参照水溶性蛋白质的方法进行操作。为了有效的研究内膜蛋白质，将其溶解于水环境是必要的前提。目前通常是通过加入去污剂使得内膜蛋白质和脂类在水中形成可溶性的复合物来完成的。内膜蛋白质的溶解是一个粗暴的处理过程，在此过程中经常会发生蛋白质变性和/或聚集。为了避免蛋白质的损失和失活，该过程优化时需要非常小心。因此溶解过程是处理膜蛋白质的最关键的步骤。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种通过无细胞蛋白合成系统制备骨骼肌受体酪氨酸激酶的方法，该无细胞蛋白合成表达系统无需制备mrna且表达量高。

本发明通过以下技术方案实现：一种通过无细胞蛋白合成系统制备骨骼肌受体酪氨酸激酶的方法，包括以下步骤：

步骤(1)：musk基因的合成和克隆：

从genebank中查找分泌型表达人肌肉特异性激酶的cdna，取其24-495aa的氨基酸序列,在不改变氨基酸序列的前提下，按照大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后合成基因序列，见序列表，以pcr方法分别引入双酶切位点到该序列两端；

步骤(2)：重组质粒的构建：

将pcr扩增得到的条带胶回收并用内切酶双酶切，载体pet28a用同样的内切酶双酶切，回收目的片段，然后用t4dna连接酶连接载体和目的片段，将其转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，筛选重组子得到重组质粒pet28a-musk；

步骤(3)：制备大肠杆菌s30抽提物：

用s30缓冲液从大肠杆菌中提取s30抽提物；

步骤(4)：标准的半连续无细胞蛋白合成反应：

标准反应混合物包括如下成分：57mmhepes-koh缓冲液(ph8.2)、1.2mmatp、0.85mmgtp、0.85mmutp、0.85mmctp、0.64mmcamp、200mm谷氨酸钾、80mm醋酸铵、15mm醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、6.7μg/mlpet28a-musk质粒、33μg/mlt7rna聚合酶、500μm氨基酸、33mm磷酸烯醇式丙酮酸、占总重量2％的pet8000、和占总重量24％的大肠杆菌s30抽提物；

供应试剂包括如下成分：57mmhepes-koh缓冲液(ph8.2)、0.64mmcamp、200mm谷氨酸钾、80mm醋酸铵、15mm醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、6.7μg/mlpet28a-musk质粒、500μm氨基酸、33mm磷酸烯醇式丙酮酸、占总重量2％的pet8000、和占总重量24％的大肠杆菌s30抽提物；

具体反应步骤如下：将300μl标准反应混合物装于d-tube^tm透析管(截留分子量为3.5kda)中，将4.5ml供应试剂装于50ml离心管中，然后将d-tube^tm透析管放入50ml离心管中，于30℃孵育过夜，离心，分离上清和沉淀，沉淀层即为musk膜蛋白；

步骤(5)：musk膜蛋白沉淀处理：

用1ml质量浓度为0.5％～1.5％的弱去污剂溶液将musk膜蛋白沉淀进行重悬沉淀，加入少量还原剂到终浓度为5mm，并于30℃、转速220r下震荡1h至沉淀全部溶解，离心，取上清，加入分散剂至终浓度为0.2％～2％，50mm氧化型谷胱甘肽gssg至终浓度1～5mm，100mm还原型谷胱甘肽gssh至终浓度2～8mm，离心管放置4℃，静置12h；取出静置后的蛋白，于te缓冲液中透析3天，透析期间te缓冲液更换2次，离心得到上清，即为最终的musk蛋白溶液。

本发明的有益效果为：

(1)采用无细胞表达体系表达骨骼肌受体酪氨酸激酶蛋白，克服了疏水结构表达难的问题，能够制备出一般表达系统制备不出的蛋白产物。

(2)采用无细胞高效表达的蛋白后处理的过程，对无细胞大量表达的蛋白沉淀进行先变性后复性的方法，制备出了免疫活性较好的活性蛋白，克服了普通无细胞表达的低表达量和需要添加脂质体才有活性的问题。

