一种利用miR-152作为动脉粥样硬化血清标志物及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于分子生物医学【技术领域】的一种利用miR-152为标志物的动脉粥样硬化血清检测试剂盒及方法。本发明设计miR-152特异性的引物，采用定量PCR的方法检测正常人血清、动脉粥样硬化患者血清中miR-152的含量变化，含量显著降低为动脉粥样硬化患者血清。本发明的方法简单，迅速，灵敏，适用于检测患者是否患有动脉粥样硬化。
【专利说明】—种利用miR-152作为动脉粥样硬化血清标志物及检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物医学【技术领域】，具体涉及一种利用miR-152作为动脉粥样硬化血清标志物及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是严重威胁人类生命的常见病之一。大多见于体循环系统的大型肌弹力型动脉，如主动脉，和中型肌弹力型动脉，如冠状动脉、脑动脉。研究表明，动脉粥样硬化是一种多基因遗传病，呈现非常明显的遗传异质性，发病具有地区特异性和种族特异性，病程发展由多层级联反应机制调控，病因复杂。目前认为动脉粥样硬化的发病是由于环境因素和遗传因素共同导致，从发生机制上看，多数学者支持“内皮损伤反应学说”，即认为动脉粥样硬化是一种血管壁的慢性炎症反应性疾病，以内皮细胞功能失调、粥样斑块形成为特点。这种斑块形成，向不稳定斑块转化、最终斑块破裂的过程最终导致了心血管急性事件的发生。
[0003]microRNA(miRNA)是一类长约22nt的非编码小RNA分子，它们通过与靶基因3' UTR结合降解靶基因或者抑制翻译，在多种生理过程中发挥重要作用。动脉粥样硬化的发生发展过程由多种复杂的调控通路参与，其中miRNA参与了动脉粥样硬化致病相关基因的转录后调控。动脉粥样硬化的致病原因有很多，如炎性反应、内皮细胞功能障碍等，近期越来越多的研究发现，miRNA能够参与到上述病理过程的调控之中。
[0004]本发明证实，miR-152在动脉粥样硬化患者血清中含量明显低于正常人，细胞水平研究进一步证实，在缺氧条件下内皮细胞中miR-152表达明显降低。
[0005]本发明目的是利用提供一种利用检测血清中miR-152水平作为临床诊断动脉粥样硬化的方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供miR-152作为动脉粥样硬化血清分子标志物。
[0007]本发明的目的在于提供一种检测miR-152表达量的引物。
[0008]本发明的目的还在于提供一种动脉粥样硬化血清检测试剂盒。
[0009]本发明的目的还在于提供一种非诊断目的的动脉粥样硬化血清检测方法。
[0010]一种检测miR-152表达量的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.2，SEQ ID N0.3 所示。
[0011]一种动脉粥样硬化血清检测试剂盒，所述试剂盒包含序列表中SEQ ID N0.2，SEQ IDN0.3所示的引物，标准样品，内参引物，反转录酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制剂和灭菌水。
[0012]所述标准样品为未经过处理的人血清样品中的RNA反转录成的cDNA。
[0013]一种非诊断目的的动脉粥样硬化血清检测方法，按照如下步骤进行:
[0014](I)提取待检样品的总RNA ；[0015](2)将步骤(1)得到的总RNA反转录为cDNA ；
[0016](3)利用权利要求3或4所述的一种动脉粥样硬化血清检测试剂盒，以步骤⑵得到的cDNA为模板，做定量PCR，检测样品中miR-152的表达量；
[0017](4)若待检样品的表达量显著高于标准样品的表达量，则该待检样品取自动脉粥样硬化患者的生物样品。
[0018]本发明的有益效果:本发明的方法简单，迅速，灵敏，适用于检测患者是否患有动脉粥样硬化。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是定量PCR检测正常人血清与动脉粥样硬化患者血清中miR-152含量的结
果O
[0020]图2是定量PCR检测人脐静脉内皮细胞在常氧与低氧环境培养下miR-152含量的结果。 【具体实施方式】
[0021]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
[0022]以下实施例未说明的实验步骤参照《分子克隆实验指南》第三版，或参照相应试剂盒的说明书。
