专利名称：鉴定鸡性连锁矮小基因的一种方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴定鸡性连锁矮小基因的一种方法及其专用引物。
背景技术：
自然界中，哺乳动物的性别属于XY型，而鸟类属于ZW型。造成鸡矮小性状的原因较多，而鸡性连锁矮小基因(sex-linked dwarf gene,简称dw基因)是目前已知的鸡8种矮小基因中唯一对鸡本身健康无害的突变。dw基因是鸡性染色体上的生长激素受体(GHR)基因(Dw基因)3’ -非翻译区(3’ -UTR)存在I. 7kb的缺失突变形成的等位基因。自1935年苏联学者BCHTAMKF发现该基因后，很多学者都对该基因的作用机理和遗传特性进行了探讨，并逐步应用于鸡的育种实践。dw基因位于Z染色体上，定位于肝坏死基因In和无翅基因wl之间，表现为隐性伴性遗传，对正常基因Dw为隐性，只有矮小型基因纯合子的公鸡、和携带矮小基因的母鸡才表现为矮小，明显的外部特征是胫骨缩短20%左右，而ZllwZdw杂合子的公鸡表型正常，不能与纯合非矮小公鸡(ZdwZdw)从表型上区分。人们希望从分子水平准确区分ZllwZdw与ZdwZdw基因型，但是，目前检测dw基因的方法是在缺失片段两端设计引物，通过检测矮小和非矮小鸡基因组片段的大小来进行判断，在扩增过程中，由于该基因缺失片段较长，会导致模板对引物的竞争，从而导致在杂合子中只能检测到缺失后的片段，而非缺失的完整片段难以检测到，因而对于杂合子与纯合非矮小公鸡无法进行准确判断，限制了这一技术在育种工作中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因的成套引物对或引物对及其应用。本发明所提供的成套引物对或引物对，具体为下述I) -3)中的任一种I)用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因的成套引物对，由检测鸡dw基因的引物对I和检测鸡Dw基因的引物对2组成；所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成；2)用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因的引物对，为检测鸡dw基因的引物对
1;所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；3)用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有Dw基因的引物对，为检测鸡Dw基因的引物对
2;所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。上述成套引物对或引物对在制备产品中的应用也属于本发明的保护范围，具体可为如下I、II和III中的任一种I、由检测鸡dw基因的引物对I和检测鸡Dw基因的引物对2组成的成套引物对在制备鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因产品中的应用；所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成；II、检测鸡dw基因的引物对I在制备鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因产品中的应用；所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；III、检测鸡Dw基因的引物对2在制备鉴定或辅助鉴定鸡是否含有Dw基因的产品中的应用；所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。上述成套引物对或引物对的制备方法也属于本发明的保护范围，该方法具体可包括如下I) -3)中的任一步骤
I)以dATP，dTTP，dCTP和dGTP为原料制备序列表中序列I、序列2、序列3和序列4所示的4种单链DNA，得到所述引物对I和所述引物对2 ；2)以dATP，dTTP, dCTP和dGTP为原料制备序列表中序列I和序列2所示的2种单链DNA，得到所述引物对I;3)以dATP，dTTP, dCTP和dGTP为原料制备序列表中序列3和序列4所示的2种单链DNA，得到所述引物对2。含有上述成套引物对或引物对的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒具体可为下述I)-3)中的任一种I)用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因的试剂盒，所述试剂盒含有由检测鸡dw基因的引物对I和检测鸡Dw基因的引物对2组成的成套引物对；所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成；2)用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因的试剂盒，所述试剂盒含有检测鸡dw基因的引物对I ;所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；3)用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有Dw基因的试剂盒，所述试剂盒含有检测鸡Dw基因的引物对2 ;所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围，该方法具体可包括如下I) -3)中的任一步骤I)以dATP，dTTP, dCTP和dGTP为原料制备序列表中序列I、序列2、序列3和序列4所示的4种单链DNA，得到所述引物对I和所述引物对2 ；2)以dATP，dTTP, dCTP和dGTP为原料制备序列表中序列I和序列2所示的2种单链DNA，得到所述引物对I;3)以dATP，dTTP, dCTP和dGTP为原料制备序列表中序列3和序列4所示的2种单链DNA，得到所述引物对2。本发明还提供了鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因的方法，该方法包括如下步骤M)、N)或P):M)以待鉴定鸡的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用检测鸡dw基因的引物对I和检测鸡Dw基因的引物对2进行多重PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，根据PCR扩增产物确定待鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因，或是否候选含有dw基因和/或Dw基因