附图说明

图1为实施例1制备的musk蛋白的电泳图；

图2为实施例2制备的musk蛋白的电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。

本发明通过无细胞蛋白合成系统制备骨骼肌受体酪氨酸激酶的方法，包括以下步骤：

步骤(1)：musk基因的合成和克隆：

从genebank中查找分泌型表达人肌肉特异性激酶的cdna，取其24-495aa的氨基酸序列,在不改变氨基酸序列的前提下，按照大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后合成基因序列，见序列表，以pcr方法分别引入双酶切位点到该序列两端；

步骤(2)：重组质粒的构建：

将pcr扩增得到的条带胶回收并用内切酶双酶切，载体pet28a用同样的内切酶双酶切，回收目的片段，然后用t4dna连接酶连接载体和目的片段，将其转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，筛选重组子得到重组质粒pet28a-musk；

步骤(3)：制备大肠杆菌s30抽提物：

用s30缓冲液从大肠杆菌中提取s30抽提物；

s30抽提物能将dna转录为mrna和/或将mrna翻译为多肽，包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能trna，氨基酸和核糖体等。s30抽提物是本领域公知的，并且描述于例如《invitrosynthesisofproteininmicrobialsystems》geoffreyzubay,1973，可按照以下方法获得大肠杆菌抽提物，可选择众多适于大肠杆菌生长的培养基，例如2ytpg培养基，用合适的细胞悬浮缓冲液悬浮大肠杆菌细胞，用高压均质机破碎，离心，去除沉淀，得到大肠杆菌抽提物，所有步骤均在冰上操作，菌株用bl21(de3)；

步骤(4)：标准的半连续无细胞蛋白合成反应：

标准反应混合物包括如下成分：57mmhepes-koh缓冲液(ph8.2)、1.2mmatp、0.85mmgtp、0.85mmutp、0.85mmctp、0.64mmcamp、200mm谷氨酸钾、80mm醋酸铵、15mm醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、6.7μg/mlpet28a-musk质粒、33μg/mlt7rna聚合酶、500μm氨基酸、33mm磷酸烯醇式丙酮酸、占总重量2％的pet8000、和占总重量24％的大肠杆菌s30抽提物；

供应试剂包括如下成分：57mmhepes-koh缓冲液(ph8.2)、0.64mmcamp、200mm谷氨酸钾、80mm醋酸铵、15mm醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、6.7μg/mlpet28a-musk质粒、500μm氨基酸、33mm磷酸烯醇式丙酮酸、占总重量2％的pet8000、和占总重量24％的大肠杆菌s30抽提物；

具体反应步骤如下：将300μl标准反应混合物装于d-tube^tm透析管(截留分子量为3.5kda)中，将4.5ml供应试剂装于50ml离心管中，然后将d-tube^tm透析管放入50ml离心管中，于30℃孵育过夜，离心，分离上清和沉淀，沉淀层即为musk膜蛋白；

步骤(5)：musk膜蛋白沉淀处理：

用1ml质量浓度为0.5％～1.5％的弱去污剂溶液将musk膜蛋白沉淀进行重悬沉淀，加入少量还原剂到终浓度为5mm，并于30℃、转速220r下震荡1h至沉淀全部溶解，离心，取上清，加入分散剂至终浓度为0.2％～2％，50mmgssg至终浓度1～5mm，100mmgssh至终浓度2～8mm，离心管放置4℃，静置12h；取出静置后的蛋白，于te缓冲液中透析3天，透析期间te缓冲液更换2次，离心得到上清，即为最终的musk蛋白溶液。

作为进一步的优选，所述s30缓冲液包括如下成分：

作为进一步的优选，沉淀处理中添加的弱去污剂为skl、tritonx-100、辛烷基葡糖苷、脱氧胆酸盐、sds、ctab、吐温20、np-40等，优选为质量浓度为0.5％的skl溶液。

