专利名称：人源抗EV71病毒中和性抗体EV71FabK7、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程抗体技术，具体地说，涉及一种人源抗EV71病毒中和性抗体EV71FabK7、其制备方法及应用。
背景技术：
手足口病(Hand foot mouth disease, HFMD)是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下的婴幼儿，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中柯萨奇病毒(Cox Asckievirus) A16 M (Cox A16)和肠道病毒 71 型(Enterovirus71. EV71)最常见。1974年Schmidt等人首次报道从美国加利福尼亚暴发的表现为神经系统症状疾病 (196扩1973年)的患者体内分离到EV71，随后，世界上许多国家相继报道了 EV71病毒在不同地区的流行情况，人们逐渐认识到EV71病毒是手足口病的主要病原。由于手足口病目前没有相应的疫苗和特异性药物，因此制备高效、价廉、副反应小的被动免疫制剂成为研究的热点。利用含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白来预防和治疗传染病由来已久。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护肌体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如汉坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、狂犬病毒等中和性单克隆抗体可以在体内100%保护动物免受病毒攻击.免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)作为抗体成分主要来自捐献者(恢复期病人)免疫血清，从获得阳性血清到通过安全性检测耗时较长，且需投入大量的人力和财力，这就使其大量制备受到限制，同时由于抗体主要来源于血清，因此容易发生血源性传播疾病的感染。而使用人源基因工程产品替代血制品则可克服这些缺陷，随着人源基因工程抗体研究的不断深入，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和广阔前景。90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术(Barbas, C. F.等.，1991)和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，极大促进了人源或基因工程抗体的开发研究，并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。人源抗病毒基因工程抗体，尤其是人源全抗体的研究成功，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗开辟了新思路，并在抗病毒感染生物医药领域中逐渐开发出一类新的抗病毒药。
发明内容
本发明的目的是提供一种人源抗EV71病毒中和性抗体EV71FabK7或其活性片段。本发明的另一目的是提供所述抗体EV71FabK7或其活性片段的制备方法。本发明的再一目的是提供所述抗体EV71FabK7或其活性片段的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种人源抗EV71病毒中和性抗体EV71FabK7或其活性片段，其轻链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如表I所示
表I抗体EV71FabK7的重链及轻链高变区的氨基酸序列
CDRlCDR2CDR3
重链 VH SGYYWGSIYHSGSTYYNPSLKSDSSYNGFDP
轻链 VL RASQSISSSFLA SASSRATQQYATSLRT前述的抗体EV71FabK7，i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第16位的Arg替换为Lys不会影响蛋白的功能。前述的抗体EV71FabK7，ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第8位的Val替换为Ala不会影响蛋白的功能。本发明还提供编码所述抗体EV71FabK7的基因。其中，编码轻链可变区和编码重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。本发明还提供含有编码所述抗体EV71FabK7的基因的载体及含有该载体的宿主细胞。本发明还提供所述抗体EV71FabK7或其活性片段经改造得到的单链抗体ScFv或全抗体免疫球蛋白IgG。本发明还提供所述抗体EV71FabK7或其活性片段的制备方法，利用噬菌体表面展示技术，采集多个EV71病人恢复期外周血淋巴细胞，通过基因工程方法构建了人源抗EV71病毒基因工程抗体文库，并筛选获得特异性抗EV71病毒的基因工程抗体Fab段。该抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的，并能够在原核细胞中获得有效表达的特异性结合EV71病毒的功能性抗体。