专利名称：锌指蛋白的快速筛选方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于锌指蛋白的快速筛选方法。
背景技术：
锌指蛋白最初于1983年由诺贝尔奖获得者Klug和同事在非洲爪蟾卵母细胞的转录因子TFIIIA中被发现，是迄今在真核生物基因组中分布最广的一类蛋白，人类基因组中有近1%的序列编码含有锌指结构的蛋白，由于该类蛋白形状类似于一根手指，因此而得名。自从发现非洲爪蟾转录因子TFIII，许多科研工作者展开了一系列的研究，揭示了人工锌指蛋白的广阔应用前景。根据锌指蛋白保守结构域的差异，可以将锌指蛋白分为C2H2型(Krilppel相关型)、C4型和C6型等3个类群。C2H2锌指是真核细胞中最常见的DNA结合模体。由于C2H2锌指域靶位点特异性与结构和功能的模块性构成，使得C2H2锌指域对构建特定的DNA结合蛋白十分有用。2005年4月23日，Cys2His2锌指蛋白作为人类基因治疗的革命性的工具这一消息被刊登上了泰晤士报。目前锌指蛋白已经被成功地应用与构建靶向特定基因的人工转录因子、靶向特定基因的锌指核酸酶(可使基因打靶的效率提高IO3-IO5,该技术在2010年被科学家杂志评为十大科技进展)，对该领域产生了深远的影响。Pavletich等(1991)的Zif268_DNA晶体复合物X射线衍射分析表明锌指单元的α螺旋伸入DNA大沟中，通过其外侧的氨基酸残基来识别DNA双螺旋大沟中相邻的3 4bp序列，并通过氢键与相应的碱基特异结合。而且与锌指单元的靶位点特异性相关的主要是α螺旋的第-1，1，2，3，6位残基。因此可以通过控制锌指单元的数量可以识别特定长度的DNA序列的锌指蛋白，正是由于锌指蛋白这种特殊的结构使得能够人工筛选针对任何特定DNA序列的锌指蛋白(理论上)。目前研究人员已经开发出的锌指蛋白的筛选方法总的来说可以分为两类一类是利用已经单独筛选好的锌指单元进行随机的组合，产生锌指蛋 白；另一类是考虑到锌指单元在结合时受到两侧的锌指单元的影响，在保持两个锌指单元不动的情况下进行第三个锌指的筛选。这些方法仍然存在以下缺点I、这些方法都是在细菌或是酵母中进行，因此锌指与DNA的结合并不一定反应在哺乳动物细胞中的实际结合能力。2、这些筛选方法不够敏感，对于结合能力弱的锌指蛋白容易被或略。3、这些筛选方法成功率很低，工作量很大，一般实验室难以实施。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述锌指蛋白的筛选方法的缺点，提供一种简单、高效的锌指蛋白的快速筛选方法。解决上述技术问题所采用的技术方案是由下述步骤组成I、构建小型锌指蛋白库通过在线锌指蛋白预测软件预测锌指蛋白靶序列并组装锌指蛋白，选择1-50个锌指蛋白组成小型锌指蛋白库。
2、构建嵌合型转录因子和锌指蛋白检测载体由N端的锌指蛋白和C端的转录激活结构域形成融合蛋白，在锌指蛋白的5丨端插入核定位信号，组装成嵌合型转录因子，由锌指蛋白靶序列和下游的启动子核心元件组成嵌合型启动子，在嵌合型启动子的下游插入报告基因组成锌指蛋白检测载体。3、在哺乳动物细胞中筛选锌指蛋白将嵌合型转录因子和锌指蛋白检测载体共转染到哺乳动物细胞内作为实验组，将锌指蛋白检测载体单独转染到哺乳动物细胞内作为对照组，实验组的报告基因表达强度高于或等于对照组5倍的是合格的锌指蛋白。本发明的锌指蛋白是由三个锌指单元组装而成，其组装过程是以一条合成的模 板锌指蛋白的DNA序列为模板，通过聚合酶链式反应方法分别获得三个锌指单元，通过锌指单元间的重叠聚合酶链式反应扩增获得锌指蛋白，模板锌指蛋白的DNA序列为CCCCACGAGAGACCTTTCCAGTGCAGGATCTGTATGCGGAACTTCAGCCGCCAACAGAAGCTGGACACCCACACAAGGACCCATACTGGCGAAAAGCCCTTTCAATGTCGGATTTGCATGCGCAACTTTTCCCTCAGCCAGACACTGAAGAGGCACCTCCGGACACACACCGGAGAGAAACCATTCCAGTGTAGAATCTGCATGAGGAATTTCTCTCGCATGGACCACCTGGCCGGCCATCTGAGAACCCAT。本发明的转录激活结构域是转录因子p65或VP16的转录激活结构域。本发明的嵌合型转录因子在核定位信号的5丨端、核定位信号和锌指蛋白间、转录激活结构域的3 '端之中的任意一个位置插入检测标签，检测标签从Flag、HA、His、myc的任意一种中选择。本发明的锌指蛋白靶序列包含2-12次重复。本发明的启动子核心元件是miniCMV或TAL minipromoter ；miniCMV 的 DNA 序列是GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA ；TAL minipromoter 的 DNA 序列是GCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAG。本发明的报告基因是荧光素酶、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、β半乳糖苷酶中的任意一种。本发明的哺乳动物细胞是册1(293、2931\抱1&、现7、[!13了3中的任意一种。本发明弥补上述方法的不足，建立了一种方便高效的锌指蛋白快速筛选方法，它具有以下特征1)由于在锌指蛋白检测载体中插入了多个锌指蛋白靶序列，使得报告基因的表达达到放大，因此该方法更加敏感；2)筛选过程在哺乳动物细胞内进行，使得筛选的结果更加可靠；3)该筛选方法对设备、材料的要求很低，采用了小型的锌指蛋白库，成本大大降低，使得大多数实验室都能够进行。为锌指蛋白的广泛推广应用提供了基础。
图I是锌指蛋白的组装模式图。图2是由锌指蛋白和转录激活结构域组成的嵌合型转录因子结构示意图。
图3是锋指蛋白检测载体结构意图。图4是用7次重复的靶序列筛选针对hPGRN左侧锌指蛋白的实验结果。图5是用7次重复的靶序列筛选针对hPGRN右侧锌指蛋白的实验结果。图6是用12次重复的靶序列筛选针对hrai33锌指蛋白的实验结果。图7是靶向hPGRN的锌指核酸酶活力检测的结果。图8是293-eGFP-hPGRN TSF细胞中突变的eGFP被纠正后的eGFP阳性细胞克隆。具体实施方案下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例I以筛选针对人PGRN的锌指蛋白，用于构建靶向人PGRN基因的锌指核酸酶为例，其步骤如下I、构建针对人PGRN的小型锌指蛋白库由于锌指核酸酶是成对存在，形成二聚体才能发挥作用，所以需要筛选一对锌指蛋白，两个锌指蛋白的结合位点分别位于靶基因互补的两条DNA链上，两个识别位点间间隔57个碱基，因此最终的靶序列是一段23-25bp长的DNA片段。在锌指协会(Zinc FingerConsortium)提供的在线锌指蛋白预测软件ZiFiT上提供了专门预测用于锌指核酸酶的成对锌指蛋白靶位点的服务。具体方法如下从NCBI上查找人PGRN的基因组序列NG_007886，通过在线锌指蛋白预测软件ZiFiT (http: //zifit. partners. orR/ZiFiT/ChoiceMenu. aspx)中的 CoDA 法下面的设计锌指核酸酶(Design Zinc Finger Nucleases)分析人PGRN基因中潜在的锌指蛋白结合位点。将人PGRN基因组序列输入到软件中，提交后可获得该序列中潜在的锌指蛋白作用位点；根据实验的具体需要选择若干个潜在靶位点做进一步的研究。本实施例选用一个靶位点GTCACCTTCCCTGAGTGGGCTGGT。该序列中存在两个相邻且反向的锌指蛋白结合位点，两个结合位点之间相隔6个碱基，分别是位于左侧的GAC GGT GAA和位于右侧的GGT GCT TGG ；将针对这两个结合位点的锌指分别称为ZFPL和ZFPR (ZFPL即针对左侧结合位点的锌指蛋白，ZFPR即针对右侧结合位点的锌指蛋白，每个锌指蛋白有三个锌指单元组成，每个锌指单元识别连续的三个碱基)。针对左侧结合位点的锌指单元称为LZF,针对右侧结合位点的锌指单元称为RZF。ZFPL由三个LZF组成，ZFPR由三个RZF组成。在选中的祀位点上点击相应的链接即可得到针对各祀位点的锌指单元。在本实施例中，分别需获得针对位于左侧的GAC GGT GAA和位于右侧的GGT GCT TGG的锌指单元。参照相邻组装法(CoDA),依据锌指单元的结合力由大到小选择锌指单元,针对每一个锌指蛋白结合位点组装出1-50锌指蛋白组成锌指蛋白库。详细的方法该软件的官方网站上有说明，在文献中也有详细的报道。在该步骤中也可采用ZiFiT软件中寡聚体库工程平台(OPEN)下的设计锌指核酸酶(Design Zinc Finger Nuclease)实施。所选择的锌指单元是针对GAC的(LZFI)PHERPFQCRICMRNFSEEANLRRHTRTH ；(LZF2)PHERPFQCRICMRNFSEESNLRRHTRTH ；