[0023]实施例1人血清样品中RNA的抽提
[0024](I)样品(正常人血清、动脉粥样硬化患者血清)室温放置5分钟，从-80摄氏度冰箱取出的样品室温放置15分钟至融化。
[0025](2)每250 μ I样品加750 μ I Trizol混匀，再加入250 μ I三氯甲烷，剧烈晃动15
秒，室温静置3分钟。
[0026](3)4摄氏度、1200(^离心15分钟，上层为RNA
[0027](4)将上层水相约500微升转移到新EP管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀10秒,置于-20摄氏度冰箱沉淀两小时或过夜。
[0028](5)取出样品，4摄氏度12000g离心15分钟，倒掉上清加入I毫升80%乙醇(DEPC)洗涤沉淀，上下翻转十次，使白色RNA沉淀浮起，4摄氏度、7500g离心5分钟，共进行两次。
[0029](6)弃上清，吸尽管中液体，使乙醇挥发干净(约2-5分钟)
[0030](7)待RNA沉淀边缘开始变干透明时，立即加入DEPC水(20 μ I左右)。取I μ I用于定量，其它RNA与-80摄氏度保存备用。可加入I μ I RNAase inhibitor防止RNA降解。
[0031]实施例2反转录
[0032]米用M-MLV Reverse Transcriptase [Promega#9PIM170]反转录试剂盒进行反转录。
[0033]每个样品取I μ g RNA分别和miR-152及U6的特异反转引物混合，70度水浴10分钟，冰上放置两分钟。然后每个样品分别加入buffer5 μ l，dNTP4 μ 1，反转录酶I μ 1，RNAaseinhibitor0.2μ I。反转好的cDNA在-20度保存，避免反复冻融。
[0034]实施例3定量-PCR[0035]按照实验分组，每个样品检测内参和mir-152的含量。PCR正向引物和反向引物如序列表中SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示，每个实验组三个复孔，体系为20 μ 1，仪器为Stratagene MxPro3000, SYBR Green mix 为 Promega 公司产品。实验体系为:10μ 12X SYBRGreen mix,8y I水，I μ I引物，1μ I cDNA。PCR反应条件是95度5分钟，95度20秒，60度20秒，72度20秒，50个循环，溶解曲线为60度到95度，温度间隔为0.4度。
[0036]PCR结果如图1-2所示，在动脉粥样硬化患者中miR-152的拷贝数明显低于正常人血清中miR-152的拷贝数(图1);人脐静脉内皮细胞在常氧与低氧环境培养时，miR-152的拷贝数相应下降(图2)。以上结果均表明，在动脉粥样硬化患者血清及低氧胁迫处理均使miR-152的拷贝数 下降。
【权利要求】
1.miR-152作为动脉粥样硬化血清分子标志物，其特征在于，所述核苷酸序列如序列表中 SEQ ID N0.1 所示。
2.一种检测miR-152表达量的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.3 所示。
3.一种动脉粥样硬化血清检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的引物，标准样品，内参引物，反转录酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制剂和灭菌水。
4.根据权利要求3所述一种动脉粥样硬化血清检测试剂盒，其特征在于，所述标准样品为未经过处理的人血清样品中的RNA反转录成的cDNA。
5.一种非诊断目的的动脉粥样硬化血清检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行: (1)提取待检样品的总RNA； (2)将步骤⑴得到的总RNA反转录为cDNA； (3)利用权利要求3或4所述的一种动脉粥样硬化血清检测试剂盒，以步骤(2)得到的cDNA为模板，做定量PCR，检测样品中miR-152的表达量； (4)若待检样品的表达量显著高于标准样品的表达量，则该待检样品取自动脉粥样硬化患者的生物样品。
【文档编号】C12Q1/68GK104017860SQ201410143184
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】邵宁生, 黄皑雪, 李慧, 苏雪婷, 李洁, 丁红梅, 李少华, 赵强 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所