它特异性识别EV71病毒颗粒抗原，与EV71病毒具有明显的酶联免疫(ELISA)反应和抗EV71病毒感染的中和活性功能。EV71FabK7特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗EV71病毒抗体基因库的特异性富积筛选，该抗体库的建立来源于中国EV71病毒病人外周血淋巴细胞基因。其轻链和重链可变区相应的三个CDR区序列组合及其CDR区之间的框架区序列构成了该抗体可变区序列特征，EV71FabK7属于抗体轻链家族VL1。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列及其互补序列所决定，6个相应的CDR区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，决定了本发明抗体的抗原结合特征和抗EV71病毒功能特征。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述Fab段抗体的基因序列进行改造，获得编码具有相同功能的抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。进一步地，本发明将上述Fab抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组，获得分子量更小的单链抗体(ScFv)，该抗体同样能够特异性识别EV71病毒表面抗原，具有细胞内、免疫的作用。单链抗体穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。可将上述编码Fab抗体的基因、ScFv基因克隆到表达载体中，进而转化宿主，通过诱导表达获得Fab抗体以及单链抗体。此外，可将上述Fab抗体的轻链编码基因和重Fd段基因克隆到全抗表达载体中，并导入宿主细胞中，获得表达抗EV71病毒的全抗免疫球蛋白。利用ELISA、SDS-PAGE、中和实验等方法对获得的Fab抗体进行功能鉴定，结果表明人源Fab抗体EV71FabK7针对SHZH98株和FUYANG-0805株EV71病毒颗粒均有特异性结合，利用中和实验对Fab抗体进行功能鉴定，结果表明EV71FabK7具有较好的中和活性。、
本发明还提供所述抗体EV71FabK7或其活性片段在制备预防或治疗手足口病的药物中的应用。本发明进一步含有所述抗体EV71FabK7或其活性片段的药物或检测试剂。本发明利用噬菌体抗体库技术，成功地获得了特异性针对EV71病毒的人源中和性抗体EV71FabK7 ;利用上述获得的人源中和性抗EV71病毒基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及该抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产该抗体或以此为基础的改建后的含有该抗体基因的任何其他基因，获得具有中和EV71病毒感染的抗体产物，制成临床上用于预防和治疗手足口病的特异性抗体药物。
图I为纯化后EV71FabK7抗体的SDS-PAGE电泳图；其中，I为纯化抗体EV71FabK7。M为蛋白Marker。图2为抗EV71病毒人源EV71FabK7抗体的ELISA检测(SHZH98株)结果，其中阳性对照为商业鼠抗，阴性对照为柯萨奇A4病毒抗体。图3为抗EV71病毒人源EV71FabK7抗体的ELISA检测(FUYANG-0805株)结果，其中阳性对照为商业鼠抗，阴性对照为柯萨奇A4病毒抗体。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例I人源抗EV71病毒抗体库的构建及Fab抗体的筛选I. I材料和方法I. I. I病毒、细胞及载体来源EV71病毒SHZH98株和FUYANG-0805株已在文献(Yang F，Jin Q, He Y，Li L, Hou Y. 2001. The complete genome of Enterovirus 71 Chinastrain.Sci China C Life Sci 和 Wu Z, Yang F, Zhao R, Zhao L, Guo D, Jin Q. 2009.Identification of small interfering RNAs which inhibit the replication ofseveral Enterovirus 71 strains in China. J Virol Methods)中公开，由中国医学科学院病原生物学研究所提供。用于EV71病毒体外中和实验的细胞为RD细胞，购自ATCC。菌株为XLl-Blue (Stratagene,美国),载体pComb3H(由美国Scripps研究所提供)。I. I. 2抗原制备
EV71病毒纯化分别收获EV71病毒SHZH98株和FUYANG-0805株感染RD细胞后培养上清，经甲醛灭活和安全检查后，用20%蔗糖密度梯度35000g，4°C离心3h纯化病毒颗粒(Beckman SW28)。I. I. 3噬菌体抗体库的构建用淋巴细胞分离液(Sigma，美国)从EV71病人恢复期抗凝血液中分离淋巴细胞，用RNeasy Mini Kit (QIAGEN，德国)提取总细胞RNA，以Oligo-dT为引物，提取的RNA为模版采用 Invitrogen公司的第一链合成试剂盒(SuperScriptTMIII First-Strand SynthesisSystemfor RT-PCR. Cat No. 18080-051)逆转录生成cDNA。用一组扩增人源抗体IgGl重链Fd及轻链Kappa和Lambda的引物,使用的弓I物序列如下
