烟粉虱噻虫嗪抗性基因CYP6DZ7及其启动子的制作方法

本发明涉及基因工程领域和植物虫害防治领域，具体涉及烟粉虱噻虫嗪抗性基因及其启动子。

背景技术：

烟粉虱bemisiatabaci（gennadius）是一种危害严重的蔬菜花卉和园艺作物的世界性害虫，具有寄主范围广泛，繁殖率高，传播植物病毒，暴发性强和易于产生抗药性等特点。烟粉虱的危害包括直接取食植物汁液使得植物萎蔫，分泌蜜露形成煤污病从而阻抑光合作用，更为严重的是烟粉虱能够传播多种植物病毒，如烟粉虱能够传播植物双生病毒番茄黄化曲叶病毒（tylcv），造成番茄严重减产甚至绝产。

烟粉虱在漫长的进化过程中形成了30余种不同的隐种，其中b和q型烟粉虱是全世界危害最为严重的两个隐种，b型烟粉虱起源于中亚-亚细亚地区，是一种广泛认可的“世界超级害虫”；二十世纪九十年代在欧洲伊比利亚半岛首次发现q型烟粉虱，具有更强的抗药性和传毒能力，迅速传播到全世界其他地区。

新烟碱类杀虫剂是一种高效，低毒，环境友好以及选择性强的新型杀虫剂，其作用机理是选择性抑制害虫的神经系统重要组成部分烟碱类乙酰胆碱受体（nicotinicacetylcholinereceptors，nachrs），与神经递质乙酰胆碱竞争性地结合nachrs，从而阻断害虫神经传递，造成害虫肌肉细胞出现麻痹而死亡。

由于新烟碱类杀虫剂广泛，长期使用，逐渐造成了害虫抗性的产生。烟粉虱在长期使用吡虫啉，噻虫嗪等新烟碱类杀虫剂，也产生了严重的抗药性。例如美国，西班牙，希腊等国家通过田间检测发现烟粉虱对第一代新烟碱类杀虫剂吡虫啉产生严重的抗药性。2007年，luo等在我国首次检测吡虫啉抗性水平，发现北京和新疆等地理种群对吡虫啉比较敏感，而浙江，江苏，和湖北地区却产生了中高抗性。2009年，wang等等在上海地区发现中等抗性的种群，在江苏地区通过田间检测发现一个极高吡虫啉抗性的烟粉虱种群，抗性倍数高达1840，并且该地区噻虫嗪的抗性倍数也高达1470倍，表明该地区已经产生严重的抗药性，2011年，yang等也通过田间生测，北京南口地区发现烟粉虱噻虫嗪和吡虫啉高抗种群，在纬度更高的地区发现烟粉虱的抗性种群。

昆虫体内存在很多与生理功能和代谢相关的解毒酶，如常见的三大解毒酶系：多功能氧化酶（cytochromep450-dependentmonooxygenases，p450），谷胱甘肽转移酶（glutathiones-transferases，gst）以及羧酸酯酶（carboxleseterases，care）。p450介导的昆虫抗药性十分普遍，杀虫剂进入昆虫体内常常由解毒酶来降解代谢。最早在果蝇中研究发现cyp6g1过量表达与其ddt抗性有关（dabornetal.2002；mccartetal.，2008），冈比亚按蚊对ddt抗性与cyp6z1基因的上调有关（chiuetal.2008），赤拟谷盗对溴氰菊酯抗性是由于脑中过量表达cyp6bq9形成，褐飞虱对新烟碱类杀虫剂吡虫啉抗性与cyp6ay1表达上调有关，棉铃虫对氰戊菊酯抗性是由于cyp337b3融合导致，烟粉虱对吡虫啉抗性也与cyp6家族基因cyp6cm1表达上调有关。

技术实现要素：

本发明人利用转录组技术获得大量p450基因片段序列，并以噻虫嗪抗性和敏感品系为实验材料进行荧光定量pcr进行表达量验证，结果发现抗性品系中p450基因cyp6dz7的表达量显著升高，在此基础上进行了上游启动子序列克隆，并且应用双荧光素酶系统进行分析，发现上游-1143bp内存在启动子序列，国内尚未有关于田间烟碱类杀虫剂抗药性基因cyp4dz7启动子分析相关报道。

