血清microRNA分子标志物及其应用的制作方法

专利名称：血清microRNA分子标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术与医学领域，涉及一种血清HIiCT0RNA分子标志物及其应用，尤其涉及一种血清microRNA分子标志物及作为白癜风检测方面的应用。
背景技术：
白癜风是一种常见的获得性色素脱失性疾病，临床表现为皮肤粘膜白斑，病理表现为表皮、粘膜或其他组织内黑素细胞的减少或消失。该病发无定处，但好发于颜面等暴露部位，所及之处皮肤色素完全脱失而成瓷白色，严重影响形象美观，甚至毁损患者容貌，给患者带来巨大精神痛苦，青少年多发易感，其造成的“毁容”后果，给患者带来严重的心理问题。黑素细胞破坏的机制迄今尚未完全阐明，以往关于白癜风的发病机制的研究主要有以下几种学说自身免疫学说、黑素细胞自毁学说、氧化应激学说、神经化学因子学说及遗传学说等。然而，以上任何单一的机制均不能完全解释白癜风的发病机理。随着研究和认识 的深入，越来越多的学者认为，黑素细胞受损的启动及其进程是多种遗传学和表遗传学改变积累所致细胞调节和生长失控的多阶段复杂过程，是环境因素和遗传因素共同作用的结果，由于本病的治疗相对困难，疗程长、收效慢、治愈率低，目前尚没有满意的治疗方法。因此，预防和探索个体化的治疗方案是白癜风疾病控制未来的主要方向，与个体罹患白癜风的易感性、治疗反应及与疾病进程和预后相关的分子标志物的研究也日渐成为热点。microRNA (miRNA)是真核生物中一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，在病毒、植物和动物中广泛存在且进化保守，通过mRNA降解和转录后翻译抑制两种沉默机制参与基因表达调控。生理状态下，miRNA表达谱和表达水平具有很强的组织特异性和时相性，机体在病理状态下，miRNA表达谱和表达水平的变化，破坏了 miRNA对其靶基因原有的调控强度，这可能是miRNA参与疾病发生的关键。既往的研究发现miRNA和皮肤肿瘤、炎症性皮肤病疾病、皮肤自身免疫性疾病、皮肤创伤愈合等发病有关，但目前关于miRNA在白癜风发病中的机制研究仍处于起步阶段。常规研究多通过检测病变组织miRNA表达谱与正常组织差异探究发病机制，其检测技术复杂、创伤大，难以真正应用于临床诊断，需找简便、快捷的miRNA研究方法，对于大规模、快速筛查白癜风发病相关miRNA显得十分重要。最近研究发现血清/血浆中存在着大量循环的miRNA，不同的疾病状态miRNA表达谱也不同，而在正常人群中血浆miRNA则很稳定，提示血清/血浆miRNA可作为新的疾病标志物，成为疾病发生机制研究的一个新的切入点，有望应用于疾病的患病风险评估、诊断及治疗。

发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种血清microRNA分子标志物及其应用。本发明的技术解决方案是本发明提供了一种血清microRNA分子标志物，其特殊之处在于所述血清microRNA分子标志物是hsa-let_7b, miR-15b, miR-16, miR-25,miR-451中任意一个；
其中hsa-let-7b 的序列是UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU ；miR-15b 的序列是UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA ；miR-16 的序列是UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG ；miR-25 的序列是CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA ；miR-451 的序列是AAACCGUUACCAUUACUGAGUU。
任何一个血清microRNA分子标志物作为检测白癜风时的应用。任何一个血清mi cr0RNA分子标志物作为制备具有白癜风检测能力试剂盒的应用。