若所述PCR扩增产物满足如下ml)或m2)的条件，则确定所述待鉴定鸡含有dw基因或候选含有dw基因，若所述PCR扩增产物不满足如下ml)或m2)的条件，则确定所述待鉴定鸡不含有dw基因或候选不含有dw基因；若所述PCR扩增产物满足如下m3)或m4)的条件，则确定所述待鉴定鸡含有Dw基因或候选含有Dw基因，若所述PCR扩增产物不满足如下m3)或m4)的条件，则确定所述待鉴定鸡不含有Dw基因或候选不含有Dw基因；若所述PCR扩增产物满足如下m5)或m6)的条件，则确定所述待鉴定鸡含有dw基因和Dw基因或候选含有dw基因和Dw基因，若所述PCR扩增产物不满足如下m5)或m6)的条件，则确定所述待鉴定鸡不含有dw基因和Dw基因或候选不含有dw基因和Dw基因ml)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示含有200bp_300bp的一个条带；m2)所述PCR扩增产物含有247bp的片段；、
m3)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示含有500bp_600bp的一个条带；m4)所述PCR扩增产物含有522bp的片段；m5 )所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为200bp_300bp的一个条带和500bp-600bp 的一个条带；m6)所述PCR扩增产物为247bp的片段和522bp的片段；N)以待鉴定鸡的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用检测鸡dw基因的引物对I进行PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，根据PCR扩增产物确定待鉴定鸡是否含有dw基因，若所述PCR扩增产物满足如下nl)或n2)的条件，则确定所述待鉴定鸡含有dw基因或候选含有dw基因，若所述PCR扩增产物不满足如下nl)或n2)的条件，则确定所述待鉴定鸡不含有dw基因或候选不含有dw基因；nl)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为200bp_300bp的一个条带；n2)所述PCR扩增产物为247bp的片段；P)以待鉴定鸡的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用检测鸡Dw基因的引物对2进行PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，根据PCR扩增产物确定待鉴定鸡是否含有Dw基因，若所述PCR扩增产物满足如下pi)或p2)的条件，则确定所述待鉴定鸡含有Dw基因或候选含有Dw基因，若所述PCR扩增产物不满足如下pi)或p2)的条件，则确定所述待鉴定鸡不含有Dw基因或候选不含有Dw基因；pi)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为500bp_600bp的一个条带；p2)所述PCR扩增产物为522bp的片段；所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。本发明还提供了鉴定或辅助鉴定鸡基因型的方法，该方法包括如下b) -d)中的任
一步骤b)以待鉴定鸡的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用检测鸡dw基因的引物对I和检测鸡Dw基因的引物对2进行多重PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，根据PCR扩增产物确定待鉴定鸡的基因型是ZdwZdw、ZdwW、ZDwZDw、ZdwW和ZdwZllw这五种基因型中的哪一种、或候选为ZdwZdw、ZdwW、ZDwZDw、ZdwW和ZdwZllw这五种基因型中的哪一种若所述PCR扩增产物满足如下bl)或b2)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为ZdwZdw或ZdwW，或候选为ZdwZdw或ZdwW ;若所述PCR扩增产物满足如下b3)或b4)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为ZdwZdw或ZDwW，或候选为ZdwZdw或ZdwW ;若所述PCR扩增产物满足如下b5)或b6)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为ZdwZllw或候选为ZdwZllw bl)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为200bp_300bp的一个条带；b2)所述PCR扩增产物为247bp的片段；b3)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为500bp_600bp的一个条带；b4)所述PCR扩增产物为522bp的片段；b5 )所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为200bp_300bp的一个条带和500bp-600bp 的一个条带； b6)所述PCR扩增产物为247bp的片段和522bp的片段；c)以待鉴定鸡的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用所述引物对I进行PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，根据PCR扩增产物确定所述待鉴定鸡的基因型为ZdwZdw或ZdwW,或候选为ZdwZdw或ZdwW ;或确定所述待鉴定鸡的基因型为非ZdwZdw或非ZdwW,或候选为非ZdwZdw或非ZdwW 