本发明提供一种编码烟粉虱噻虫嗪抗性蛋白的抗性基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示；同时，本发明还提供所述的抗性基因编码的烟粉虱噻虫嗪抗性蛋白，其氨基酸序列如seqidno:2所示。

本发明人通过烟粉虱基因组序列查找cyp6dz7上游序列，设计引物，以烟粉虱总的dna为模板pcr克隆相应的片段序列。

本发明还提供所述的抗性基因的表达载体或重组细胞系，将获得的目的片段利用高保真酶transtartfastpfuflydnapolymerasepcr获得含有平末端的序列，然后连接到ecorv单酶切（该酶为平末端酶）回收后的pgl4.10表达载体上，挑选克隆斑后进行菌液pcr验证，测序连接方向正确后应用天根无内毒素质粒提取试剂盒进行质粒提取备用。

本发明所述的抗性基因的启动子，其核苷酸序列如seqidno:3所示。

本发明所述的抗性基因可用于检测烟粉虱对吡虫啉或噻虫嗪的抗性基因，同时也为烟粉虱防治药剂的开发提供了新的理论基础。

新烟碱类杀虫剂广泛使用，特别是针对刺吸式昆虫烟粉虱具有很好的防治效果，但是由于长时间、大面积施用，导致抗药性形成，而及时检测抗药性的形成对于杀虫剂的选择起到至关重要的作用，抗性基因cyp6dz7的发现对于噻虫嗪的抗性检测起到重要作用。对于该基因上游的启动子区域研究将有助于深入了解抗性机制形成过程，并且对于新的杀虫剂开发具有理论意义。

附图说明

图1pgl4.10载体图谱。

图2pgl4.73载体图谱。

图3cyp6dz7基因结构图。

图4cyp6dz7基因上游区域启动子活性分析。

具体实施方式

供试昆虫

q型烟粉虱噻虫嗪抗性种群（thiamethoxam-resistantb.tabaciqstrain，thqr）于2011年8月从浙江杭州番茄田中采集，饲养在中国农业科学院蔬菜花卉所日光温室，维持饲养在辣椒（中椒#4；capsicumannuuml.）上至今，期间一直用噻虫嗪进行正向汰选以保存抗性。

q型烟粉虱噻虫嗪田间敏感种群（thiamethoxam-susceptibleb.tabaciqstrain，thqs），田间噻虫嗪抗性种群thqr在室内进行反向汰选得到的相对敏感种群，在室内温室用辣椒（中椒#4；capsicumannuuml.）饲养至今，未施用任何杀虫剂。

供试试剂

rna提取试剂trizol：购自lifetechnologiescorporation公司

race试剂盒smart^tmracecdnaamplificationkit：购自clontech公司

cdna反转录试剂盒primescript®rtreagentkit（realtime）：购自日本takara公司

荧光定量pcr试剂盒superrealpremixplus（sybrgreen）：购自北京天根生化科技有限公司

dsrna合成试剂盒t7ribomaxexpressrnaisystem：购自promega公司

dna分子量标准，蛋白酶k，x-gal和iptg：购自北京天根生化科技有限公司；

苄青霉素；酵母提取物和胰蛋白胨：购自美国amresco有限公司；

pcr引物，goldview和琼脂糖：合成和购自北京擎科新业生物技术有限公司；

琼脂糖凝胶电泳缓冲液tbe配置：

浓度高的贮存液5×tbe：trisbase54.0g，硼酸27.5g，0.5m乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，edta）20ml，用ph计精细调节ph为8.0，加ddh2o定容到1000ml；工作液为5×tbe储存液稀释10倍以后的0.5×tbe；

pcrestaq带有6×loadingbuffer的混合液：购自北京康为世纪生物科技有限公司；

top10感受态细胞；pcr产物纯化试剂盒，peasy-t1载体：购自全式金北京公司；

lb培养基配置：

胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g，加入干净的蒸馏水950ml，用1.0mol/lnaoh调ph至7.0，定容到1l，115℃高压湿热灭菌20分钟，待用；