作为进一步的优选，沉淀处理中添加的50mmgssg至终浓度1mm，100mmgssh至终浓度2mm。

作为进一步的优选，沉淀处理中加入分散剂为peg4000，终浓度为0.2％～2％。

作为进一步的优选，还原剂为dtt、dte-、β-巯基乙醇等，优选为dtt。

本发明使用无细胞蛋白合成系统合成uniprot编号为o15146，氨基酸序列为24-495aa的蛋白片段，见序列表所示。

实施例1

1.musk基因的合成和克隆

从基因文库中获取分泌型表达人肌肉特异性激酶的mrna，取其24-495aa的氨基酸序列按照大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后合成基因序列。序列见序列表1，以合成的dna作为pcr模板，上游引物为5’-gatcggatccctgccgaaagcgccg-3’，下游引物为5’-atgaagcttaatatcacgcacatat-3’，分别引入bamhⅰ和hindⅲ的酶切位点。pcr反应条件:95℃预变性4min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，进行30个循环，72℃延伸6min。

2.重组质粒的构建

pcr扩增得到的1.4kb条带胶回收并用内切酶bamhⅰ和hindⅲ双酶切，载体pet28a同样用bamhⅰ和hindⅲ双酶切，回收大的片段。然后用t4dna连接酶连接载体和目的片段，以其转化大肠杆菌dh5α感受态细胞中。利用lb氨苄青霉素或卡那霉素平板筛选重组转化子，挑取转化子做菌落pcr，对有目的条带的转化子菌落提取重组质粒用内切酶酶切进一步鉴定，并送上海生工生物技术有限公司进行测序，得到重组质粒pet28a-musk。

3.制备大肠杆菌抽提物s30

抽提物指能将dna转录为mrna和/或将mrna翻译为多肽的体外反应混合物的制备物。所述抽提物包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能trna，氨基酸和核糖体等。s30抽提物是本领域公知的，并且描述于例如《invitrosynthesisofproteininmicrobialsystems》geoffreyzubay,1973。可按照以下方法获得大肠杆菌抽提物。可选择众多适于大肠杆菌生长的培养基，例如2ytpg培养基，然后本领域技术人员应该了解，许多培养基可适合本目的。用合适的细胞悬浮缓冲液悬浮大肠杆菌细胞，用高压均质机破碎，离心，去除沉淀，得到大肠杆菌抽提物。所有步骤均在冰上操作。菌株用bl21(de3)。

4.标准的半连续无细胞蛋白合成反应

标准反应混合物包括如下成分：57mmhepes-koh缓冲液(ph8.2)、1.2mmatp、0.85mmgtp、0.85mmutp、0.85mmctp、0.64mmcamp、200mm谷氨酸钾、80mm醋酸铵、15mm醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、6.7μg/mlpet28a-musk质粒、33μg/mlt7rna聚合酶、500μm氨基酸、33mm磷酸烯醇式丙酮酸、占总重量2％的pet8000、和占总重量24％的大肠杆菌s30抽提物；

供应试剂包括如下成分：57mmhepes-koh缓冲液(ph8.2)、0.64mmcamp、200mm谷氨酸钾、80mm醋酸铵、15mm醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、6.7μg/mlpet28a-musk质粒、500μm氨基酸、33mm磷酸烯醇式丙酮酸、占总重量2％的pet8000、和占总重量24％的大肠杆菌s30抽提物；

具体反应步骤如下：半连续的表达体系中，将300μl标准反应混合物装于d-tube^tm透析管(截留分子量为3.5kda)中，将4.5ml供应试剂装于50ml离心管中，然后将d-tube^tm透析管放入50ml离心管中，于30℃孵育过夜，离心，分离上清和沉淀，沉淀层即为musk膜蛋白；

半连续的表达体系要求2个反应环境，中间由一个半透析膜隔开，适宜制备级别的蛋白生产。反应室(reactionroom)包含大分子底物，例如酶和核酸。另一个供应室(feedingroom)包含低分子前体，例如氨基酸、能量生产物质和核苷酸。fm将新鲜的前提物质引入rm，同时有抑制作用的分解产物持续地从rm排入fm。因此，半连续的表达体系产量显著提高，反应时间延长。配制好相应反应液和供应液，加入反应体系中，30℃孵育过夜。离心，分离上清和沉淀，musk为膜蛋白，膜蛋白因为自身的疏水性，表达即沉淀。