若所述PCR扩增产物满足所述bl)或b2)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为 ZdwZdw 或 ZdwW,或候选为 ZdwZdw 或 ZdwW ；若所述PCR扩增产物不满足所述bl)或b2)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为非ZdwZdw或非ZdwW,或候选为非ZdwZdw或非ZdwW ；d)以待鉴定鸡的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用所述引物对2进行PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，根据PCR扩增产物确定所述待鉴定鸡的基因型为ZdwZdw或ZDwW，或候选为ZdwZdw或ZdwW ;或确定所述待鉴定鸡的基因型为非ZdwZdw或非ZDwW，或候选为非ZdwZdw或非ZdwW 若所述PCR扩增产物满足所述b3)或b4)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为 ZdwZdw 或 ZDwW，或候选为 ZdwZdw 或 ZdwW ；若所述PCR扩增产物不满足所述b3)或b4)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为非ZdwZdw或非ZdwW或候选为非ZdwZdw或非ZdwW ；所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。上述方法中，所有所述多重PCR扩增和所有所述PCR扩增的退火条件具体可为570C 30 秒。上述方法中，所有所述多重PCR扩增和所有所述PCR扩增的条件可为95°C预变性5分钟；然后按照下列參数进行循环反应95°C预变性5分钟；94°C变性30秒，57°C复性30秒，72°C延伸35秒，循环35次；循环反应结束后在72°C保持7分钟。上述成套引物对或引物对、试剂盒、或方法在鸡的育种中的应用也属于本发明的保护范围。其中，上述成套引物对中引物对I和引物对2均单独包装。上述方法中，247bp和522bp PCR产物的大小可采用测序、聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检測。本发明在GHR基因缺失段内部设计检测鸡Dw基因引物对2，在GHR基因缺失段的上、下游设计检测鸡dw基因引物对1，这样，利用多重PCR反应体系，利用缺失区段内部的引物和缺失区段两端的引物进行同时扩增，这样ZdwZdw或ZdwW基因型个体只能检测到缺失后的片段，ZdwZdw或ZdwW基因型个体只能检测到未缺失区段的扩增产物，而杂合子ZdwZllw个体则能同时检测到这两个片段。这一方法检测手段操作简单，检测结果准确可信，适合在性连锁矮小型鸡育种工作中进行应用。
图I为基因型为ZdwZdw的寿光鸡公鸡的凝胶电泳图。图2为基因型为ZdwZdw的明星C系公鸡的凝胶电泳图。图3为由基因型为ZdwZdw的寿光鸡公鸡与基因型为ZdwW的明星C系母鸡杂交后回交一代公鸡性连锁矮小型杂合子ZdwZllw的凝胶电泳图。图4为公鸡性连锁矮小型纯合子ZdwZdw和公鸡性连锁矮小型杂合子ZdwZllw的制备流程图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因的试剂盒该试剂盒中的试剂由成套引物对和PCRmix组成。成套引物对由检测鸡dw基因的引物对I和检测鸡Dw基因的引物对2组成。引物对I由序列表中序列I所不的引物和序列表中序列2所示的引物组成；引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。该试剂盒中引物对I和引物对2分别单独包装。PCRmix (北京汇天东方科技有限公司)其中，检测鸡dw基因引物对I根据伴性矮小型鸡GHR基因3’端缺失段的上游和下游设计；引物对I的正向引物在GHR基因3’端缺失段的上游90bp处设计，反向引物根据GHR基因的缺失段的下游157bp处设计。引物对I用于检测鸡性连锁矮小突变等位基因dw基因。检测鸡Dw基因的引物对2在GHR基因的缺失段内部设计，引物对2的正向引物根据GHR基因缺失段内部的上游设计，反向引物根据GHR基因缺失段内部的下游设计。引物对2用于检测鸡非矮小等位基因Dw基因。引物对I和引物对2的具体序列及扩增产物大小如表I。表I本发明设计的PCR扩增弓丨物
权利要求
1.成套引物对或引物对，为下述I)-3)中的任一种 1)用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因的成套引物对，由检测鸡dw基因的引物对I和检测鸡Dw基因的引物对2组成；所述引物对I由序列表中序列I所不的引物和序列表中序列2所示的引物组成；所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成； 2)用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因的引物对，为检测鸡dw基因的引物对I;所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成； 3)用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有Dw基因的引物对，为检测鸡Dw基因的引物对2;所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。
2.权利要求I所述的成套引物对或引物对在制备产品中的应用，其特征在于所述应用为如下I、II和III中的任一种 I、由检测鸡dw基因的引物对I和检测鸡Dw基因的引物对2组成的成套引物对在制备鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因产品中的应用；所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成； II、检测鸡dw基因的引物对I在制备鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因产品中的应用；所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成； III、检测鸡Dw基因的引物对2在制备鉴定或辅助鉴定鸡是否含有Dw基因的产品中的应用；所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。