其它实验室常用化学试剂（分析纯）均为市售。

主要仪器

荧光定量pcr仪：美国abi7500；

pcr仪器：bio-rads1000和bio-radc1000；

电泳槽和水浴锅：北京六一仪器厂；

高速离心机：德国sigma3k15；

核酸电泳系统和凝胶成像系统（geldoceq）：美国bio-rad公司；

超纯水仪：zmq55votiminiq纯水仪；

分子实验用移液器：德国eppendorf公司；

超净工作台：苏州净化科技有限公司。

湿热高压灭菌锅：日本sanyo公司；

台式冷冻振荡器（thz-c-1）：太仓市实验设备厂。

基因组dna，rna提取及cdna合成

烟粉虱基因组dna提取采用takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkitver.5.0试剂盒，步骤参考操作说明，获得的dna-20℃保存。

采用triol方法提取烟粉虱总rna，具体步骤如下：取生活状态良好的烟粉虱成虫50头，尽量龄期一致，雌雄比例接近1:1。取完烟粉虱后立即放入液氮中冷冻，防止rna降解。将烟粉虱样品在超净台中放入1ml的180℃灭菌6h的匀浆器中，向其中加入1ml的trizol进行充分匀浆，然后小心转移至1.5ml的rna专用离心管中，室温静置5分钟。加入200μl氯仿，漩涡振荡器剧烈振荡30s，室温静置5分钟，低温离心，4℃12000rpm离心15分钟。离心完毕后小心拿出离心管，轻轻吸取400μl的上清液，不要触碰中间的蛋白质层，转移上清液到另一个干净的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上冷却10分钟后沉淀rna，然后4℃12000rpm离心10分钟，小心吸出上清液，加入1ml70%的无水乙醇进行漂洗，4℃8000rpm离心5分钟。小心吸取乙醇，超净台中吹干5分钟，加入适量预冷的depc水进行溶解，测定od260/od280的比值和含量，并且进行变性胶电泳检测rna质量。

采用takara公司的试剂盒primescript®rtreagentkit进行cdna合成。

1)基因组dna除去

向rna专用的pcr管中，小心加入5×gdnaeraserbuffer2.0µl；gdnaeraser1.0µl；totalrna1.0μg（依据提取rna浓度换算需要加的体积）；rnasefreeddh2o补充到10μl，迅速放入pcr仪中42℃，2分钟。

2)cdna合成

向已经除去dna的pcr管中加入5×primescriptbuffer24.0µl；primescriptrtenzymemix1.0µl；rtprimemix1.0µl；rnasefreeddh2o4.0μl，然后迅速放入pcr仪中，37℃，15分钟进行rna反转录，85℃5秒种使得反转录酶失活，然后-20℃保存备用（-80℃可长期保存）。

cyp6dz7基因克隆

应用smart^tmracecdnaamplificationkit进行cyp6dz7基因全长克隆。首先提取高质量的烟粉虱rna，然后利用race试剂盒在烟粉虱总mrna两端加接头，制备5’/3’-race-readycdna，保存在-80℃。

依据基因组和转录组序列，按照race试剂盒要求设计相应的引物（见表1,2），然后和接头引物ump进行pcr，pcr产物琼脂糖凝胶检测，首先挑选比较长的较亮的条带，利用全式金胶回收试剂盒进行回收后连接转化，菌落pcr验证得到阳性克隆斑后测序，分析测序结果。

表1cyp6dz7基因race引物

表2race反应体系以及反应程序

cyp6dz7上游区域克隆

通过烟粉虱基因组序列查找cyp6dz7上游序列，设计引物，以烟粉虱总的dna为模板pcr克隆相应的片段序列，引物见表3。克隆序列连接转化测序后与目的基因一致，表明克隆得到目的基因的上游序列。

获得目的片段后利用高保真酶transtartfastpfuflydnapolymerasepcr获得含有平末端的序列，然后连接到ecorv单酶切（该酶为平末端酶）回收后的pgl4.10表达载体上（图1），挑选克隆斑后进行菌液pcr验证，测序连接方向正确后应用天根无内毒素质粒提取试剂盒进行质粒提取备用。