一种具有白癜风检测能力试剂盒，其特殊之处在于所述具有白癜风检测能力试剂盒包括反转录系统、扩增系统以及引物系统；所述反转录系统由E. coli Poly (A) Polymerase (Poly A 加尾酶)、10XPoly(A) Polymerase Buffer (IOXPoly A 加尾反应缓冲溶液)、5XrATP solution (5XATP 溶液)、10 X RT primer (10 X反转录引物)、10 X RT Buffer (10 X反转录缓冲液)、超纯dNTPMixture、RNasin (RNA 酶)、Quant RTase (反转录酶)、RNase_freeddH20 组成；所述扩增系统由2XmiRcute miRNA premix、reverse primer (反向引物)组成；所述引物系统由hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451 中的任意一个的扩增引物组成其中hsa-let-7b 的正向引物是5’ -CCTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT-3’miR-15b 的正向引物是5’ -TAGCAGCACATCATGGTTTACA-3’miR-16 的正向引物是5’ -TAGCAGCACGTAAATAITGGCG-3’miR-25 的正向引物是5’ -GCAITGCACTTGTCTCGGTCTG-3，miR-451 的正向引物是5’ -CGAAACCGTTACCATTACTGAGTT-3’。本发明的优点是本发明所提供的血清microRNA分子标志物及其应用，该分子标志物包括hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451中任意一个，这些分子标志物都能够用于检测白癜风，本发明所提供的血清microRNA分子标志物及其应用中，由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续体外检测的优点，因此从血清中寻找生物标志物可以将白癜风的早期筛查和诊断提高至一个新的水平；同时，通过实时荧光定量PCR技术对白癜风临床样本的血清水平miRNA的检测，定量准确，相对于芯片技术或者分子杂交技术，改方法简单快速且经济实用；第三，该疾病标志物可与其他分子指标相结合，为白癜风筛查，诊断，治疗与预后提供新的综合性试剂盒，方便临床应用。


图Ia 是 hsa-let-7b，miR_15b，miR-16, miR-25, miR-451 在白癜风黑素细胞系PIG3V总RNA中的特异性表达电泳图；图Ib 是 hsa-let_7b,miR-15b,miR-16,miR-25,miR-451 在白癒风白斑组织总 RNA中的特异性表达电泳图 Ic 是 hsa-let-7b，miR_15b，miR-16, miR-25, miR-451 在血清总 RNA 中的特异性表达电泳图；图2是本发明所提供的血清microRNA表达水平的5 CT值分布图；图3是血清中miRNA的Pearson相关性分析；图4a是本发明所提供的hsa-let_7b miRNA白癜风血清样本和正常血清样本经RT-qPCR分析图；图4b是本发明所提供的miR_15b miRNA白癜风血清样本和正常血清样本经RT-qPCR分析图；
图4c是本发明所提供的miR-16miRNA白癜风血清样本和正常血清样本经RT-qPCR分析图；图4d是本发明所提供的miR_25miRNA白癜风血清样本和正常血清样本经RT-qPCR分析图；图4e是本发明所提供的miR_451miRNA白癜风血清样本和正常血清样本经RT-qPCR分析图。
具体实施例方式本发明目的在于提出hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451 中任意一个能作为白癜风的发生风险的分子标志物应用于医药领域，从而提供一种性价比高、易于推广应用的白癜风外周血诊断方法；hsa-let-7b ；UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (MIMAT0000063)miR-15b ；UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA (MIMAT0000417)miR-16 ；UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG (MIMAT0000069)miR-25 ;CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA (MIMAT0000081)miR-451 ；AAACCGUUACCAUUACUGAGUU (MIMAT0001631)本发明还同时提供了上述任何一个血清microRNA分子标志物作为检测白癜风时的应用，尤其是任何一个血清microRNA分子标志物作为制备具有白癜风检测能力试剂盒的应用。