一种用于弓形虫感染预防的疫苗和制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明首先提供一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列：1）序列表中SEQ?ID?No.1中所示的核苷酸序列；2）与1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；3）对上述1）或2）所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰，并具有弓形虫感染预防功能的核苷酸序列。本发明还提供一种疫苗，其包括上述的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。本发明的质粒DNA疫苗pVAX-ROP38可有效地预防和控制弓形虫动物模型（昆明鼠）的感染，即可有效的延长小鼠的存活时间，减少脑包囊的荷虫量。因此，质粒pVAX-ROP38能作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫的感染。
【专利说明】一种用于弓形虫感染预防的疫苗和制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学和分子生物学领域，具体地，涉及一种用于弓形虫感染预防的疫苗。
【背景技术】
[0002]刚地弓形虫(Toxoplasma gondii,Τ.gondii)是一种专性细胞内寄生原虫,可引起人兽共患弓形虫病。弓形虫可感染包括人类在内的几乎所有的哺乳类动物，猫科动物是其主要传染源。全世界约有1/3的成年人感染，我国人群的感染率为5%~20%，家畜动物感染率为10%~50%。作为一种机会致病因子，弓形虫在正常宿主的机体中多呈隐性感染，无明显临床症状；但对于器官移植、艾滋病、恶性肿瘤患者等免疫缺陷或免疫抑制者，弓形虫可能是致死因子之一；孕妇感染弓形虫可导致流产、死胎以及胎婴先天性缺陷、发育畸形、脑炎及脑膜炎等。弓形虫感染可 引起家畜发生高热流产，并能和其他病原微生物协同作用，给全世界的畜牧业造成巨大的经济损失。使用安全有效的疫苗接种被认为可能是预防弓形虫病的最佳预防措施。
[0003]常用于弓形虫疫苗研究的候选抗原主要有微线体蛋白(microneme protein)、棒状体蛋白(rhoptry proteins, ROPs)、膜表面抗原(surface antige, SAG)及致密颗粒蛋白(dense granule protein)。其中，微线体是顶复门(Phylum Apicomplexa)原虫的一种细胞器，也是弓形虫重要的具有分泌功能的细胞器，在虫体入侵宿主细胞阶段发挥重要作用。ROPs是速殖子顶端棒状体分泌的对弓形虫侵入宿主细胞起重要作用的蛋白质，在虫体入侵、纳虫空泡(parasitophorous vacuole, PV)的形成和修饰过程中起着重要作用，它是重要的入侵和毒力作用因子。弓形虫膜表面蛋白I (major surface proteinl, SAGl)也是研究最多的疫苗候选分子之一。因此研究与弓形虫入侵及相关毒力因子的疫苗候选抗原，对于抗弓形虫疫苗的研究，以及弓形虫病的预防和控制具有重大意义。
[0004]弓形虫疫苗的研究经历了全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、基因工程疫苗以及DNA疫苗，DNA疫苗又包括单基因疫苗和复合基因疫苗。目前，研究较多的是复合多价疫苗和核酸疫苗。各种疫苗均有其优缺点。灭活疫苗的安全性较好，但其抗感染的能力弱；弱毒疫苗有着较好的保护性，但在安全性上一直存在着毒力返强及弓形虫感染中间宿主后在体内形成组织包囊等问题；基因工程疫苗生产过程复杂、技术难度大、且生产成本较高，其保护力及安全性还有待进一步改进；核酸疫苗具有无需使用佐剂、无需表达和纯化重组抗原、且能产生CTL作用、免疫具有持续性及可制成多价疫苗等优点而得到了广泛的应用。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种用于弓形虫感染预防的疫苗。为此，本发明还提供所述疫苗的制备方法及其应用。
[0006]棒状体蛋白38(R0P38)，是一种在不同虫株间存在不同表达的活性酶，分布于棒状体内，与弓形虫PVM的形成有关，而且是继R0P16和GRA15之后，第三个被发现的能改变宿主信号转导的蛋白，因此，弓形虫R0P38有望成为理想的疫苗候选抗原。
[0007]本发明提供一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列:1)序列表中SEQ ID N0.1中所示的核苷酸序列；
[0008]2)与I)中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