(一)重链Fd区引物5，端VHla 5，-CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GGG-3’VHlf 5’-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3’VH2f 5’-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TCG GG-3’VH3a 5’-GAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GGG-3'VH3f 5’-GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3'VH4f 5，-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3’VH6f 5’-CAG GTG CAG CTA CTA GAG TGG GG-3’VH6a 5’-CAG GTA CAG CTC GAG CAG TCA GG-3’3，端CGlZ 5’-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG-3'(二)轻链引物K链可变区5’ -端VKla 5’-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’VK2a 5’-GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3'VK3a 5’-GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA-3'K链可变区3-端CKld 5，-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCCTGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG AAC TCA-3’入链可变区5_端VLl 5’-AAT TTT GAG CTC ACT CAG CCC CAC-3’VL2 5，-TCT GCC GAG CTC CAG CCT GCC TCC GTG-3’VL3 5，-TCT GTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG-3'VL4 5’-TCT GAA GAG CTC CAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG-3'VL5 5’-CAG TCT GAG CTC ACG CAG CCG CCC-3’VL6 5，-CAG ACT GAG CTC ACT CAG GAG CCC-3'入链可变区3-端CL2 5’-CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3’对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为94°C lmin，54°C lmin,72°C 2min,共35个循环。建库方法基本按文献(Barbas, C. Fill. , Kang, A. S. , and larner, R.A.Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface: the gene IIIsite. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 88 (18) :7978-7982)进行。具体如下首先将所有不同的重链和轻链PCR产物分别按各自组群混合。取经XbaI和SacI酶切消化，并经电泳纯化后的pComb3H载体DNA1. 5-2 u g与轻链混合物500_700ng，加入2u I高浓度连接酶(NEB2000U/iil)，加入连接缓冲液，16°C过夜连接。次日加入100 yl纯化水，加入3M NaAc 16 yl，加2. 5-3倍无水乙醇沉淀DNA，离心沉淀，用20 U I纯水重悬沉淀后加入到电转感受态菌XLl-Blue中，电压2. 5kv，电击I分钟。电转后立即加入2ml SOC培养液，然后立即转入细菌培养箱中，37°C振荡培养I小时。将菌液全部涂于含氨苄青霉素的LB平皿上，37°C培养过夜。次日向平皿中加入10-15ml培养液，刮取菌斑，分装于离心管，12000rpm离心后弃上清，全部用QIAGEN大提质粒试剂盒提取质粒pComb3H-L，混合后冻存于-20°C待用。将克隆入L链的pComb3H-L和Fd链纯化PCR产物，分别用XhoI和SpeI进行双酶切反应，37°C 3-4h。电泳回收相应的条带，将质粒和Fd酶切后回收产物定量。取酶切消化后回收纯化的载体DNA g，重链PCR产物600ng左右，加入2iU高浓度连接酶，力口入相应的连接缓冲液，16°C连接过夜。