本发明还同时提供了一种具有白癜风检测能力的试剂盒，该试剂盒由反转录系统，扩增系统和引物系统组成；所述反转录系统由E. coli Poly (A) Polymerase>10XPoly (A) PolymeraseBuffer>5XrATP solution、10XRT primer、10XRT Buffer、超纯 dNTP Mixture、RNasin、Quant RTase、RNase-free ddH20 组成；所述扩增系统由2 XmiRcute miRNA premix、reverse primer 组成；引物系统由hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451 中的任意一个的扩增引物组成hsa-let-7b 的引物是CCTGAGGTAGTAGGITGTGTGGITmiR-15b 的引物是TAGCAGCACATCATGGITTACAmiR-16 的引物是TAGCAGCACGTAAATAITGGCGmiR-25 的引物是GCAITGCACTTGTCTCGGTCTG
miR-451 的引物是CGAAACCGTTACCATTACTGAGIT。在本发明中，具有白癜风检测能力的试剂盒的使用步骤如下；I)获取来源于被检测个体的血液样本；2)利用特异性的检测技术检测样本中生物标志物的表达；3)判定被检测个体是否是患有白癜风上述步骤2)中的生物标志物的检测是对分离的血清或血浆中纯化的RNA样本进行检测。特异性检测技术为实时定量PCR技术。本发明通过实验方法发现了 5条miRNA可作为白癜风早期筛查与临床诊断的血清 学生物标志物；具体如下UmiRNA在血清中的特异性表达如图I所示，进过RT-PCR定性检测及PCR产物序列测定和分析表明，在白癜风黑素细胞系PIG3V总RNA (图la)，白癜风白斑组织总RNA (图lb)，血清总RNA (图Ic)中均检测到目标 miRNA 的特异性表达，说明 hsa-let_7b,miR-15b,miR-16,miR-25 和 miR-451 等 5种RNA在白癜风黑素细胞系，白癜风白斑组织及血清中均存在，为后续实验提供基础。2、miRNA在血清中的个体差异性分析如图2 所示，hsa-let-7b, miR_15b，miR-16, miR-25 和 miR-451 共 5 条 miRNA 表达水平的S CT值分布较集中。各miRNA表达水平经pearson相关性分析得到R值接近1，P〈0. 05。该结果说明Pearson相关性分析结果可靠,且miRNA的表达在个体间相关性好,个体差异性很小。(图3)3、临床白癜风血清样本的检测分析如图4所示，经临床白癜风血清样本和正常血清样本各80例的RT-qPCR分析作图可得，hsa-let-7b (图 4a), miR_15b (图 4b), miR-16 (图 4c), miR-25 (图 4d)和 miR-451(图4e)5条miRNA白癜风血清样本中检测所得的S Ct显著低于正常血清样本的S Ct值，从而推得该5条miRNA在白癜风血清样本中的表达显著高于正常血清样本。也即该5条miRNA可特异性检测白癜风，是白癜风发生标志物。且当检测样本中hsa-let-7b 8 Ct ^ 8. 46 ；miR-15b 8 Ct ^ 8. 42 ；miR-16 8 Ct ^ 5. 80 ；miR-25 8 Ct ^ 4. 50 ；miR-451 8 Ct ^ 2. 60 时，提示是白癜风患者。为使本发明的目的，技术方案和有点更加清楚，下面通过实施例对本发明进行更加详细的说明。实施例I :生物标志物及检测引物本发明提供了一组miRNA 生物标志物，包含 hsa-let-7b,miR-15b,miR-16,miR-25和miR-451。该组生物标志物的具体序列如下hsa-let-7b UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEQ ID NO 1)miR-15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA (SEQ ID NO :2)miR-16 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG (SEQ ID NO :3)miR-25 :CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA (SEQ ID NO :4)miR-451 AAACCGUUACCAUUACUGAGUU (SEQ ID NO :5)Poly (A)加尾法miRNA经过Poly (A)加尾反应后,利用通用引物反转录成cDNA。在PCR扩增过程中，需要针对miRNA的具体序列设计特异性PCR引物，用SYBR-green显色实时定量地检测目标miRNA的扩增情况。