表3cyp6dz7上游序列引物

果蝇s2细胞饲养与转染

果蝇s2细胞株惠赠于中国科学院动物研究所陈大华实验室，细胞来源与果蝇胚胎晚期的类巨噬细胞。s2细胞培养于直径15cm的大培养皿中，使用hyclonesfx培养基，放置于无co2的恒温培养箱中，培养温度为27℃。

s2细胞转染采用脂质体lipofectamine2000（1ug/ul）进行转染，转染前取生长状态良好的细胞，稀释后密度达到1.5~2.0×10⁶个，吸取适量到待转染的细胞培养板中，摇晃混匀后静置培养24h，移除培养基，加入无血清培养基，室温静置1h，在此期间配制转染液：

转染液a：200μl的无血清培养基加入适量质粒，轻轻混匀；

转染液b：200μl的无血清培养基加入适量lipofectamine2000，轻摇混匀，室温放置5min；

混合转染液a和转染液b，轻轻摇匀，室温放置20min，将混合液逐滴加入到细胞培养板中，置于培养箱中培养，6h以后更换新鲜培养基，24~48h后裂解细胞进行检测。

双荧光素酶实验

应用promega-dual-luciferase®reporterassaysystem双荧光素酶系统来检测目的基因启动基因表达情况，为了消除细胞间，转染过程中等形成的差异，采用双报告基因，分别为pgl4.10和pgl4.73（见图2），前者发出的萤火虫荧光用于检测启动子活性，其中后者含有海肾基因，产生荧光主要用于矫正背景差异。

转染细胞24~48h进行双荧光素酶检测：

配置10×pbs缓冲液（2gkh2po4，11.5gna2hpo4，2gkcl，80gnacl）母液，在使用时稀释10倍成工作浓度。

按照promega-dual-luciferase®reporterassaysystem试剂盒说明书，配制1×passivelysisbufferplb的裂解液：吸取适量的5×plb进入干净的离心管中，加入4倍体积的ddh2o，轻摇混合均匀，裂解液现用现配；

同时配制1×stop&glo®substrate工作液：将一定量50×stop&glo®substrate加入到stop&glo®buffer，使其成为1倍的工作浓度，这两种试剂应该室温充分融化后使用；

从培养箱中拿出待转染的细胞培养板，轻轻移除细胞，用1×pbs轻轻洗涤细胞，废弃清洗液；

向培养板中加入一定量的1×plb，放置于摇床上100rpm缓慢摇动15min，进行细胞裂解；

吸取20μl的细胞裂解液进入modulusii微孔板型多功能检测仪荧光检测专用的96孔板中，进行荧光素酶检测。

结果分析

cyp6dz7基因克隆

在抗噻虫嗪的敏感与抗性品系中，通过race技术，最终克隆得到1524bp长度的cyp6dz7基因全长序列（seqidno:1），编码508个氨基酸（seqidno:2），该基因n端含有一个跨膜结构，具有典型的p450保守结构区域，如wxxxr结构域，oxygen-binding结构域（agxxxt），heme-binding结构域（pfxxgxxxcxg）。将序列通过与20种昆虫的p450基因进行核酸比对，发现该基因属于cyp6家族的基因（见图3）。经过命名专家委员会命名为cyp6dz7基因。

cyp6dz7上游序列克隆

通过基因组序列克隆cyp6dz7上游区域，获得长度为1200bp，由于基因启动区域常常在基因上游100bp左右，所以本实验最长选取其中1200bp，克隆连接转化连接进入pgl4.10表达载体上，进行双荧光素酶实验。

启动子区域双荧光素酶分析

应用双荧光素酶系统对cyp6dz7上游区域进行分析，通过比较含有目的基因上游区域的pgl4.10载体和不含有目的基因上游区域pgl4.10空载体上的荧光素基因发出的荧光值来判断是否存在启动子区域。

通过双荧光素酶实验表明含有cyp6dz7基因上游-1075到-1143区域比pgl4.10空载体荧光值显著升高，表明该区域存在能够增强该基因表达的启动子序列（如图4）。