3.权利要求I所述的成套引物对或引物对的制备方法，包括如下I)-3)中的任一步骤 1)以dATP，dTTP，dCTP和dGTP为原料制备序列表中序列I、序列2、序列3和序列4所示的4种单链DNA，得到所述引物对I和所述引物对2 ； 2)以dATP，dTTP，dCTP和dGTP为原料制备序列表中序列I和序列2所示的2种单链DNA，得到所述引物对I ; 3)以dATP，dTTP,dCTP和dGTP为原料制备序列表中序列3和序列4所示的2种单链DNA，得到所述引物对2。
4.试剂盒，其特征在于所述试剂盒为下述I)-3)中的任一种 1)用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因的试剂盒，所述试剂盒含有由检测鸡dw基因的引物对I和检测鸡Dw基因的引物对2组成的成套引物对；所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成； 2)用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因的试剂盒，所述试剂盒含有检测鸡dw基因的引物对I ;所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成； 3)用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有Dw基因的试剂盒，所述试剂盒含有检测鸡Dw基因的引物对2 ;所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。
5.权利要求4所述的试剂盒的制备方法，包括如下I)-3)中的任一步骤1)以dATP，dTTP，dCTP和dGTP为原料制备序列表中序列I、序列2、序列3和序列4所示的4种单链DNA，得到所述引物对I和所述引物对2 ； 2)以dATP，dTTP,dCTP和dGTP为原料制备序列表中序列I和序列2所示的2种单链DNA，得到所述引物对I ; 3)以dATP，dTTP,dCTP和dGTP为原料制备序列表中序列3和序列4所示的2种单链DNA，得到所述引物对2。
6.鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因的方法，包括如下步骤M)、N)或P) M)以待鉴定鸡的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用检测鸡dw基因的引物对I和检测鸡Dw基因的引物对2进行多重PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，根据PCR扩增产物确定待鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因，或是否候选含有dw基因和/或Dw基因 若所述PCR扩增产物满足如下ml)或m2)的条件，则确定所述待鉴定鸡含有dw基因或候选含有dw基因，若所述PCR扩增产物不满足如下ml)或m2)的条件，则确定所述待鉴定鸡不含有dw基因或候选不含有dw基因； 若所述PCR扩增产物满足如下m3)或m4)的条件，则确定所述待鉴定鸡含有Dw基因或候选含有Dw基因，若所述PCR扩增产物不满足如下m3)或m4)的条件，则确定所述待鉴定鸡不含有Dw基因或候选不含有Dw基因； 若所述PCR扩增产物满足如下m5)或m6)的条件，则确定所述待鉴定鸡含有dw基因和Dw基因或候选含有dw基因和Dw基因，若所述PCR扩增产物不满足如下m5)或m6)的条件，则确定所述待鉴定鸡不含有dw基因和Dw基因或候选不含有dw基因和Dw基因ml)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示含有200bp-300bp的一个条带；m2)所述PCR扩增产物含有247bp的片段； m3)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示含有500bp-600bp的一个条带； m4)所述PCR扩增产物含有522bp的片段； m5 )所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为200bp-300bp的一个条带和500bp-600bp 的一个条带； m6)所述PCR扩增产物为247bp的片段和522bp的片段； N)以待鉴定鸡的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用检测鸡dw基因的引物对I进行PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，根据PCR扩增产物确定待鉴定鸡是否含有dw基因，若所述PCR扩增产物满足如下nl)或n2)的条件，则确定所述待鉴定鸡含有dw基因或候选含有dw基因，若所述PCR扩增产物不满足如下nl)或n2)的条件，则确定所述待鉴定鸡不含有dw基因或候选不含有dw基因； nl)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为200bp-300bp的一个条带； n2)所述PCR扩增产物为247bp的片段； P)以待鉴定鸡的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用检测鸡Dw基因的引物对2进行PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，根据PCR扩增产物确定待鉴定鸡是否含有Dw基因，若所述PCR扩增产物满足如下pi)或p2)的条件，则确定所述待鉴定鸡含有Dw基因或候选含有Dw基因，若所述PCR扩增产物不满足如下pi)或p2)的条件，则确定所述待鉴定鸡不含有Dw基因或候选不含有Dw基因； Pl)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为500bp-600bp的一个条带； P2)所述PCR扩增产物为522bp的片段； 所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；所述弓丨物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。