次日加100 Ul纯化水，加3M NaAc 16^1，加2. 5-3 倍无水乙醇沉淀DNA，离心沉淀，用20iU纯水重悬沉淀并加入到电转感受态菌XLl-Blue中，电压2. 5kv,电击I分钟。电转后立即加入2ml SOC培养液，然后立即转入细菌培养箱中，37°C 200rpm振荡培养lh。将菌液转入一个三角瓶中，加入含20 y g/ml氨苄青霉素的10ml SB-A+，370C 200rpm振荡培养I小时。加入IOOml SB培养液(含100 u g/ml的Amp和20ii g/ml的Tet)，震荡培养I小时。加入1012pfu辅助噬菌体VCSM13，37°C静止感染20min，然后37°C培养2h加入终浓度为70 ii g/ml的Kan，37°C培养过夜。待0D600约为I时，将菌液4°C 4000rpm离心15min,转移上清至无菌三角瓶中，加入4% (w/v)PEG8000和3% (w/v)NaCl，完全溶解后冰浴30min以上以沉淀噬菌体。4°C 9000rpm离心20_30min，弃上清将沉淀用2ml PBS重悬，瞬时离心，上清即为Fab噬菌体抗体库。I. I. 4噬菌体抗体库的富集筛选及Fab段抗体的诱导表达 以超速离心纯化的灭活病毒颗粒SHZH98和FUYANG-0805株为筛选抗原。使用时用0. IM NaHCO3 (pH8. 6)溶液稀释，包被免疫管，用含4%脱脂奶的PBS液，于37°C封闭2h后，力口入上述噬菌体抗体库，每管lml，37°C孵育2h，用含5%TWeen-20的TBS液反复洗20遍，最后每管用Iml pH2. 2的甘氨酸-盐酸洗脱液洗脱，并用pH9. 6的Tris液中和。洗脱后的噬菌体继续感染2ml新鲜的OD6tltl为I. 0左右的XLl-Blu菌，经辅助噬菌体VCSM13 (Stratagene,美国)感染后进行下一轮筛选。如此反复筛选3 4次。具体富集筛选方法及Fab段的诱导表达基本按文献(Barbas, C. Fill.，Kang, A. S.，and larner, R. A. Assembly of combinatorialantibody libraries on phage surface: the gene III site. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1991; 88 (18) :7978-7982)进行。噬菌体抗体库的富集用0. IM NaHCO3CpH8. 6)的溶液将纯化的SHZH98株按I :100稀释分别包被96孔板，4°C过夜。次日用PBS-T(20mM PBS加入0. 05% Tween-20)洗去未吸附的抗原，用3%的脱脂奶37°C封闭lh。弃封闭液，每孔加入60iU噬菌体抗体库，37°C孵育 2h。弃去孔中未结合的噬菌体，用 TBS-T(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0. 5% Tween-20,pH7. 5)洗液冲洗各孔，冲洗时用移液器反复吹打，共洗20次，以充分洗去未吸附的噬菌体。最后用ddH20洗两遍，吸净孔中剩余液体。每孔加入50 ill Glycine-HCl (pH2. 2)的洗脱液，室温孵育lOmin，在此过程中，用移液器吸头反复吹打(注意勿吹出气泡)。将洗脱液集中于一个离心管，按照每孔3 的比例加入2M Tris，使溶液pH值约为7，以中和洗脱下的噬菌体。将洗脱的噬菌体立即加入2ml新鲜的XLl-Blue菌液中(0D600 = I),室温孵育20min。转入一个250ml三角瓶中，加入IOml SB(含氨苄青霉素20 y g/ml和四环素20 y g/ml )，立即取10 ill涂于氨苄平皿，用于滴定噬菌体。其余液体37 °C振荡培养Ih。加入IOOmlSB (含氨苄青霉素IOOii g/ml和四环素20 ii g/ml)，37°C振荡培养2h。之后，加入辅助噬菌# VCSMl3 (9X1012pfu/ml) lml，37°C静止 20min，37°C振荡培养 2h。加入卡那霉素(终浓度70 ii g/ml)，37°C振荡培养过夜。待细菌长到0D600约为I时，将菌液4°C 6500rpm离心15min，转移上清至无菌三角瓶，加入4% (ff/V) PEG8000和3% (ff/V) NaCl，完全溶解后冰浴30min以上以充分沉淀噬菌体。4°C 9000rpm离心20-30min，弃上清。将沉淀用2ml PBS重悬，瞬时离心，上清即为第一轮富集筛选Fab噬菌体抗体库。 Fab阳性克隆的表达随机挑选2000个经3次富集筛选后的单菌落于96深孔板中，每孔800 ill培养基，37°C培养过夜。次日以1:20的比例转接至含有800 ill SB培养基(含Amp IOOu g/ml)的96孔板中，37°C培养至0D600 = 0. 2-0. 3时，加入终浓度为ImM的IPTG, 30°C诱导表达8-10hr。4°C 4000rpm离心15min,上清用于检测。1.1.5人源抗EV71病毒Fab抗体的ELISA检测(I)检测Fab的表达用0. IM NaHCO3 (pH9. 6)溶液将抗人Fab抗体(I 2000稀释后使用，Sigma,美国)包被于酶标板上，4°C过夜；4%脱脂奶封闭，37°C lh，加入表达的Fab抗体，37°C Ih ;加入酶标抗人Fab 二抗(I 2000稀释后使用，Sigma，美国)，37°C Ih;显色液显色，2M H2SCU*止反应，酶标仪检测吸光度A值。