[0009]3)对上述I)或2)所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰，并具有弓形虫感染预防功能的核苷酸序列。
[0010]本发明的第二个目的是提供一种重组蛋白，其氨基酸序列由权利要求1所述的核苷酸序列编码。
[0011]优选地，所述氨基酸序列参见序列表中SEQ ID N0.2。
[0012]本发明的第三个目的是提供一种重组载体，其包括权利要求1所述的核苷酸序列。[0013]本发明的第四个目的是提供一种重组质粒，其核苷酸序列为序列表中SEQ IDN0.3所示的核苷酸序列。
[0014]本发明的第五个目的是提供一种疫苗，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。
[0015]本发明的第六个目的是提供上述的核苷酸序列、重组蛋白、重组载体、重组质粒、疫苗在弓形虫感染预防中的应用。
[0016]本发明的第七个目的是提供一种上述疫苗的制备方法，步骤如下:
[0017](I)提取弓形虫RH株总RNA;
[0018](2) RT-PCR 扩增 RH 株总 RNA ；
[0019](3)将步骤2中的扩增产物与载体连接；
[0020](4) pVAX I质粒的小量提取；
[0021](5)回收pVAX I载体及目的片段R0P38 ；
[0022](6)连接pVAX I载体与目的片段R0P38 ；
[0023](7)将连接产物转化至宿主菌中。
[0024]优选地，所述RT-PCR扩增RH株总RNA时所用引物为:
[0025]上游引物:5'-CGGGGTACCATGAAAAATACTCTGTTGTCA-3'；
[0026]下游引物:5'-CGCGGATCCTCAAAATTGATGCGTTCTTAT-3'。
[0027]优选地，所述RT-PCR扩增RH株总RNA时PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性 40sec，55°C复性 30sec ;72°C延伸 lmin35sec ；35 个循环，最后，72°C延伸 IOmin0
[0028]本发明质粒DNA疫苗pVAX-R0P38可有效地预防和控制弓形虫动物模型(昆明鼠)的感染，即可有效的延长小鼠的存活时间，减少脑包囊的荷虫量。因此，质粒PVAX-R0P38能作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫的感染。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0030]图1是pVAX-R0P38构建路线；
[0031]图2是弓形虫RH株死亡情况；[0032]图3 是 pMD18_T 质粒；
[0033]图4 是 pVAXI 质粒。
【具体实施方式】
[0034]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0035]本发明中实验材料购自:
[0036]雌性KM鼠，6w龄左右，体重20±2g，购自兰州大学医学实验中心。
[0037]宿主菌，弓形虫RH、PRU株，pVAX I真核表达载体等材料，均为中国农业科学院兰州兽医研究所寄生虫功能基因组学研究室保存并提供。
[0038]PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2 (货号:RR055B)、10XPCR Buffer(Mg2+free)>MgCl2 (25mmol/L)、dNTP Mixture (2.5mmol/L each)、Ex_Taq (5U/ μ L)(货号:DDR100D)、pMD18-T Vector (货号:D103A)、BamH I (货号:D1010A)、XhoI (货号:D1094A)、KpnI (货号:D1068A)、PstI (货号:D1073A)、XbaI (货号:D1093A)、10XM BufferUOXKBuffer、10 X 6 X Loading Buffer:购自 TaKaRa 公司；
[0039]Wizard* SV Genomic DNA Purification System (货号:A2360)、Tris_Cl、EDTA、IPTG、X-gal、T4DNA 连接酶:购自 Promega 公司；
[0040]RNAprep Pure Tissue Kit (货号:DP431)、TIANprep Mini Plasmid Kit (货号:DP103-02)、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号:货号:DP209_02)、普通DNA产物纯化试剂盒(货号:DP204-02):购自天根生化科技(北京)有限公司；
[0041]氨节青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、琼脂糖:购自Sigma公司；
[0042]其他化学试剂如NaCl、、无水乙醇等均为国产分析纯级产品。