(LZF3)PHERPFQCRICMRNFSEQSNLRRHTRTH(LZF4)PHERPFQCRICMRNFSDRSNLTRHTRTH针对GGT的(LZF5)TGEKPFQCRICMRNFSLRHHLTRHLRTH针对GAA的 (LZF6)TGEKPFQCRICMRNFSQKANLTRHLRTH针对GGT的(RZFl)PHERPFQCRICMRNFSRQQKLDTHTRTH (RZF2)PHERPFQCRICMRNFSRRSRLDV HTRTH(RZF3)PHERPFQCRICMRNFSTTTKLAIHTRTH针对GCT的(RZF4)TGEKPFQCRICMRNFSLSQTLKRHLRTH(RZF5)TGEKPFQCRICMRNFSLSQTLNRHLRTH针对TGG的(RZF6)TGEKPFQCRICMRNFSRMDHLAGHLRTH
(RZF7)TGEKPFQCRICMRNFSRVDHLGGHLRTH依据相邻组装法获得针对左侧结合位点的四个锌指蛋白组成的锌指蛋白库ZFPLI:LZFl-LZF5-LZF6 ；ZFPL2:LZF2-LZF5-LZF6 ；ZFPL3:LZF3-LZF5-LZF6 ； ZFPL4:LZF4-LZF5-LZF6 ；用同样的方法可获得针对右侧结合位点的七个锌指蛋白组成的锌指蛋白库ZFPRl:RZF1-RZF4-RZF6 ；ZFPR2:RZF1-RZF-4RZF7 ；ZFPR3:RZF2-RZF4-RZF6 ；ZFPR4:RZF2-RZF4-RZF7 ；ZFPR5:RZF3-RZF4-RZF6 ； ZFPR6:RZF3-RZF4-RZF7 ；ZFPR7:RZF3-RZF5-RZF7 ；在锌指蛋白库的构建采用了聚合酶链式反应的方法，构建方法见图1，在图I中Fl, F2，F3分别代表三个锌指单元，每个锌指单元中的7KEY AA代表每个锌指单元中的关键氨基酸。首先合成一个全长的模板锌指蛋白的DNA序列(ZFT)，以此全长序列为模板用Pl/P4, P2/P5, P3/P6分别扩增三个锌指单元，通过重叠聚合酶链式反应将锌指单元间组合形成锌指蛋白库。 模板锌指蛋白(ZFT )的DNA序列为CCCCACGAGAGACCTTTCCAGTGCAGGATCTGTATGCGGAACTTCAGCCGCCAACAGAAGCTGGACACCCACACAAGGACCCATACTGGCGAAAAGCCCTTTCAATGTCGGATTTGCATGCGCAACTTTTCCCTCAGCCAGACACTGAAGAGGCACCTCCGGACACACACCGGAGAGAAACCATTCCAGTGTAGAATCTGCATGAGGAATTTCTCTCGCATGGACCACCTGGCCGGCCATCTGAGAACCCAT。根据上一步分析的锌指蛋白的氨基酸序列，以及哺乳动物中密码子偏爱性原则将氨基酸序列转换成DNA序列，并依据DNA序列合成引物。引物序列如下用于构建左侧锌指蛋白库的引物LPl Fl HindIII For:AAAGCTTCCCCACGAGAGACCTTTCCALP2 F2 For:CACACAAGGACCCATACTGGCGAA
LP3 F3 For: CACCTCCGGACACACACCGLP4 hPGRN LZFlreverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGTCTCCTCAGGTTGGCTTCCTCGCTGAAGTTCCGCATACALP5 hPGRN LZF2reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGTCTCCTCAGGTTGCTTTCCTCGCTGAAGTTCCGCATACALP6 hPGRN LZF3reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGTCTCCTCAGGTTGCTCTGCTCGCTGAAGTTCCGCATACALP7 hPGRN LZF4reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGCCTGGTCAGGTTGCTTCTGTCGCTGAAGTTCCGCATACA
LP8 hPGRN LZF5reverse:GGTGTGTGTCCGGAGGTGTCTTGTGAGATGGTGTCTCAGGGAAAAGTTGCGCATGCALP9 hPGRN LZF6BmaHI reverse:AGGATCCATGGGTTCTCAGATGCCTGGTCAGGTTGGCCTTCTGAGAGAAATTCCTCATGCA用于构建右侧锌指蛋白库的引物(RPl) Fl KpnI For:AGGTACCCCCCACGAGAGACCTTTCCA(RP2) F2 For:CACACAAGGACCCATACTGGCGAA(RP3) F3 For:CACCTCCGGACACACACCG(RP4) hPGRN RZFlreverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGGGTGTCCAGCTTCTGTTGGCGGCTGAAGTTCCGCATACA(RP5) hPGRN RZF2reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGCACGTCCAGTCTGCTCCTTCTGCTGAAGTTCCGCATACA(RP6) hPGRN RZF3reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGGATGGCCAGCTTAGTTGTGGTGCTGAAGTTCCGCATACA(RP7) hPGRN RZF4reverse:GGTGTGTGTCCGGAGGTGCCTCTTCAGTGTCTGGCTGAGGGAAAAGTTGCGCATGCA(RP8) hPGRN RZF5reverse:GGTGTGTGTCCGGAGGTGCCTGTTCAGTGTCTGGCTGAGGGAAAAGTTGCGCATGCA(RP9) hPGRN RZF6XhoI reverse:ACTCGAGATGGGTTCTCAGATGGCCGGCCAGGTGGTCCATGCGAGAGAAATTCCTCATGCA(RPlO) hPGRN RZF7XhoI reverse:ACTCGAGATGGGTTCTCAGATGGCCCCCCAGGTGGTCCACGCGAGAGAAATTCCTCATGCA以全长的模板锌指蛋白序列(ZFT)为模板，用LP1/LP4，LP1/LP5，LP1/LP6，LP1/LP7, LP2/LP8, LP3/LP9 分别进行聚合酶链式反应获得 LZF1，LZF2, LZF3, LZF4, LZF5, LZF6。用 RP1/RP4, RP1/RP5, RP1/RP6, RP2/RP7, RP2/RP8, RP3/RP9, RP3/RP10 分别进行聚合酶链式反应获得RZF1，RZF2, RZF3, RZF4, RZF5, RZF6, RZF7。聚合酶链式反应扩增条件是94°C、30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C、15秒，28个循环。聚合酶链式反应产物经质量浓度为2. 