中华大蟾蜍抗菌肽bg-cath6(5-29)及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29)及其编码基因和应用，所述抗菌肽具有选自序列表SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，中华大蟾蜍的抗菌肽BG-CATH6(5-29)具有显著的抗肿瘤作用，且具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的优点。它们可以应用于抗微生物感染和抗肿瘤的药物的制备，用于人和动物的治疗。
【专利说明】中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29)及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域，具体涉及中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29)及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002]中华大蟾蜍为无尾两栖类蟾蜍属动物，广泛分布于我国大部分地区，是传统中药蟾酥和蟾皮的主要基源动物，有具有解毒散结、消积利水、杀虫消疳的功效。从中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮提取精制而成的水溶性制剂-华蟾素，目前广泛应用于多种中晚期肿瘤，如原发性肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌等。
[0003]抗菌肽(Cathelicidin)是主要在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽，因在表达的信号肽与成熟肽间含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族,成熟抗菌肽位于前体分子的C-末端，具有很高的变异性。Cathelicidin和防御素一样，也是宿主免疫防御系统的重要组成部分，具有广谱的抗微生物活性、抗肿瘤、结合内毒素、免疫调节、参与伤口的愈合和血管的发生等多种功能。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供了一种中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6 (5-29)及其编码基因和应用。爬行动物中华大蟾蜍的抗菌肽BG-CATH6(5-29)具有显著的抑制肿瘤细胞的作用，且具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。可以应用于抗肿瘤细胞制剂的制备，用于人和动物的治疗。
[0005]为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案:
[0006]中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6 (5-29)，其具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。
[0007]所述抗菌肽BG-CATH6 (5-29)含有一对二硫键，由Cys9与Cys 15形成。
[0008]含有所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29))的蛋白前体，其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0009]所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29)的蛋白前体的编码基因，其具有SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。
[0010]使用T7启动子序列和SP6启动子序列筛选获得所述编码基因，
[0011 ]所述 T7 启动子序列为 5 ’ -TAATACGACTCTATAGGGA-3 ’ ；
[0012]所述SP6 启动子序列 5，-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3，。
[0013]本发明提供了所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5_29)在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。
[0014]所述抗菌肽BG-CATH6 (5-29)在6.25ug/ml时，对肝癌肿瘤细胞的抑制效果显著。
[0015]所述抗菌肽BG-CATH6 (5-29)在100 μ g/ml时，对乳腺癌细胞的抑制效果显著。
[0016]所述抗菌肽BG-CATH6 (5-29)在50 μ g/ml时，对脑神经瘤细胞的抑制效果显著。
[0017]与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是:本发明在中华大蟾蜍毒液腺cDNA文库中获得了 catheIicidin抗菌肽BG-CATH6 (5-29)。其信号肽及cathelin肽段与其它cathelicidin家族的成员高度保守，而其成熟肽高度变异。中华大蟾蜍cathelicidin抗菌肽显示了广谱的抑制肿瘤细胞活性。将本发明的中华大蟾蜍的cathelicidin抗菌肽BG-CATH6(5-29)全序列氨基酸序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同cathelicidin家族成熟肽。
[0018]因此，爬行动物来源的中华大蟾蜍cathelicidin家族抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，且应用范围广泛。该抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。可以应用于抗微生物感染和抗肿瘤的药物的制备，用于人和动物的治疗。具有良好的市场应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明中华大蟾蜍cathelicidin家族抗菌肽BG-CATH6 (5-29)的cDNA及其蛋白质序列，其中斜体加框序列为推导的中华大蟾蜍cathelicidin家族抗菌肽BG-CATH6 (5-29)的成熟序列。
[0020]图2表明本发明抗菌肽BG-CATH6 (5-29)对肝癌细胞H印G2作用。
[0021]图3表明本发明抗菌肽BG-CATH6 (5-29)对乳腺癌细胞MCF-7作用。
[0022]图4表明本发明抗菌肽BG-CATH6 (5-29)对脑神经瘤细胞Neuro_2a作用。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
[0024]实施例1、中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6 (5-29)的基因克隆
[0025]1、总RNA的提取
[0026]中华大蟾蜍放于玻璃烧杯中，加入几滴乙醚，收集毒液腺分泌物，立即放入液氮中。称重后取20mg分泌物于液氮中研磨至粉末状。加入IOml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBC0/BRL产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。然后加入等体积的酚/氯仿溶液，剧烈混匀。室温放置10分钟后，4°C，12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清液加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟。4°C，12000rpm离心10分钟，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为总RNA。
[0027]2、mRNA 的分离