通过克隆与烟粉虱新烟碱类药剂相关的p450基因cyp6dz7基因上游序列，然后应用双荧光素酶报告基因系统检测该基因上游的启动子区域，结果发现cyp6dz7基因上游区域存在启动子序列，如序列表seqidno:3所示。

序列表

<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>烟粉虱噻虫嗪抗性基因cyp6dz7及其启动子

<160>3

<210>1

<211>1524

<212>dna

<213>cy6dz7基因

<400>1

atggctgcgtttaccatactgagcacactcccttccgtgacgagtgtggtcctgatagtttccagtgtagctctttgtgccgcatattacctccataaaaagtactcatactgggcgaaacgaggtgtgccttacgtgaagccggactcctggtttttcggaaacaccaaggaaatgatcttccagcgggagagcacaacttttatgtttgcgaggctttacaacgagcttgcaggtcataaattcggcggttactaccggaatcataagccttttctcgtgctccgagatccagaactgataagattgatcttcgtgaagaacttctcgcatttccacgaccggaacacgcctgacgaaagggatttcgatcctttgtccaagcatctcctcaacttaagaggacagagatggaagaatgtgcgttacaagctgaccccgaccttcagctcaggcaagctgaagggaatgcacgaactgatgcaggcctgcatcgtggagctggacgactacctcaccaaggccacaagtggtgactccaaggattcgaacgttcaggacttgagggaactcatggccaagttcacgactgacgtcatcggtgcttgcgctttcggcctcaactgcaactccatccgagacgagaactcggagtttcggcgcatcgggagactcatcttctccttctcgtggcgaagttatatccgcgccatcgtcttgactctcgcccccgggatagtaatggctaccaaatggaaaaatgcccgccctgagattgagaatttcttcatgtcagttctgaagggcgctgttgaacacagaaaatcccataccgaacaaaagagaaacgactttttgcaacttttaatcaatatccaagcagaggagcgaaaacagttggagagcaatggccaacacaatggaacccaaaatggcacccaaaatggcacccaaaatggaattcaaaatggacttcaaaatggacatgctgagagtgtatcagaaaaatccaaagatattctgttcgatgactcagtagtcgcttcaaatgcgttcattttcttcatcgctggtttcgagacgaccgcctcgacgctcagctactgtttgtacgagctggctcttaatccggatatcggtgaaaaattgtacgaagaggtagaatccgtgaagcaagcccacaacggcactctagactacgacgctgtgaataaggagcttgtttacatggaggcagttatatcagagacgctgagaaagtacccaccagcatctgttctgggaagacgttgcaatgaggcgttccaaattccggatacgaatgttgtgatcgaggaaggcgttggtgtcaccgtttctgtctacggtctccatcatgacccgcaatattttccggagccggaaaaattcaaaccggagaggtttcttggggaaaataaggacaaaattgtgcccggatcgtatctgcctttcggcgatggacccaggatatgcatcgggatgcgatttgctcattacgaatga

<210>2

<211>508

<212>氨基酸

<400>2

maaftilstlpsvtsvvlivssvalcaayylhkkysywakrgvpyvkpdswffgntkemifqresttfmfarlynelaghkfggyyrnhkpflvlrdpelirlifvknfshfhdrntpderdfdplskhllnlrgqrwknvrykltptfssgklkgmhelmqacivelddyltkatsgdskdsnvqdlrelmakfttdvigacafglncnsirdensefrrigrlifsfswrsyiraivltlapgivmatkwknarpeienffmsvlkgavehrkshteqkrndflqlliniqaeerkqlesngqhngtqngtqngtqngiqnglqnghaesvsekskdilfddsvvasnafiffiagfettastlsyclyelalnpdigeklyeevesvkqahngtldydavnkelvymeavisetlrkyppasvlgrrcneafqipdtnvvieegvgvtvsvyglhhdpqyfpepekfkperflgenkdkivpgsylpfgdgpricigmrfahyem

<210>3

<211>105

<212>dna

<213>上游启动子序列

<400>3

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