0%的琼脂糖电泳后回片段即获得所有的锌指单元DNA片段。将锌指单元DNA片段按照上述的组合方式进行重叠聚合酶链式反应组装锌指蛋白，获得ZFPL1，ZFPL2，ZFPL3，ZFPL4, ZFPRl, ZFPR2, ZFPR3, ZFPR4, ZFPR5, ZFPR6, ZFPR7。聚合酶链式反应扩增条件是94°C >30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C >20秒，30个循环。聚合酶链式反应产物经质量浓度为2. 0%的琼脂糖电泳后回片段即获得所有的锌指蛋白DNA片段。将重叠聚合酶链式反应获得锌指蛋白片段与pGEMT-T easy载体连接。连接条件是2 μ I酶切纯化片段，I μ I10 X Τ4连接酶缓冲液，O. 5μ I T载体，O. 5μ I Τ4连接酶，6 μ I三蒸水，16°C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆分别命名为pGEMT/hPGRN ZFPL I, pGEMT/hPGRN ZFPL2, pGEMT/hPGRN ZFPL3, pGEMT/hPGRN ZFPL4, pGEMT/hPGRN ZFPR1, pGEMT/hPGRN ZFPR2,pGEMT/hPGRN ZFPR3, pGEMT/hPGRN ZFPR4, pGEMT/hPGRNZFPR5, pGEMT/hPGRN ZFPR6, pGEMT/hPGRN ZFPR7。至此获得了针对人 PGRN 基因组DNA序列上两个相邻锌指蛋白结合位点的锌指蛋白库。同时在左侧的锌指蛋白两端引物了HindIII和SalI位点，在右侧的锌指蛋白两端引入KpnI和BamHI位点，为后面的嵌合型转录因子的构建提供了基础。2、构建嵌合型转录因子和人PGRN锌指蛋白检测载体 (I)核定位信号和检测标签的合成在左右侧锌指蛋白组装的嵌合型转录因子的核定位信号和锌指蛋白间插入不同的检测标签，分别是左侧Flag标签，右侧HA标签，左侧和右侧的检测标签也可相互替换。在上海生工全长合成左侧和右侧的核定位信号和检测标签，DNA序列是左侧ATcGAtATGGCACCAAAGAAAAAGCGGAAGGTAGATTACAAAGATCATGATGGCGATTACAAGGACCACGATATCGACTACAAAGATGACGATGATAAGAAGCTTAAGCTT ；右侧GAATTCATGGCGCCCAAGAAGAAACGAAAGGTCTATCCTTACGATGTGCCAGACTACGCCGGGTATCCATATGATGTGCCTGACTATGCCGGAGCTATCCCTATGACGTGCCCGATTATGCAGCTCACGGTACC同时在左侧核定位信号和检测标签的两端引入了 ClaI和HindIII位点，在右侧核定位信号和检测标签的两端引入了 EcoRI和KpnI位点。(2)转录因子P65的转录激活结构域的克隆根据转录因子P65的转录激活结构域P65AD的DNA序列设计并合成下列引物，由于左侧和右侧的锌指蛋白两端引入了不同的酶切位点，分别克隆了两种不同酶切位点的P65AD，分别命名为p65ADL和p65ADR。其中P1/P2扩增的p65ADL引入了 XhoI-XbaI位点，P3/P4 扩增的 p65ADR 引入了 BamHI-SpeI 位点Plp65ADL XhoI For ACTCGAGGGAGGTGGATCTTACCTGCCAGATACAGACGAT ；P2:p65ADL XbaI back ATCTAGATTACTGACTCAGCAGGGCT ；P3:p65ADR BamHI For AGGATCCTACCTGCCAGATACAGACGAT ；P4:p65ADR Spe I back AACTAGTTCACTGACTCAGCAGGGCT ；以cDNA文库为模板，上面合成的P1/P2、P3/P4引物分别扩增p65ADL和p65ADR。聚合酶链式反应扩增条件是94°C、30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C、15秒，28个循环。聚合酶链式反应产物经质量浓度为I. 0%的琼脂糖电泳后回片段即获得P65ADL和p65ADR。将聚合酶链式反应获得DNA片段与pGEMTT easy载体连接。连接条件是2 μ I酶切纯化片段，Ιμ 10 X Τ4连接酶缓冲液，O. 5μ I T载体，O. 5μ I 了4连接酶，6 4 1三蒸水，161连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，分别命名为pGEMT/p65ADL和pGEMT/p65ADR。(3)嵌合型转录因子的构建将合成的左侧核定位信号和检测标签的DNA片段NLS-FLAG用ClaI和HindIII酶切并回收片段，与ClaI和HindIII酶切的SB1625载体连接(SB1625载体是在pcDNA3. I (+)的基础上插入了通过NheI和ApaI位点插入新的多克隆位点=Nhel-ClaI-HindIII-XhoI-Xbal-EcoRl-KpnI-BamHI-SpeI-ApaI,该多克隆位点的 DNA 序列为gctagcttatcgataagcttctcgagtctagaagaattccggtacctggatccaactagtgggccc,该序列由上海生工合成)。连接条件是2 μ I酶切纯化片段，1μ I 10 X Τ4连接酶缓冲液，1μ I酶切载体，O. 5μ I Τ4连接酶，5. 5μ I三蒸水。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命 名为SB1625/NLS-FLAG。将pGEMT/p65ADL用XhoI和XbaI酶切并回收片段与经同样酶切处理的SB1625/NLS-FLAG载体连接，连接条件同上。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为SB1625/NLS-FLAG/p65ADL。将左侧锌指蛋白库中的所有锌指蛋白用HindIII和XhoI酶切并回收片段与经同样酶切处理的SB1625/NLS-FLAG/P65ADL载体连接，连接条件同上，连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，分别命名为SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPLl ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPL2 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPL3 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPL4。至此获得所有左侧锌指蛋白和p65转录激活结构域组成的嵌合型转录因子。采用同样的方法，将合成的右侧核定位信号和检测标签的DNA片段NLS-HA用EcoRI和KpnI酶切，与经过同样酶切处理的SB1625载体连接，获得SB1625/NLS-HA。将pGEMT/p65ADR用BamHI和SpeI酶切并回收片段与经同样酶切处理的SB1625/NLS-HA载体连接，获得SB1625/NLS-HA/p65ADR。将所有右侧的锌指蛋白用KpnI和BamHI酶切，与经过同样酶切处理的SB1625/NLS-HA/p65ADR载体连接，能够获得所有右侧锌指蛋白和p65转录激活结构域组成的嵌合型转录因子，分别命名为SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPRl ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRNZFPR2 ;SB1625/NLS_HA/p65ADR/hPGRN ZFPR3 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR4 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR5 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR6 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR7。嵌合型转录因子的结构见图2。(4) miniCMV 的克隆依据miniCMV的序列合成以下引物Pl miniCMV Flfor AGGTACCAATCGATTTAGATCTGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGP2 miniCMV F2reverse CACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGGCCTCCCACCGTACACGCCP3 miniCMV F3reverse TAAGCTTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCT
用Pl，P2，P3三条引物进行重叠聚合酶链式反应，聚合酶链式反应扩增条件是940C >30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C、10秒，28个循环。产物经质量浓度为2. 0%的琼脂糖电泳后回片段即获得miniCMV片段。将聚合酶链式反应获得DNA片段与pGEMT_T easy载体连接，连接条件同上。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pGEMT/miniCMV。(5 )人hPGRN锌指蛋白靶序列的合成根据在线锌指蛋白预测软件ZiFiT预测得到的锌指蛋白靶序列GTCACCTTCCCTGAGTGGGCTGGT (即hPGRN TSF)合成四条互补的寡核苷酸序列，分别是Pl hPGRN TSF KXBL for cagtcaccttccctgagtgggctggtactcgagtta ；P2 hPGRN TSF KXBL reverse gatctaactcgagtaccagcccactcagggaaggtgactggtac ； P3 hPGRN TSF SBBL for tcgacagtcaccttccctgagtgggctggtactcgaggatcca ；P4 hPGRN TSF SBBL reverse gatctggatcctcgagtaccagcccactcagggaaggtgactg ;将Pl和P2各取15μ I于25°C退火，获得命名为hPGRN TSF KXBL的片段；将P3和P4各取15μ I于25°C退火，获得命名为hPGRN TSF SBBL片段。(6)构建人PGRN锌指蛋白检测载体将pGEMT/miniCMV用KpnI和HindIII酶切后与经同样酶切处理的pGL4载体连接(pGL4载体购买自Promega公司，在pGL4载体中已经插入了萤火虫突光素酶报告基因，该报告基因也可为绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白，β_半乳糖苷酶中的一种)，连接条件同上。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pGL4/miniCMV。将pGL4/miniCMV载体用KpnI和BglII酶切后与hPGRN TSF KBL连接，连接条件同上。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pGL4/hPGRNl X TSF/miniCMV。将 pGL4/hPGRNl X TSF/miniCMV 载体用 XhoI 和 BglII 酶切后与hPGRN TSF SBBL连接，连接条件同上。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pGL4/hPGRN2XTSF/miniCMV。以同样的方式重复连接hPGRN TSFSBBL可以获得pGL4/hPGRN 7XTSF/miniCMV。也可以同样的方式重复的连接hPGRN TSFSBBL可以获得pGL4/hPGRN 12 X TSF/miniCMV。获得了人PGRN锌指蛋白检测载体，其结构见图3。3、在哺乳动物细胞HEK293中筛选人PGRN锌指蛋白将嵌合型转录因子和锌指蛋白检测载体共转染到HEK293细胞内，通过嵌合型转录因子结合于嵌合型启动子驱动下游荧光素酶报告基因的表达，通过检测荧光素酶报告基因的荧光强度来检测锌指蛋白对靶序列的结合能力，得到所需的锌指蛋白。实验前一天将293细胞以IXlO5的密度接种于24孔板。实验当天，用脂质体的方法将表达嵌合型转录因子的载体SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPLl ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hPGRNZFPL2 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPL3 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPL4 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPRl ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR2 ;SB1625/NLS_HA/p65ADR/hPGRN ZFPR3 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR4 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR5 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR6 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR7 ;分别与人 PGRN 锌指蛋白检测载体pGL4/hPGRN 7 X TSF/miniCMV和内参pRL-CMV (Promega公司购买，货号E2261)共转染到之前铺好的293细胞中，pRL-CMV (携带海蜃荧光素酶)共转染。并设置阴性对照组(以SB1625载体替代实验组的表达嵌合型转录因子的载体)转染条件表达嵌合型转录因子系列载体O. 5 μ g，锌指蛋白检测载体O. 4 μ g，内参载体O. 3 μ g加入到50 μ IOpti-MEM培养基，脂质体2 μ I加入到50 μ I Opti-MEM培养基，分别混匀，室温作用5分钟；然后将融有DNA的Opti-MEM加入到50 μ I的融有脂质体的Opti-MEM中，混匀，室温作用20分钟；将混合液分别加入到24孔板中。48小时后用Promega的Dual-Iuciferasedetectionkit (货号E1910)收取细胞蛋白并用GLO MAX 20/20生物发光检测仪(Promega公司)检测荧光素酶的荧光强度。分别测出实验组和对照组萤火虫荧光素酶活性和海蜃荧光素酶活性，算出实验组和对照组萤火虫荧光素酶活性与海蜃荧光素酶活性的比值，然后用实验组的比值除以对照组的比值，算出实验组荧光素酶活性是对照组的多少倍。结果见图4和图5。该步骤中用于转染的哺乳动物细胞也可选择293T、Hela、U87、NIH3T3的一种。在图4和图5中，横坐标代表我们克隆的人PGRN的锌指蛋白，纵坐标代表实验组 的荧光素酶活性与对照组荧光素没活性的比值。由图4可见，所筛选的四个锌指蛋白活性均高出对照组活性5倍，因此ZFPLl、ZFPL2、ZFPL3、ZFPL4都是具有特异性结合能力的有效锌指蛋白。由图5可见，所筛选的右侧7个锌指中ZFPRl、ZFPR2、ZFPR5、ZFPR6、ZFPR7活性高出对照组5倍，因此ZFPRl、ZFPR2、ZFPR5、ZFPR6、ZFPR7是具有特异性结合能力的有效锌指蛋白。