[0028]采用美国Promega公司的mRNA分离纯化试剂盒。取中华大蟾蜍毒腺总RNA500 g溶于500 I经DEPC处理然后高压灭菌的水中，放入65°C水浴10分钟。加入3 I的Oligo(dT)探针和13 120 X SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。磁珠(SA-PMP)的洗涤:将磁珠(随mRNA分离纯化试剂盒)轻轻混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5 X SSC0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5 X SSC悬浮，称为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1 X SSC洗涤4次。然后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮,至磁力架吸附30秒，将上清移至新的试管中，加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至上述试管，则上清中为纯化的mRNA。加入1/10体积的3M乙酸钠，pH5.2，等体积异戊醇，于-70°C放置30分钟，然后于4°C，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶于10 μ I DEPC水中。[0029]3、cDNA文库构建
[0030]采用美国GIBC0/BRL公司SuperScriptTM质粒cDNA文库构建试剂盒。
[0031]3.1、cDNA第一链合成(mRNA反转录):于1.5ml试管中加入2.0μ I NotI引物和7μ I mRNA, 3 μ I DEPC水，70°C保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4 μ 15 X第一链合成缓冲液，2 μ 10.1M DTT, I μ IlOmM dNTP混合物，再加入I μ I SuperScript II反转录酶，于42°C保温I小时后放入冰浴。
[0032]3.2、cDNA第二链合成:在第一链合成试管中加入:95μ I DEPC水，30 μ 15 X第二链合成缓冲液，3 μ IlOmM dNTP混合物，I μ I大肠杆菌DNA连接酶，4 μ I大肠杆菌DNA多聚酶I，I μ I大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μ 1，混匀后于16°C保温2小时；加入2μ I T4DNA多聚酶继续保温5分钟。
[0033]3.3、DNA的抽提和乙醇沉淀:加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取140 μ I上层溶液转移到干净的试管中，加入70 μ 17.5Μ乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干。
[0034]3.4,Sal I adapter 的连接:上述沉淀溶于 25 μ I DEPC水中，加入 10 μ 15 X T4DNA连接酶缓冲液，10 μ I Sail adapter, 5 μ I T4DNA连接酶，反应总体积50 μ 1，于16°C保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41 μ I DEPC水中。
[0035]3.5、Not I酶水解:于cDNA溶液中加入5 μ I React3缓冲液，4 μ I NotI酶，反应体积50 μ 1，于37°C保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100 μ ITEN缓冲液中。
[0036]3.6、DNA分级分离:将cDNA样品过柱(试剂盒中含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA，cDNA大于300bp的组分合并，体积为200 μ 1，加入5 μ I酵母tRNA，100 μ 17.5Μ乙醇胺，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20 μ I TEN缓冲液中。
[0037]3.7、合成的cDNA连接到pSPORTl质粒:取10 μ I溶解于TEN缓冲液中的cDNA，加入4μ 15XT4DNA连接酶缓冲液，1μ I pSPORTl质粒(Not 1-Sal I酶水解，50ng)，4μ I DEPC水，I μ I T4DNA连接酶，反应体积20 μ 1，室温3小时。
[0038]3.8、大肠杆菌HBlOl感受态细胞的制备:挑取单个HBlOl菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50ml LB培养液中，37°C振荡2小时，待菌液在540nm的OD值为0.4时，4°C，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl2重悬，再以2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl2重悬，分装后置冰浴内备用。
[0039]3.9、连接产物的转化:取上述连接产物5 μ I加入100 μ I感受态细胞，冰浴60分钟，42°C热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.9ml，37°C振荡培养I小时，取200 μ I涂布于含氨苄青霉素的LB平皿上(15cm直径)。37°C培养16小时，每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加10%的甘油于液氮保存的所构建中华大蟾蜍皮肤毒液腺cDNA文库大约含1.8 X IO5个克隆。
[0040]4、中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5_29)的基因克隆。
[0041]采用cDNA文库构建质粒pSPORTl的通用引物T7启动子序列(5，-TAATACGACTCTATAGGGA-3’)(SEQ ID No:4)以及 SP6 启动子序列(5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3，)(SEQ ID No:5)鉴定每个克隆的插入片段大小。通过对2000多个插入片段MOObp的克隆的测序，结合核酸及蛋白质的序列比较，得到了一个中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6 (5-29)编码基因，其cDNA由642个核苷酸组成，自5’端至3 ‘端序列为(SEQ ID NO:1):
[0042]
【权利要求】
1.中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29)，其具有SEQID NO: 3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29)，其特征在于所述抗菌肽BG-CATH6 (5-29)含有一对二硫键，由Cys9与Cysl5形成。
3.含有权利要求1所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29))的蛋白前体，其具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29)的蛋白前体的编码基因，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29)的蛋白前体的编码基因，其特征在于:使用T7启动子序列和SP6启动子序列筛选获得所述编码基因， 所述 17 启动子序列为 5’ -TAATACGACTCTATAGGGA-3’ ； 所述 SP6 启动子序列 5’ -CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’。
6.权利要求1所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29)在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29)在制备用于抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于:所述抗菌肽BG-CATH6 (5-29)在6.25 ug/ml时，对肝癌肿瘤细胞的抑制效果显著。
8.根据 权利要求6所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29)在制备用于抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于:所述抗菌肽BG-CATH6(5-29)在IOOy g/ml时，对乳腺癌细胞的抑制效果显著。
9.根据权利要求6所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(5-29)在制备用于抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于:所述抗菌肽BG-CATH6(5-29)在50 μ g/ml时，对脑神经瘤细胞的抑制效果显著。
【文档编号】C12N15/12GK103755797SQ201410034879
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】孙同毅, 李文辉 申请人:潍坊医学院