特异性PCR引物具体信息如下hsa-let-7b CCTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT (SEQ ID NO :6)miR-15b TAGCAGCACATCATGGTTTACA (SEQ ID NO :7)miR-16 TAGCAGCACGTAAATATTGGCG (SEQ ID NO :8)miR-25 GCATTGCACTTGTCTCGGTCTG (SEQ ID NO :9)miR-451CGAAACCGTTACCATTACTGAGTT (SEQ ID NO :10)实施例2 :实验材料及实验试剂本发明中使用白癜风黑素细胞系PIG3V、白癜风白斑组织及20例临床正常血清样本(其中包括男性10例、女性10例)、20例临床白癜风血清样本。上述均为离体组织。 实验试剂均为常用的分子生物学试剂,主要有mirVana miRNA Isolation Kit(Catalog#1560,1561, Ambion)试剂盒，Trizol试剂，氯仿,异丙醇，乙醇等常规生化试剂均购于 sigma 公司。E. coli Poly (A) Polymerase>10XPoly (A) Polymerase Buffer >5 XrATP solution、10 X RT primer、10 X RT Buffer> 超纯 dNTPMixture、RNasin、QuantRTase^RNase-free ddH20、2 XmiRcute miRNA premix、2XTaq MasterMix^reverse primer均购自QIAGEN公司。实施例3 =Poly (A)加尾法检测白癜风黑素细胞系、白斑组织及血清中miRNA的表达I、MicroRNA 的提取细胞系和组织microRNA 的提取，按照 mirVana miRNA Isolation Kit(Catalog#1560,1561,Ambion)试剂盒所提供的操作步骤,提取上述细胞系和组织样本的总RNA，分装-80 V冰箱冻存，直至检测。血清中mi croRNA的提取，由于细胞系和组织中可以使用U6作为内参照，而血清中没有内参照，加入人工合成的线虫cel-miR-39作为检测样本的外参照，200 y L血清中加入 5 u L 浓度为 5fmol/ U L 的 cel-miR-39。混合后按照 mirVana miRNA IsolationKit (Catalog#1560,1561, Ambion)试剂盒所提供的操作步骤,提取上述血清中总RNA,分装-80 V冰箱冻存，直至检测。2, miRNA 3’ 末端进行加 Poly (A)处理在3个无RNase的0. 2mL PCR管中分别加入I ii g白癜风PIG3V黑素细胞系总RNA、I u g白斑组织总RNA、I u g血清提取得到的RNA，再依次加入0. 4 y L E. coli Poly(A)Polymerase (5U/ u L), 2 u L IOXPoly (A) Polymerase Buffer, 4 u L 5XrATPsolution,RNase-free ddH20补至总体积20 ii L,混勻离心后,在PCR仪中进行Poly (A)加尾反应,反应参数设置为37°C 60min。3、cDNA 合成分别取上述Poly (A)反应液 2 ii L，再加入 2 ii L 10XRT primer,2u L 10XRTBuffer, I u L 超纯 dNTP Mixture (2. 5mM each), IuL RNasin (40U/ u L), 0. 5 u L QuantRTase, RNase-free ddH20补至总体积20 U L,混勻离心后,在PCR仪中进行反转录反应,反应参数设置为37°C 60min。得模板cDNA。由于采用Poly(A)加尾法，反转录得到的cDNA可以作为通用模板用于检测miRNA，因此对应白癜风黑素细胞系、白斑组织及血清共有3个模板cDNA。
4、cDNA产物进行PCR扩增反应在0. 2mL PCR 管中依次加入 10 U L 2 X Taq MasterMix, 0. 4 U L reverse primer(IOuM),对应的miRNA特异性正向引物(10 y M)各0. 4 y L，I y L模板cDNA (步骤2所得)和去离子水8. L,总体积为20ii L。混匀离心后在PCR仪中进行扩增反应。反应参数为94°C 2min，循环条件为94°C 15s，60°C 30s, 72°C lmin，共35个循环。反应结束后取4 y L反应液，进行3%琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图I所示。图I中的M代表2000bp DNA Ladder其中最下面一条带为lOObp。根据该图，可得知经过RT-PCR定性检测及PCR产物序列测定和分析表明，在白癜风黑素细胞系PIG3V总RNA，白斑组织总RNA，血清总RNA中均检测到目标 miRNA 的特异性表达，说明 hsa_let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25 和 miR-451 等 5 种miRNA在白癜风黑素细胞系PIG3V，白斑组织，血清中均存在，为后续实验提供基础。5、cDNA进行荧光定量PCR