实施例2以针对人PGRN的锌指蛋白的筛选为例，其步骤如下在实施例I的核定位信号和检测标签的合成步骤2- (I)中，在左右侧锌指蛋白组装成的嵌合型转录因子的核定位信号的5 '端加入了不同的检测标签，分别是左侧His标签，右侧myc标签，左侧和右侧的检测标签也可相互替换。在上海生工全长合成了左侧和右侧的核定位信号和检测标签，其序列是左侧ATCGATATGCACCATCACCACCATCACGCACCAAAGAAAAAGCGGAAGGTAGATTACAAAGATCATGATGGCGATTACAAGGACCACGATATCAAGCTT右侧GAATTCATGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGGCGCCCAAGAAGAAACGAAAGGTCTATCCTTACGATGTGCCAGACTACGCCGGGTATCCATATGATGTGCCTGACTATGCCGGCAGCGAGGGTACC在该步骤的转录激活结构域VP16的克隆2- (2)中，依据VP16的序列设计引物，以已经有的pVP16(购买自Clontech公司)为模板，通过聚合酶链式反应在VP16基因的两端分别引入两组酶切位点XhoI-XbaI和BamHI-SpeI，获得两个片段VP16L和VP16R。引物序列如下PlVP16L XhoI For ACTCGAGACCGCCCCCATTACCG ；P2:VP16L XbaI back ATCTAGATTACCCCCCAAAGTCGTC ；P3:VP16R BamHI For AGGATCCACCGCCCCCATTACCG ；P4:VP16R SpeI back AACTAGTTTACCCCCCAAAGTCGTC ；
以pVP16为模板，分别用引物P1/P2，P3/P4通过聚合酶链式反应获得VP16L和VP16R。聚合酶链式反应扩增条件是94°C、30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C >20秒，28个循环。聚合酶链式反应产物经质量浓度为1.0%的琼脂糖电泳后回片段即获得VP16L和VP16R。将聚合酶链式反应获得DNA片段与pGEMT-T easy载体连接。连接条件是2 μ I酶切纯化片段，1μ I 10 X Τ4连接酶缓冲液，O. 5μ I T载体，O. 5μ I Τ4连接酶，6 μ I三蒸水，16°C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5a细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，分别命名为pGEMT/VP16L 和 pGEMT/VP16R。在该步骤的TAL minipromoter 的克隆步骤 2- (4)中，依据 TAL minipromoter的序列合成以下引物Pl TAL minipromoter Fl for:AGGTACCGCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGG P2 TAL minipromoter Fl reverse:TATATTTGCATGTCTTTAGTTCTATGATGACACAAACCCCGCCCAGCGTCTTGTCATTGP3 TAL minipromoter F2 for:TAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCMACGCGAGCAACGGGCCP4 TAL minipromoter F2 reverse:AAAGCTTCTGCTTCATCCCCGTGGCCCGTTGCTCGCGTTT用Pl，P2两条引物进行聚合酶链式反应，聚合酶链式反应扩增条件是94°C、30秒，98°C、10秒，550C、15秒，72°C、10秒，28个循环。产物经质量浓度为2. 0%的琼脂糖电泳后回片段即获得TAL minipromoter Fl片段；用P3, P4两条引物进行聚合酶链式反应，条件同上可以获得TAL minipromoter F2片段。用Fl,F2两个片段进行重叠聚合酶链式反应，聚合酶链式反应扩增条件是94°C、30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C >20秒，30个循环。产物经质量浓度为2.0%的琼脂糖电泳后回片段即获得TAL minipiOmoter片段。将重叠聚合酶链式反应获得DNA片段与pGEMT-T easy载体连接，连接条件同上。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pGEMT/TAL minipromoter。其它步骤与实施例I相同，筛选出锌指蛋白。实施例3在实施例I的核定位信号合成步骤2-(1)中，在上海生工全长合成了核定位信号，其序列是左侧ATcGAtATGGCACCAAAGAAAAAGCGGAAGGTAGATTACAAAGATCATGATGGCGATTACAAGGACCACGATATCAAGCTT ；右侧GAATTCATGGCGCCCAAGAAGAAACGAAAGGTCTATCCTTACGATGTGCCAGACTACGCCGGGTATCCATATGATGTGCCTGACTATGCCGGAGCGGTACC同时在左侧核定位信号的两端引入了 ClaI和Hindi 11位点，在右侧核定位信号的两端引入了 EcoRI和KpnI位点。
在转录因子p65的转录激活结构域p65AD的克隆步骤2_ (2)中，根据p65AD的DNA序列设计并合成下列引物，由于左侧和右侧的锌指蛋白两端引入了不同的酶切位点，分别克隆了两种不同酶切位点的P65AD，分别命名为p65ADL和p65ADR。其中P1/P2扩增的P65ADL引入了 XhoI-XbaI位点，P3/P4扩增的p65ADR引入了 BamHI-SpeI位点，同时通过引物分别在左侧和右侧P65AD的3 '端引入了 Flag标签和HA标签。引入序列如下Plp65ADL XhoI For ACTCGAGGGAGGTGGATCTTACCTGCCAGATACAGACGAT ；P2:p65ADL Flag XbaI backATCTAGATTAAAGCTTCTTATCATCGTCATCTTTGTAGTCCTGACTCAGCAGGGCT ；P3:p65ADR BamHI For AGGATCCTACCTGCCAGATACAGACGAT ；
P4:p65ADRHA SpeI backAACTAGTTCAGTGAGCTGCATAATCGGGCACGTCATAGGGATACTGACTCAGCAGGGCT ；以cDNA文库为模板，上面合成的引物分别扩增p65ADL-Flag和p65ADR_HA。聚合酶链式反应扩增条件是94°C、30秒，98°C、10秒，55°C>15秒，72°C>15秒，28个循环。聚合酶链式反应产物经质量浓度为1.0%的琼脂糖电泳后回片段即获得p65ADL-Flag和P65ADR-HA。将聚合酶链式反应获得DNA片段与pGEMT-T easy载体连接。连接条件是2μ I酶切纯化片段，1μ I 10 X Τ4连接酶缓冲液，O. 5μ I T载体，O. 5μ I Τ4连接酶，6 μ I三蒸水，16°C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，分别命名为pGEMT/p65ADLFlag 和 pGEMT/p65ADR_HA。其它步骤与实施例I相同，筛选出锌指蛋白。实施例4以针对人CD133的锌指蛋白，用于构建人工转录抑制因子为例，其步骤如下在本实施例中，设计的锌指蛋白用于和转录抑制因子KRAB组合形成人工转录抑制因子，因此只需筛选靶向一个靶序列的锌指蛋白。I、构建针对人⑶133的小型锌指蛋白库从NCBI上查找人⑶133的基因组序列NG_011696，通过在线锌指蛋白预测软件ZiFiT (http: //zifit. partners. orR/ZiFiT/Disclaimer. aspx)中的 OPEN 法下面的设计锌指阵列(Design Zinc Finger Arrays)可获得人⑶133基因组DNA中潜在的锌指蛋白结合位点GGA GCC GAG。通过选中的靶位点上的链接进入对应的锌指单元库，依据结合能力选择1-50个锌指蛋白组成锌指蛋白库。详细的方法该软件的官方网站上有说明，在文献中也有详细的报道。在该步骤中也可采用相邻组装法平台(CoDA)下面的设计锌指阵列实施。所选择的锌指单元是针对GAG的(ZFl)PHERPFQCRICMRNFSRQSNLARHTRTH(ZF2)PHERPFQCRICMRNFSRMSNLDRHTRTH(ZF3)PHERPFQCRICMRNFSRHSNLTRHTRTH(ZF4)PHERPFQCRICMRNFSRASNLTRHTRTH针对GCC的