(2)间接酶联免疫法检测Fab与EV71病毒结合活性用纯化的灭活EV71病毒颗粒作为包被抗原，其余步骤同上。I. I. 6人源Fab抗体可变区基因的核酸序列分析用Qiagen Miniprep Kit (QIAGEN,德国)制备质粒 DNA 进行核酸序列分析。轻重链的测序引物分别为5 ' -AAACTAGCTAGTCGCCAAGGA-3丨和5 ; -CCGCGGTGGCGGCCGCAAAT-3 ;。将测序结果与 Internet V-Base 基因库中 IgG 基因序列进行比较。I. I. 7人源抗EV71病毒Fab抗体的纯化用抗人Fab的抗体(Sigma,美国)制备2ml亲和层析柱,将滤过的含Fab抗体的菌液加于亲和层析柱中，反复循环30min至lh。加入pH值6. 8的PBS预洗缓冲液，洗去非特异性吸附蛋白。加入pH值2. 7的甘氨酸盐酸缓冲液洗脱结合的Fab抗体蛋白，加入pH值
9.0的Tris-HCl缓冲液中和洗脱下来的溶液，然后用浓缩柱离心浓缩。取纯化浓缩后的Fab片段蛋白10 20 u g进行SDS-PAGE电泳。I. I. 8人源抗EV71病毒Fab抗体的中和实验检测( I)实验步骤将100TCID50EV71病毒25 U I和倍比稀释的抗体25 iU于37°C共同孵育2小时，然后加入浓度为2 X IO5个RD细胞/ml的细胞培养液50iU。观察7天，记录细胞病变结果。
(2)结果判定当最高稀释度抗体的2孔中有I孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数即为该抗体的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该抗体的中和抗体效价；当两个相邻稀释度抗体均出现I孔细胞病变，另I孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该抗体的中和抗体效价。I. 2 结果I. 2. I人源抗EV71病毒抗体库的筛选用纯化的EV71病毒颗粒SHZH98株对噬菌体抗体库进行富集筛选，3轮筛选后随机挑取2000个克隆。用抗人Fab抗体(I 2000稀释后使用，Sigma，美国)和EV71病毒颗粒SHZH98株抗原包被96孔板，加入待测样品上清，用酶标抗人Fab 二抗(I 2000稀释后使用，Sigma，美国)检测。结果显示共获得816个人源Fab表达阳性克隆，其中，413个克隆能 够特异性结合EV71病毒颗粒SHZH98株(表2)。表2SHZH98株对噬菌体抗体库富集筛选结果
权利要求
1.人源抗EV71病毒中和性抗体EV71FabK7或其活性片段，其特征在于，其轻链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如下表所示
2.根据权利要求I所述的抗体EV71FabK7，其特征在于， i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQID No. I所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及 ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQID No. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.编码权利要求2所述抗体EV71FabK7的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，编码轻链可变区和编码重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。
5.含有权利要求3或4所述基因的载体。
6.含有权利要求5所述载体的宿主细胞。
7.权利要求I或2所述抗体EV71FabK7或其活性片段经改造得到的单链抗体ScFv或全抗体免疫球蛋白IgG。
8.权利要求I或2所述抗体EV71FabK7或其活性片段的制备方法，其特征在于，利用噬菌体表面展示技术，采集多个具有高滴度EV71病毒抗体的病人外周血淋巴细胞，通过基因工程方法构建了人源抗EV71病毒基因工程抗体文库，并筛选获得特异性抗EV71病毒的基因工程抗体Fab段，命名为EV71FabK7。
9.权利要求I或2所述抗体EV71FabK7或其活性片段在制备预防或治疗手足口病的药物中的应用。
10.含有权利要求I或2所述抗体EV71FabK7或其活性片段的药物或检测试剂。
全文摘要
本发明提供了一种利用噬菌体表面展示技术筛选获得的人源抗EV71病毒中和性抗体EV71FabK7，其轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。该抗体能够特异性识别EV71病毒颗粒抗原，可与EV71病毒发生显著的酶联免疫反应且具有抗EV71病毒感染的中和活性功能。此外，可将本发明的抗体制成预防和治疗手足口病的特异性抗体药物，从而在临床中用于预防和治疗由EV71病毒引起的手足口病。
文档编号C12N15/63GK102718864SQ20121020784
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者金奇, 陈哲 申请人:中国医学科学院病原生物学研究所