[0043]一、弓形虫PRU株pVAX-R0P38疫苗的制备方法如下:
[0044]1.弓形虫PRU株总RNA的提取:将弓形虫PRU株按20个包囊/只的剂量灌胃接种于KM鼠，4周后颈椎脱臼处死小鼠，在75%酒精中浸泡2~3min。取出并于超净工作台中，无菌采集脑组织并将其置于研钵中，加入ImL PBS进行研磨，并搜集备用。用天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒RNAprep Pure Tissue Kit提取弓形虫PRU株总RNA，提取的具体方法和步骤参见说明书。
[0045]2.RT-PCR扩增:以所提取的弓形虫RH株总RNA为模板，用大连宝生物工程公司PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2 试剂盒进行 R0P38 基因的 RT-PCR 扩增，使用方法参见说明书。其中，
[0046]上游引物:FR0P38:5' -CGGGGTACCATGAAAAATACTCTGTTGTCA-3'；
[0047]下游引物:RR0P38:5' -CGCGGATCCTCAAAATTGATGCGTTCTTAT-3'；
[0048]PCR 反应条件为:94°C 预变性 5min，94°C变性 40sec，55°C 复性 30sec ;72°C 延伸lmin35sec ；35 个循环，最后，72°C延伸 IOmin0
[0049] 3.PCR纯化产物的连接:将步骤2中的扩增产物与pMD18连接，连接反应使用TaKaRa公司pMD?18_T Vector，使用方法参见说明书，连接条件为16°C反应2~4h或4°C连接过夜，连接产物标记为PMD18-R0P38。
[0050]4.R0P38的序列测定:将经菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。测序结果参见序列表中SEQ ID N0.1中所示的核苷酸序列，其编码的蛋白序列参见序列表中SEQ ID N0.2。
[0051]5.pVAX I质粒的小量提取:用天根生化科技(北京)有限公司TIANprep MiniPlasmid Kit进行pVAX I质粒提取,使用方法参照说明书。
[0052]6.pVAX I载体(图1所示)及目的片段R0P38的回收:用Kpn I和Xba I分别双酶切pVAXI质粒及pMD18-R0P38重组质粒，并用天根生化科技(北京)有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体及目的片段，使用方法参照说明书。
[0053]7.pVAX I载体与目的片段R0P38的连接:将经切胶回收纯化得到的R0P38基因片段定向亚克隆至pVAX I载体中。16°C反应4~6h或4°C连接过夜，产物标记为pVAX-R0P38。其核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.3，其中，横线部分为R0P38基因片段。
[0054]8.连接产物的转化与鉴定:将连接产物10 μ L转化大肠杆菌DH5 α中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。产物标记为pVAX-R0P38。pVAX_R0P38构建路线见图1。[0055]二、培养基和溶液的配制:
[0056]a、溶液的配制:
[0057](I) LB液体培养基
[0058]称取LB粉末5.0g,加适量的去离子水溶解，并定容至200mL，121 V高压灭菌20min，4°C保存备用。
[0059](2) LB固体培养基
[0060]于LB液体培养基中加入2.0% (m/V)琼脂粉，121°C高压灭菌20min，待其冷却到55°C~65 °C时倾注平板，待凝固后4°C保存备用。
[0061 ] (3) Kan+LB选择液体培养基
[0062]待(I)中制备的LB液体培养基高压灭菌后冷却至50°C~55°C时，加入Kan (卡那霉素)(终浓度为1000IU/mL)，摇晃混匀后4°C保存。
[0063](4 ) Kan+LB固体选择培养基
[0064]待(2)中制备的LB固体培养基灭菌后冷却至50°C~55°C时，加入Kan (终浓度为1000IU/mL)并轻轻摇动，混匀后迅速倾注平板，室温凝固并于4°C保存备用。
[0065]b、质粒大量提取时溶液的配制:
[0066](1)0.25mol/L Tris-Cl 溶液(ρΗ8.0)
[0067]称取Tris-Cl粉末6.055g，并将其溶解到IOOmL ddH20中，调节pH值为8.0，定容到200mL，高压灭菌后4°C保存备用。
[0068](2) 0.5mol/L EDTA 溶液(ρΗ8.0)
[0069]称取Na2EDTA37.22g，溶于200mL ddH20中，振荡混匀，调节pH值为8.0,高压灭菌后4 C保存备用。
[0070](3) TE 溶液(pH8.0)