(ZF5)TGEKPFQCRICMRNFSDRTTLKRHLRTH针对GGA的(ZF6)TGEKPFQCRICMRNFSQTTHLRRHLRTH(ZF7)TGEKPFQCRICMRNFSQSQHLKRHLRTH(ZF8)TGEKPFQCRICMRNFSQTTHLSRHLRTH与靶位点中不同碱基特异性结合的锌指单元分别随机的组合可以获得12个锌指蛋白组成的锌指蛋白库ZFP1:ZF1-ZF5-ZF6 ZFP2:ZF1-ZF5-ZF7 ZFP3:ZF1-ZF5-ZF8ZFP4:ZF2-ZF5-ZF6 ZFP5:ZF2-ZF5-ZF7 ZFP6:ZF2-ZF5-ZF8 ZFP7:ZF3-ZF5-ZF6 ZFP8:ZF3-ZF5-ZF7 ZFP9:ZF3-ZF5-ZF8ZFPlO:ZF4-ZF5-ZF6 ZFPll:ZF4_ZF5_ZF7 ZFP12:ZF4-ZF5-ZF8根据上一步分析得到的锌指蛋白的氨基酸序列，以及哺乳动物中密码子偏爱性原则，将氨基酸序列转换成DNA序列，并依据DNA序列合成引物。引物序列如下hCD133 ZFl reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTG TCTGGCCAGGTTGCTCTGTCT GCTGAAGTTCCGCATACAhCD133 ZF2 reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTG TCTGTCCAGGTTGCTCATTCT GCTGAAGTTCCGCATACAhCD133 ZF3 reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTG TCTGGTCAGGTTGCTGTGTCT GCTGAAGTTCCGCATACAhCD133 ZF4 reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTG TCTGGTCAGGTTGCTGGCTCT GCTGAAGTTCCGCATACAhCD133 ZF5 reverse:GGTGTGTGTCCGGAGGTG TCTCTTCAGGGTGGTTCTGTC GGAAAAGTTGCGCATGCAhCD133 ZF6 Sail reverse:AGTCGACATGGGTTCTCAGATG TCTTCTCAGGTGGGTGGTCTG AGAGAAATTCCTCATGCAhCD133 ZF7 Sail reverse:AGTCGACATGGGTTCTCAGATG TCTCTTCAGGTGCTGGCTCTG AGAGAAATTCCTCATGCAhCD133 ZF8 Sail reverse:AGTCGACATGGGTTCTCAGATG TCTGCTCAGGTGGGTGGTCTG AGAGAAATTCCTCATGCA采用同实施例I相同的方法，即可获得了针对人⑶133基因组DNA序列上潜在锌指蛋白结合位点的锌指蛋白库。pGEMT/hCD133 ZFP1，pGEMT/hCD133 ZFP2, pGEMT/hCD133 ZFP3, pGEMT/hCD133ZFP4, pGEMT/hCD133 ZFP5, pGEMT/hCD133 ZFP6, pGEMT/hCD133ZFP7, pGEMT/hCD133 ZFP8, pGEMT/hCD133 ZFP9, pGEMT/hCD133 ZFP10, pGEMT/hCD133ZFPll，pGEMT/h⑶133 ZFP12。同时在锌指蛋白两端引入了 HindIII和Sail位点，为后面的嵌合型转录因子的构建提供了基础。2、构建嵌合型转录因子和人CD133锌指蛋白检测载体(I)将锌指蛋白库中的所有锌指蛋白用HindIII和SalII酶切并回收片段与经HindIII和XhoI酶切处理的SB1625/NLS-FLAG/p65ADL载体连接，连接条件同上，连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，分别命名为SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFPl ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP2 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP3 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP4 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP5 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP6 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP7 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP8 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP9 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFPlO ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFPll ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP12。嵌合型转录因子的结构见图2。(2)人⑶133锌指蛋白靶序列的合成根据在线锌指蛋白预测软件ZiFiT预测得到的锌指蛋白靶序列GGA GCC GAG合成四条互补的寡核苷酸序列，分别是Pl hCD133 TSF KBL for:CctcggctccCTCGAGTTAP2 hCD133 TSF KBL reverse: GATCTAACTCGAGggagccgagGGTACP3 hCD133 TSF SBBL for:TCGACctcggctccCTCGAGGGATCCAP4 hCD133 TSF SBBL reverse:GATCTGGATCCCTCGAGggagccgagG将Pl和P2各取15 μ I于25°C退火，获得hCD133 TSF KBL片段，将P3和P4各取15μ I 于 25°C退火，获得 hCD133 TSF SBBL 片段。(3)人⑶133锌指蛋白检测载体的构建采用与实施例I相同的方法可获得人CD133锌指蛋白检测载体pGL4/hCD13312XTSF/miniCMV 其结构见图 3。