在新的0. 2mL PCR 反应管中依次加入 10 u L 2 XmiRcute miRNA premix,0. 4 u Lreverse primer (lOuM),对应的 miRNA 特异性正向引物(10 u M)各 0. 4 u L, 2 u L 模板cDNA (步骤2所得)和去离子水7. 2 ii L，总体积为20 u L。混匀离心后在RT-qPCR仪中进行扩增反应。反应参数为94°C 2min，循环条件为94°C 20s, 60°C lmin，共40个循环。通过该反应可得该5条基因在不同样本中的表达量，进而进行后续分析。6、数据处理荧光定量PCR定量检测miRNA的相对表达变化量时，表达量倍数的变化用公式 RQ=2_S 5CT, 6 6 Ct= 6 Clvitiligo- 6 Clcontrol 其中细胞系和组织中 S
Cl1Vitiligo CTmiR ^TU6
血中 3 CTvitilig0-CTmiE-CTcel_miE_39o 细胞系和组织中 S CTcontrol-CTmiR-CTU6 ;血 ^ 中^ CTcontrol_CTmiR_CTcel—miR—39。 统计学分析采用SPSS16. 0统计分析软件，Excel2003等数据分析工具，当相对标准误(STDEV) < 0. 5，p值< 0. 05时，认为结果在统计学上有显著性差异。如图3所示,分析内容为miRNA在血清中表达的个体差异性分析。该结果说明miRNA可作为白癜风的生物标志物。实施例4 :利用本发明提供的试剂盒检测样本中miRNA的表达—种用于筛查和诊断白癜风病人疗效和预后的试剂盒，由扩增系统和引物系统组成。其中，反转录系统由Poly (A)加尾酶、反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成；扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成；引物系统由hsa_let_7b，miR-15b, miR-16, miR-25和miR-451特异性引物和通用引物组成；具体为反转录系统由E. coli Poly (A) Polymerase 加尾酶、IOXPoly (A)Po I ymeraseBuf f er > Quant RTase 反转录酶、反转录体系 10XRT Buffer 缓冲溶液和 RNase抑制剂组成；扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成，包括2XmiRcutemiRNApremix ；引物系统由hsa-let-7b，miR_15b，miR-16, miR-25 和 miR-451 特异性引物和reverse primer通用引物组成，同实施例I中序列。该实施例中，分别以80个健康人和80个白癜风患者血清为样本，分别用5种不同的microRNA生物标志物进行试验，从而获得如图4所述结果。具体如下
I、血清 microRNA 的提取血清中microRNA的提取,200 UL血清中加入5iiL浓度为5fmol/ ii L的cel-miR-39。混合后按照 mirVana miRNA Isolation Kit (Catalog#1560，1561，Ambion)试剂盒所提供的操作步骤，提取上述血清中总RNA。2, miRNA 3’ 末端进行加 Poly (A)处理在0. 2mL PCR管中加入I y g血清提取得到的RNA，再依次加入0. 4 y L E. coliPoly (A) Polymerase (5U/ U L),2li L 10 X Poly (A) Polymerase Buffer, 4 U L5 XrATPsoIution, RNase-free ddH20补至总体积20 U L,混勻离心后，在PCR仪中进行Poly(A)加尾反应，反应参数设置为37°C 60min。3、cDNA 合成分别取上述Poly (A)反应液 L，再加入 2 ii L IOXRT primer，2 ii L10 X RTBuffer, I u L 超纯 dNTP Mixture (2. 5mM each), I u L RNasin (40U/u L),0. 5 u LQuant RTase, RNase-free ddH20补至总体积20 ii L,混勻离心后，在PCR仪中进行反转录反应，反应参数设置为37°C 60min。