7.鉴定或辅助鉴定鸡基因型的方法，包括如下b)-d)中的任一步骤 b)以待鉴定鸡的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用检测鸡dw基因的引物对I和检测鸡Dw基因的引物对2进行多重PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，根据PCR扩增产物确定待鉴定鸡的基因型是ZdwZdw、ZdwW、ZDwZD\ ZdwW和ZdwZllw这五种基因型中的 哪一种、或候选为Zdwzdw、ZdwW、ZDwZDw、ZdwW和ZdwZllw这五种基因型中的哪一种 若所述PCR扩增产物满足如下bl)或b2)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为ZdwZdw或ZdwW,或候选为ZdwZdw或ZdwW ;若所述PCR扩增产物满足如下b3)或b4)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为ZdwZdw或ZDwW，或候选为ZdwZdw或ZdwW ;若所述PCR扩增产物满足如下b5)或b6)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为ZdwZllw或候选为ZdwZllw bl)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为200bp-300bp的一个条带；b2)所述PCR扩增产物为247bp的片段； b3)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为500bp-600bp的一个条带； b4)所述PCR扩增产物为522bp的片段； b5 )所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为200bp-300bp的一个条带和.500bp-600bp 的一个条带； b6)所述PCR扩增产物为247bp的片段和522bp的片段； c)以待鉴定鸡的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用所述引物对I进行PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，根据PCR扩增产物确定所述待鉴定鸡的基因型为ZdwZdw或ZdwW,或候选为ZdwZdw或ZdwW ;或确定所述待鉴定鸡的基因型为非ZdwZdw或非ZdwW,或候选为非ZdwZdw或非ZdwW 若所述PCR扩增产物满足所述bl)或b2)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为ZdwZdw 或 ZdwW,或候选为 ZdwZdw 或 ZdwW ； 若所述PCR扩增产物不满足所述bl)或b2)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为非ZdwZdw或非ZdwW,或候选为非ZdwZdw或非ZdwW ； d)以待鉴定鸡的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用所述引物对2进行PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，根据PCR扩增产物确定所述待鉴定鸡的基因型为ZdwZdw或ZDwW，或候选为ZdwZdw或ZdwW ;或确定所述待鉴定鸡的基因型为非ZdwZdw或非ZDwW，或候选为非ZdwZdw或非ZdwW 若所述PCR扩增产物满足所述b3)或b4)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为ZdwZdw 或 ZDwW，或候选为 ZdwZdw 或 ZdwW ； 若所述PCR扩增产物不满足所述b3)或b4)的条件，则确定所述待鉴定鸡的基因型为非ZdwZdw或非ZdwW或候选为非ZdwZdw或非ZdwW ； 所述引物对I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；所述弓丨物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所有所述多重PCR扩增和所有所述PCR扩增的退火条件为57°C 30秒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所有所述多重PCR扩增和所有所述PCR扩增的条件为95°C预变性5分钟；然后按照下列参数进行循环反应95°C预变性5分钟；94°C变性30秒，57°C复性30秒，72°C延伸35秒，循环35次；循环反应结束后在72°C保持7分钟。
10.权利要求I所述的成套引物对或引物对、权利要求4所述的试剂盒、或权利要求6-9中任一所述的方法在鸡的育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了鉴定鸡的性连锁矮小基因的一种方法及其专用引物。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定鸡是否含有dw基因和/或Dw基因的成套引物对，由检测鸡dw基因的引物对1和检测鸡Dw基因的引物对2组成；所述引物对1由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。本发明通过在GHR基因缺失片段内部设计引物，利用多重PCR反应体系，将缺失区段内部的引物和缺失区段两端的引物进行同时扩增。这一方法检测手段操作简单，检测结果准确可信，适合在性连锁矮小型鸡育种工作中进行应用。
文档编号C12Q1/68GK102747077SQ20121020769
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者吴常信, 肖凡, 葛雅琼, 邓学梅, 魏霞 申请人:中国农业大学