3、在哺乳动物细胞293T中筛选人⑶133锌指蛋白采用同实施例I相同的方法将表达嵌合型转录因子的载体SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133ZFPl ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP2 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP3 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP4 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP5 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP6 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133ZFP7 ;SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP8 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP9 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP10 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFPll ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP12 ；分别与人 CD 133 锌指蛋白检测载体 pGL4/h⑶13312 X TSF/miniCMV和内参pRL-CMV共转染到之前铺好的293T细胞中；并且设置阴性对照 SB1625，pGL4/hCD13312XTSF/miniCMV，pRL-CMV 共转染。转染条件同实施例 1，48 小时后采用同实施例I相同的方法检测荧光素酶的活性，结果见图6。在图6中，横坐标代表我们克隆的人CD133的锌指蛋白，纵坐标代表所测的实验组的萤火虫荧光素酶活性与对照组的比值。该步骤中用于转染的哺乳动物细胞也可选择HEK293，也可选择Hela，也可选择U87，还可选择NIH3T3中的一种。由图6可见，在筛选的10个锌指蛋白中，有7个锌指蛋白的的萤火虫荧光素酶活性高于对照组 5 倍，因此 hCD133 ZFP2，hCD133 ZFP3, hCD133 ZFP4, hCD133 ZFP5, hCD133ZFP5，hCD133 ZFP6, hCD133 ZFP8, hCD133 ZFP9 为合格的锌指蛋白。
实施例5以针对人CD133的锌指蛋白，用于构建人工转录抑制因子为例，其步骤如下从NCBI上查找人⑶133的基因组序列NG011696，通过在线锌指蛋白预测软件ZiF-Predict (http://web. iitd. ac. in/ sundar/zifpredict/zifpred home, html)可获得人⑶133基因组DNA中潜在的锌指蛋白结合位点GGA GCC GAG。通过选中的靶位点上的链接进入对应的锌指单元库，依据结合能力选择1-50个锌指蛋白组成锌指蛋白库。详细的方法该软件的官方网站上有说明，在文献中也有详细的报道。其它步骤与实施例4相同，可获得锌指蛋白。实施例6以筛选针对人PGRN的锌指蛋白，用于构建靶向人PGRN基因的锌指核酸酶为例，其步骤如下
从NCBI上查找人PGRN的基因组序列NG 007886，通过在线锌指蛋白预测软件ToolGen (http://toolgen. co. kr/ZFNfinder/sws. cgi)分析人 PGRN 基因中潜在的锋指蛋白结合位点和相应的锌指蛋白。其它步骤与实施例I相同，获得锌指蛋白。实施例7 筛选靶向hPGRN的锌指核酸酶将实施例I中筛选获得的靶向hPGRN的锌指蛋白与FokI组合构建成靶向hPGRN的锌指核酸酶，用于实现对hPGRN基因的高效的基因打靶。具体步骤如下(I)FokI切割结构与的克隆根据已经报道的FokI两种突变体的序列在上海生工合成FokI的两种突变体FokIDD 和 FokIRR (Szcz印ek 等，PMID: 17603476)。同时在 FokI DD 的两端引入 XhoI 和 XbaI位点，在FokI RR的两端引入BamHI和SpeI位点。将FokI DD用Xhol/Xbal酶切与经过同样酶切处理的 SB1625/NLS-FLAG 连接，获得 SB1625/NLS_FLAG/FokI DD。将 FokI RR 用BamHI/Spel酶切，之后与经过同样酶切处理的SB1625/NLS-HA连接，获得SB1625/NLS-HA/FokI RR。连接、转化、质粒提取条件与实施例I相同。FokI DD 的 DNA 序列如下CAGCTGGTTAAATCCGAGTTGGAAGAGAAAAAGTCTGAGCTCCGCCATAAGTTGAAATACGTGCCTCACGAGTATATCGAACTGATCGAGATCGCCAGAAACTCAACCCAAGACAGGATTTTGGAAATGAAAGTGATGGAGTTCTTTATGAAGGTCTATGGCTATAGGGGAAAGCACCTCGGCGGGAGCAGGAAGCCCGACGGCGCCATTTATACAGTCGGGTCTCCAATCGACTATGGGGTCATCGTTGACACTAAGGCCTATTCCGGGGGTTACAACCTCCCAATAGGGCAGGCTGACGAGATGCAGGACTACGTGGAGGAGAACCAAACAAGGAACAAGCATATAAACCCTAACGAGTGGTGGAAAGTATACCCTAGTTCTGTTACTGAGTTCAAGTTTCTCTTCGTGAGCGGACACTTCAAAGGAAATTACAAAGCTCAACTGACAAGACTGAATCATATTACTAACTGTAATGGTGCCGTCCTGTCAGTGGAGGAACTGCTGATTGGCGGAGAGATGATCAAGGCAGGCACCCTTACTCTCGAAGAAGTGCGGCGAAAGTTTAATAACGGTGAAATCAACTTCTGAFokI RR 的 DNA 序列如下CAGTTGGTGAAATCCGAGCTGGAGGAGAAAAAGTCAGAGCTGCGCCACAAACTCAAGTACGTGCCACACGAATACATTGAGCTGATCGAGATCGCCAGGAACTCCACGCAGGACAGAATCCTeGAGATGAAGGTAATGGAATTTTTCATGAAGGTGTACGGCTACAGAGGCAAGCATCTGGGAGGGTCCCGCAAGCCTGATGGAGCAATCTACACCGTCGGAAGCCCCATaGATTACGGGGTAATCGTCGATACCAAAGCATATAGTGGCGGATACAACCTGCCAATCGGCCAAGCCCGGGAAATGCAGCGATACGTGGAAGAAAACCAGACTAGGAACAAACACATTAACCCAAACGAATGGTGGAAAGTCTATCC
TAGCTCTGTGACGGAGTTCAAGTTTCTCTTTGTTTCCGGCCATTTCAAGGGGAATTACAAGGCTCAGCTGACAAGGC
TGAATCATATTACTAATTGTAACGGGGCCGTTCTCTCAGTGGAAGAGCTGCTGATTGGCGGAGAGATGATTAAAGCC
GGCACCCTTACCCTGGAAGAGGTTCGGCGGAAATTCAACAATGGCGAGATAAACTTTTGA(2)靶向hPGRN的锌指核酸酶的构建从实施例I中选取符合标准的锌指蛋白，左侧和右侧各一个，分别是hPGRN ZFPL2和hPGRNZFPR6。将pGEMT/hPGRN ZFPL2用XhoI和XbaI酶切，与经过同样酶切处理的SB1625/NLS-FLAG/FokIDD载体连接。连接条件是2 μ I酶切纯化片段，I μ 110ΧΤ4连接酶缓冲液，1μ I酶切载体，O. 5μ 1Τ4连接酶，5. 5μ I三蒸水。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为SB1625/NLS-FLAG/hPGRN ZFPL2_FokI DD。