[0071]先将(I)中制备的0.25mol/L Tris-Cl溶液和(2)中制备的0.5mol/L EDTA溶液(ρΗ8.0)稀释，并分别吸取 10mmol/L Tris-Cl 1.0mL 与 lmmol/L EDTA0.2mL，加入无菌ddH20后定容到100mL，4°C保存备用。[0072](4) 10%SDS 溶液(ρΗ7.2)
[0073]称取SDS (十二烷基磺酸钠)粉末10g，加入去离子水90mL后60°C水浴溶解，用浓HCl将其pH值调为7.2，并定容到IOOmL,现配现用，不宜长期保存。
[0074](5) 2moI/L NaOH 溶液
[0075]先于烧杯中加入去离子水160mL，称取NaOH粉末16.0g并缓缓加入到去离子水中，边加边混匀，定容到200mL后于塑料瓶中4°C保存。
[0076](6) Solution I
[0077]取(I)中制备的0.25mol/L Tris-CllOmL，(2)中制备的 0.5mol/LEDTA2mL，加去离子水定容到lOOmL，高压蒸汽灭菌后4°C保存。
[0078](7) Solution II
[0079]取2mol/L NaOHlOmL, 10%SDS10mL，加去离子水定容到IOOmL,现配现用，常温保存，不宜长时间存放。
[0080](8) Solution III
[0081]称取KAc粉末58.884g ，与冰乙酸23mL混合，加入适量去离子水溶解后定容到200mL，4°C 保存。
[0082](9) 3mol/L NaAc 溶液(ρΗ5.2)
[0083]称取无水NaAc49.22g，加去离子水定容到200mL，高压蒸汽灭菌后4°C保存。
[0084](10) 5mol/L LiCl 溶液
[0085]称取无水LiC142.4g，加去离子水定容到200mL，高压蒸汽灭菌后4°C保存。
[0086](11) 10mg/mL 溶菌酶
[0087]使用前，称取IOmg的溶菌酶，加lOmmol/L的Tris-Cl (PH8.0)即刻溶解定容至ImL，-20°C保存。
[0088]三、大量制备质粒
[0089]1.挑取步骤(一)和(二)中制备的已保存于_20°C的含有目的质粒(pVAX I，
[0090]pVAX-R0P38)的阳性菌液于Kan+LB固体选择培养基上划线，37°C培养过夜。挑取板上的一个单菌落置于12mL Kan+LB液体选择培养基中，摇床37°C，以180~220转/分钟的转速培养12~16h。将上述培养菌液以体积比1:100的比例接种到装有400mL Kan+LB液体选择培养基的1000mL锥形瓶中，摇床37°C，在180~220转/分钟转速下培养过夜。
[0091]2.将步骤I得到的细菌培养物置于冰中或4°C冰箱数分钟，4°C，以9000转/分钟转速离心5min，收集细菌培养物沉淀，弃上清(利用移液器小心吸出上清)，倒置离心管使上清尽量流出。用10mL4°C预冷的Solution I重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在Solution I中完全分散。(由于旋涡振荡和Solution I的加入已足够是菌液裂解分散，为了简化操作，此处省去现有技术中进一步裂解分散的步骤:加入ImL新配制的10mg/mL溶菌酶溶液(pH8.0),震荡混匀)。
[0092]3.在步骤2得到的菌液中加入20mL新配制的Solution II，轻摇并上下颠倒混匀2~4次。再加入15mL4°C预冷的Solution III，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀。冰上或-20°C冰箱放置IOmin0加Solution II和Solution III的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解。4°C或室温，在11000转/分钟下离心10min，利用4层纱布将上清过滤，转移到两个新50mL离心管中。[0093]4.将步骤3得到的上清与14_16mL异丙醇(现有技术中此处需加入0.6倍体积的异丙醇的方法，本 申请人:通过实验发现，异丙醇的加入量在0.6倍体积上下各Iml的范围内，是不影响产物的提取质量和产量的)混匀，室温放置lOmin。室温下，在11000转/分钟下离心10min，弃上清，将空管倒置于滤纸上数分钟，除去残余。加入3mL ddH20充分溶解，再加入3mL预冷的5mol/L LiCl溶液(此时需先加ddH20，后加LiCl，才能使沉淀充分溶解，颠倒步骤易造成沉淀溶解不充分或不溶解)，充分混匀，此处不可用吹打的方式混匀。吹打混匀易使提取的质粒发生断裂，两只离心管合并为一管，冰中或_20°C冰箱放置lOmin。4°C或室温，在11000转/分钟下离心10min，将上清分别转移到一新50mL离心管中，加入等体积(12mL)预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置lOmin。4°C或室温，在11000转/分钟下离心lOmin，小心弃上清，倒置控干管内液体，一般倒置10~15min即可。此时管壁会出现白色沉淀物即质粒。