5.沉淀处理

沉淀用pbs重悬，离心，去掉上清，重复该步骤2次。用1ml0.5％skl溶液重悬沉淀，加dtt到终浓度为5mm，30℃，220r，震荡1h至沉淀全部溶解。离心，取上清。加入20％peg4000至终浓度为0.2％，50mmgssg至终浓度1mm，100mmgssh至终浓度2mm。离心管放置4℃，静置12h。取出静置后的蛋白，透析于te缓冲液3天。透析期间te缓冲液更换2次。离心，得到上清。即为最终的musk蛋白溶液。图1为实施例1制备的musk蛋白的电泳图，可见60kda处有一明显条带，大小和蛋白的大小基本一致。

实施例2

步骤1～4和实施例1步骤1～4相同，其中步骤5中沉淀处理如下：

沉淀用pbs重悬，离心，去掉上清，重复该步骤2次。用1ml1.5％skl溶液重悬沉淀，加dtt到终浓度为5mm。30℃，220r，震荡1h至沉淀全部溶解。离心，取上清。加入20％peg4000至终浓度为2％，50mmgssg至终浓度5mm，100mmgssh至终浓度8mm。离心管放置4℃，静置12h。取出静置后的蛋白，透析于te缓冲液3天。透析期间te缓冲液更换2次。离心，得到上清。即为最终的musk蛋白溶液。图2为实施例2制备的musk蛋白的电泳图，可见60kda处有一明显条带，大小和蛋白的大小基本一致。

对比例1

无细胞表达蛋白部分和实施例1基本一致，蛋白处理过程按照下述过程来进行。

用8m尿素(8m尿素-1pbs)溶解蛋白，浓度为0.1mg/ml。放入透析袋中，依次用4m尿素复性缓冲液，3m尿素复性缓冲液，2m尿素复性缓冲液，1m尿素复性缓冲液，0.5m尿素复性缓冲液，1xpbs透析，4℃过夜。若中间任何一步有沉淀，立即取出离心12000rpm4℃离心10min，上清跑胶检测；透析好的蛋白进行sds-page电泳，测蛋白浓度后置-20℃保存；复性液配方为：称取0.077g氧化型谷胱甘肽、0.385g还原型谷胱甘肽、0.186gedta·2na、17.42g精氨酸、3.03gtris，加去离子水溶解，加入9.1ml浓盐酸调节ph为ph8.0，定容至250ml。

该方法得到的蛋白在0.5m尿素复性液缓冲中沉淀完全。得不到蛋白溶液。

对比例2

无细胞表达蛋白部分和实施例1基本一致，蛋白处理过程按照下述过程来进行：(1)以2倍体积的3m盐酸胍稀释蛋白溶液，在4℃环境下以注射器逐滴加入到200ml复性液(ph8.0)中，转速调节至最大，搅拌24h，4℃；(2)降低转速，搅拌24h，4℃；(3)取蛋白溶液于透析袋中，以peg20000浓缩体积至0.5-1ml；(4)于4℃下以pbs缓冲液透析过夜；(5)取蛋白进行sds-page检测。

将本发明的实施例1和对比例2获得的musk蛋白进行活性检测，步骤如下：(1)包被蛋白，4℃下过夜；(2)于37℃下封闭2h；(3)加梯度稀释的血清样本及空白孔0.5h；(4)洗板后加二抗0.5h；(5)洗板后显色20min。

表1为本发明的实施例1的musk蛋白的棋盘法得到的elisa检测活性数据，可以看出实施例1得到的蛋白是有充分的活性的，而对比例2得到的蛋白溶液在该实验中没有活性数据。

表1

<110>武汉金开瑞生物工程有限公司

<120>一种通过无细胞蛋白合成系统制备骨骼肌受体酪氨酸激酶的方法

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1416

<212>dna

<213>homosapiens

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