将pGEMT/hPGRN ZFPR6用BamHI和SpeI酶切，与经过同样酶切处理的SB1625/NLS-HA/FokI RR载体连接。连接条件是'2 μ I酶切纯化片段，I μ I 10ΧΤ4连接酶缓冲液，Ιμ 酶切载体，O. 5μ1 Τ4连接酶，5. 5μ I三蒸水。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为SB1625/NLS-HA/hPGRN ZFPR6_FokI RR。(3)靶向hPGRN的锌指核酸酶活力检测a)单拷贝细胞系的建立该方法通过商业化的Flp-in系统建立单拷贝细胞系，首先对该试剂盒提供的pcDNA5/FRT进行改造，通过该载体上的NheI和ApaI位点插入一段多克隆位点Nhel-ClaI-BamHI-XbaI-ApaI,序列如下gctagcatcgatggatcctctagagggccc,该序列由上海生工合成。将获得的载体命名为PCDNA5/FRTM。通过聚合酶链式反应扩增eGFP上下游两个片段，以引物P1/P2扩增上游片段eGFPup,同时在上游的两端引入ClaI和BamHI，以引物P3/P4扩增下游片段eGFP down，在下游片段的两端引入BamHI和Xbal，引物序列如下Pl eGFP up ClaII for:AATCGATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC ；P2 eGFP UP BamHI-KpnI reverse:AGGATCCTTGGTACCTTAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTP3eGFP down BamHI for:AGGATCCTTCAAGATCCGCCACAACATCP4eGFP down XbaI reverse:ATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG将上游和下游片段分别通过Clal/BamHI、BamHI/Xbal连入到pcDNA5/FRTM中，获得 pcDNA5/FRTM/eGFP up-down。将实施例 I 中的 hPGRN KXBL 片段与经过 KpnI 和 BamHI 酶切处理的 pcDNA5/FRTM/eGFP up-down 载体，获得 pcDNA5/FRTM/eGFP up-hPGRN TSF-down。将pOG44 载体(4yg)和 pcDNA5/FRTM/eGFP up-hPGRN TSF-down (8 μ g)共转染到 Flp-In -293cells (5X 105cells)中，转染 24h 后，加入 hygromycin 筛选,获得稳定表达突变型eGFP的单拷贝细胞系293-eGFPhPGRN TSF0b)打靶载体的构建通过聚合酶链式反应扩增eGFP基因，不包含起始密码子，引物序列如下PleGFP no ATG Sail for:GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG ；P2eGFP XbaI reverse:ATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG ；获得的片段命名为eGFPF，将eGFPF片段与pGEMT载体连接，转化，提取质粒并酶切鉴定测序，获得阳性克隆命名为pGEMT/eGFPF。将pGEMT/eGFPF用SalI和XbaI酶切与经过同样酶切处理的PUC19载体连接，转化，提取质粒，酶切鉴定获得阳性克隆pUC19/eGFPF。即打靶载体。c)锌指核酸酶活力的检测将pUC19/eGFPF(8 μ g)、SB1625/NLS_FLAG/hPGRN ZFPL2_FokI DD(2 μ g)、SB1625/NLS-HA/hPGRN ZFPR6_FokI RR(2 μ g)共转染到 293-eGFP-hPGRN TSF细胞系(5X 105cells)中。96小时后在荧光显微镜下统计eGFP阳性克隆的个数。同时将pUC19/eGFPF (8yg)单独转染到293-eGFP-hPGRN TS F细胞系(5X 105cells)中，96小时后统计eGFP阳性克隆数做为阴性对照。结果见图7。由图7可见，与单独转染pUC19/eGFPF的细胞相比，共转染pUC19/eGFPF和hPGRN锌指核酸酶的细胞中eGFP阳性克隆的数量显著增加，显示筛选的靶向hPGRN的锌指核酸酶具有良好的活性。图8显示了 eGFP阳性的细胞克隆。
权利要求
1.一种锌指蛋白的快速筛选方法，其特征在于它是由下述步骤组成 (1)构建小型锌指蛋白库 通过在线锌指蛋白预测软件预测锌指蛋白靶序列并组装锌指蛋白，选择1-50个锌指蛋白组成小型锌指蛋白库； (2)构建嵌合型转录因子和锌指蛋白检测载体 由N端的锌指蛋白和C端的转录激活结构域形成融合蛋白，在锌指蛋白的5 '端插入核定位信号，组装成嵌合型转录因子，由锌指蛋白靶序列和下游的启动子核心元件组成嵌合型启动子，在嵌合型启动子的下游插入报告基因组成锌指蛋白检测载体； (3)在哺乳动物细胞中筛选锌指蛋白 将嵌合型转录因子和锌指蛋白检测载体共转染到哺乳动物细胞内作为实验组，将锌指蛋白检测载体单独转染到哺乳动物细胞内作为对照组，实验组的报告基因表达强度高于或等于对照组5倍的是合格的锌指蛋白。
2.按照权利要求I所表述的锌指蛋白的快速筛选方法，其特征在于所述的锌指蛋白是由三个锌指单元组装而成，其组装过程是以一条合成的模板锌指蛋白的DNA序列为模板，通过聚合酶链式反应方法分别获得三个锌指单元，通过锌指单元间的重叠聚合酶链式反应扩增获得锌指蛋白，模板锌指蛋白的DNA序列为CCCCACGAGAGACCTTTCCAGTGCAGGATCTGTATGCGGAACTTCAGCCGCCAACAGAAGCTGGACACCCACACAAGGACCCATACTGGCGAAAAGCCCTTTCAATGTCGGATTTGCATGCGCAACTTTTCCCTCAGCCAGACACTGAAGAGGCACCTCCGGACACACACCGGAGAGAAACCATTCCAGTGTAGAATCTGCATGAGGAATTTCTCTCGCATGGACCACCTGGCCGGCCATCTGAGAACCCAT。
3.按照权利要求I所表述的锌指蛋白的快速筛选方法，其特征在于所述的转录激活结构域是转录因子P65或VP16的转录激活结构域。
4.按照权利要求I所表述的锌指蛋白的快速筛选方法，其特征在于所述的嵌合型转录因子在核定位信号的5'端、核定位信号和锌指蛋白间、转录激活结构域的3'端之中的任意一个位置插入检测标签，检测标签从Flag、HA、His、myc的任意一种中选择。
5.按照权利要求I所表述的锌指蛋白的快速筛选方法，其特征在于所述的锌指蛋白靶序列包含2-12次重复。
6.按照权利要求I所表述的锌指蛋白的快速筛选方法，其特征在于所述的启动子核心兀件是 miniCMV 或 TAL minipromoter ； miniCMV的DNA序列是GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA ；TAL minipromoter 的 DNA 序列是GCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAG。
7.按照权利要求I所表述的锌指蛋白的快速筛选方法，其特征在于所述的报告基因是荧光素酶、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、3 -半乳糖苷酶中的任意一种。
8.按照权利要求I或9所述的锌指蛋白的快速筛选方法，其特征在于所述的哺乳动物细胞是 HEK293、293T、Hela、U87、NIH3T3 中的任意一种。
全文摘要
一种锌指蛋白的快速筛选方法，通过在线锌指蛋白预测软件预测基因内潜在的锌指蛋白靶序列及相应的锌指，通过重叠聚合酶链式反应获得锌指蛋白库。将锌指蛋白与转录激活结构融合构建嵌合型转录因子，由锌指蛋白靶序列和启动子核心元件组成的嵌合型启动子及其下游的报告基因组成锌指蛋白检测载体；将表达嵌合型转录因子的载体和锌指蛋白检测载体共转染到哺乳动物细胞，进而通过报告基因表达的强弱反应锌指蛋白与靶序列的结合能力。
文档编号C12N15/63GK102850429SQ20121020795
公开日2013年1月2日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者夏海滨, 张伟锋 申请人:陕西师范大学