得模板cDNA。4、cDNA进行荧光定量PCR在新的0. 2mL PCR 反应管中依次加入 10 u L 2 XmiRcute miRNA premix,0. 4 u Lreverse primer (lOuM),对应的 miRNA 特异性正向引物(10 u M)各 0. 4 u L, 2 u L 模板cDNA (步骤2所得)和去离子水7. 2 ii L，总体积为20 u L。混匀离心后在RT-qPCR仪中进行扩增反应。反应参数为94°C 2min，循环条件为94°C 20s, 60°C lmin，共40个循环。通过该反应可得该5条基因在不同样本中的表达量，进而进行后续分析。5、数据处理荧光定量PCR定量检测所得miRNA的5 Ct值，采用Excel 2003数据分析工具，当相对标准误(STDEV) < 0. 5，认为结果可靠。如图4所示，可得5条miRNA在白癜风血清/正常血清样本中的S Ct值比较分析。分析结果显示该5条miRNA在白癜风血清样本中检测所得的S Ct值显著低于正常血清样本的6(^值。从而推得该5条miRNA在白癜风血清样本中的表达显著高于正常血清样本。也即该5条miRNA可特异性检测白癜风，是白癜风标志物。且当检测样本中 hsa-let-7b 8 Ct ^ 8. 46 ；miR-15b 8 Ct ^ 8. 42 ；miR-16 8 Ct ^ 5. 80 ； miR-25 8 Ct ^ 4. 50 ；miR-451 8 Ct ^ 2. 60 时，提示是白癜风患者。
权利要求
1.一种血清microRNA分子标志物，其特征在于所述血清microRNA分子标志物是hsa_let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451 中任意一个； 其中 hsa-let-7b 的序列是UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU ； miR-15b 的序列是UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA ； miR-16 的序列是UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG ； miR-25 的序列是CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA ； miR-451 的序列是:AAACCGUUACCAUUACUGAGUU。
2.根据权利要求I所述的任何一个血清microRNA分子标志物作为检测白癜风时的应用。
3.根据权利要求2所述的任何一个血清microRNA分子标志物作为制备具有白癜风检测能力试剂盒的应用。
4.一种具有白癜风检测能力试剂盒，其特征在于所述具有白癜风检测能力试剂盒包括反转录系统、扩增系统以及引物系统； 所述反转录系统由 E. coli Poly (A) Polymerase>10XPoly (A) Polymerase Buffer>.5 XrATP solution、10 X RT primer、10 X RT Buffer、超纯 dNTP Mixture、RNasin、QuantRTase、RNase-free ddH20 组成； 所述扩增系统由 2XmiRcute miRNA premix、reverse primer 组成； 所述引物系统由hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451中的任意一个的扩增引物组成 其中 hsa-let-7b 的正向引物是5’ -CCTGAGGTAGTAGGITGTGTGGIT-3’ ； miR-15b 的正向引物是5’ -TAGCAGCACATCATGGITTACA-3’ ； miR-16 的正向引物是5’ -TAGCAGCACGTAAATAITGGCG-3’ ； miR-25 的正向引物是5’ -GCAITGCACTTGTCTCGGTCTG-3’ ； miR-451 的正向引物是5’ -CGAAACCGTTACCATTACTGAGIT-3’。
全文摘要
本发明涉及一种血清microRNA分子标志物及作为白癜风检测方面的应用。该血清microRNA分子标志物是hsa-let-7b，miR-15b，miR-16，miR-25，miR-451中任意一个。
文档编号C12Q1/68GK102757965SQ20121020791
公开日2012年10月31日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者李凯, 李春英, 王刚, 石琼, 郭森, 高天文 申请人:李春英