[0094]5.在步骤4制备的白色沉淀物中加入3mL ddH20或TE溶液(pH8.0)溶解沉淀，并加入30 μ L10mg/mL RNase A (Takara公司产品)，37°C水浴Ih除去RNA。加入2倍体积(8mL)无水乙醇和1/10体积(400 μ L)。用3mol/L NaAc溶液，充分混匀，冰中或_20°C冰箱放置20min。4°C，在11000转/分钟下离心10min，小心将上清吸出(勿用倾倒的方式除去上清，易造成使吸附于管壁的沉淀分散，而非上清被倒出)，并将离心管倒置于滤纸上控干(主要控干残余的试剂如:乙醇和NaAc，减少杂质，提高质粒的纯度)。加入IOOyL ddH20或TE溶液(PH8.0)，充分洗脱质粒沉淀。利用分光光度计测量所得质粒的浓度并记录，测出的浓度为10000mg/mL。因此，我们将以保存浓度为1000mg/mL (十倍稀释)的量分装于1.5mL离心管中，即每管保存有1000mg质粒,体积为ImL,分装封口后于-20°C保存备用。
[0095]四、质粒DNA的纯度检测
[0096]以ddH20或TE (ρΗ8.0)为空白对照，用分光光度计测定波长260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。双链DNA纯品的OD26tZOD28tl值为1.8，若样品0D26(l/0D28(l值低于1.8，说明样品可能被蛋白质污染，需进一步纯化。
[0097]五、重组质粒的免疫效果评价
[0098]1.KM鼠免疫与分组:为了降低应激反应，KM鼠买回后需饲养I周，然后将其随机分为4个组，每组35只，具体分组见表1。
[0099]表1免疫实验分组情况
[0100]
【权利要求】
1.一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列: 1)序列表中SEQID N0.1中所示的核苷酸序列； 2)与I)中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列； 3)对上述I)或2)所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰，并具有弓形虫感染预防功能的核苷酸 序列。
2.一种重组蛋白，其氨基酸序列由权利要求1所述的核苷酸序列编码。
3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于:所述氨基酸序列参见序列表中SEQID N0.2。
4.一种重组载体，其包括权利要求1所述的核苷酸序列。
5.一种重组质粒，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
6.一种疫苗，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。
7.权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求2或3所述的重组蛋白、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的重组质粒、权利要求6所述的疫苗在弓形虫感染预防中的应用。
8.—种权利要求6所述的疫苗的制备方法，步骤如下: (1)提取弓形虫RH株总RNA;
(2)RT-PCR 扩增 RH 株总 RNA ； (3)将步骤2中的扩增产物与载体连接； (4)pVAXI质粒的小量提取； (5)回收pVAXI载体及目的片段R0P38 ； (6)连接pVAXI载体与目的片段R0P38 ； (7)将连接产物转化至宿主菌中。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于:所述RT-PCR扩增RH株总RNA时所用引物为: 上游引物:5' - CGGGGTACCATGAAAAATACTCTGTTGTCA -3'； 下游引物:5' - CGCGGATCCTCAAAATTGATGCGTTCTTAT -3'。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于:所述RT-PCR扩增RH株总RNA时PCR反应条件为:94°C预变性 5min，94°C变性 40sec，55°C复性 30sec ;72°C延伸 lmin 35sec ；35个循环，最后，72°C延伸IOmin。
【文档编号】A61K39/002GK103937818SQ201410135529
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】黄思扬, 徐颖, 张念章, 徐前明, 徐民俊, 宋慧群, 朱兴全 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所