专利名称：抗弓形虫新药青蒿琥酯组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗弓形虫病新药青蒿琥酯组合物(简称组合物)，由青蒿琥酯(青蒿琥珀单酯)和β-环糊精(环状低聚糖物质)的最佳配比组成，属医药化工领域。
青蒿琥酯组合物的主要成分是二氢青蒿素-2-a-琥珀单酯(Dihyroatemisinine-12-a-Sunccinate)，是我国研制成功的新型抗疟药，现经研究证明该药具有抗弓形虫病的新用途。其化学性状为1.化学结构式
5.性状无色针形结晶或白色结晶粉末，无臭、无味，易溶于乙醇、丙酮、氯仿或碳酸氢钠溶液中形成水溶性钠盐。
组合物的另一成分是由六个或更多的葡萄糖分子构成的环状低聚糖物质β-环糊精，其化学结构式为
由弓形虫引起的弓形虫病是人、畜共患疾病，全世界受感染者达10亿人之多。该病在我国分布甚广，正常人群中平均感染率为4-9%。在家畜中传播快、发病急、死亡率高，经济损失大，患者的多种脏器受侵犯，几乎涉及临床各学科。患弓形虫病的孕妇，其胎儿受传染者达40%，妊娠早期可引起的流产、死产，晚期则新生儿出现耳聋、视力障碍，小头畸形和智力低下。免疫功能缺陷的艾滋病人大多发生弓形虫病，爱玩宠物(狗、猫)的人弓形虫的感染率高达80%。
弓形虫病尚无特效药，现有的乙胺嘧啶、磺胺嘧啶和螺旋霉素均有不同程度的毒副作用。
本发明的目的在于为弓形虫病的治疗提供一种速效低毒的新制剂。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一、确定青蒿琥酯组合物中环糊精与青蒿琥酯的最佳配比关系由于青蒿琥酯的单体成份在一般溶液中难以充分溶解，因而不能充分发挥其稳定的杀虫作用，本发明利用筛选出的环状低聚糖物质β-环糊精)制成青蒿琥酯组合物，以提高青蒿琥酯的溶解度和杀虫效果的稳定性。其配比关系是通过以青蒿琥酯60mg，加于0.6ml5%的碳酸氢钠溶液中，待充分溶解后，再加入系列浓度的β-环糊精，所获青蒿琥酯的最终浓度为0.5%-20%，然后将此系列浓度形成的组合物和单纯青蒿琥酯溶液对比观察24小时，取组合物中不出现沉淀物析出的浓度作为合格的配比浓度，按此方法证实青蒿琥酯在2-8%的β-环糊精浓度范围内配制的组合物，具有显著的杀虫效果，由此确定20∶1-5∶1为组合物的最佳剂量配比。
二、青蒿琥酯组合物对入侵机体细胞的虫体和已在细胞内增殖虫体抑杀效果的测定方法以感染弓形虫的Hela细胞培养物细胞片为实验模型，经不同浓度组合物处理组和未经组合物处理的空白对照组以及乙胺嘧啶治疗对照组，分别进行对比观察24、48和72小时，其间计算细胞的群体感染率(%)和单个细胞内虫体的增殖率(%)。结果证明组合物处理组对入侵Hela细胞的和在细胞内增殖弓形虫的抑杀率高于乙胺嘧啶和磺胺最小有效杀虫剂量治疗组的4-6倍，由此确定该组合物的最小有效杀虫剂量为3-5μg/ml，对Hela细胞的有效保护率为67%，高于乙胺嘧啶5-8倍。
三、以动物模型试验确定青蒿琥酯组合物对已感染弓形虫的机体的保护作用，以小鼠为实验模型，用含2-4×105个/0.5ml弓形虫溶液腹腔攻击小鼠，2小时后开始用组合物灌肠给药，每天1次，连续7天，停药后继续观察7天，另设乙胺嘧啶磺胺治疗组为平行对照，其间每天记录动物的一般症状、死亡和存活情况，结果组合物治疗组动物的存活数和存活时间均超过乙胺嘧啶和磺胺治疗组分别为1.5倍和2倍，表明组合物对感染弓形虫的动物机体有较好的保护作用。
四、用电子显微镜观察青蒿琥酯组合物对弓形虫的药理作用在2-4万倍电镜下发现组合物一方面作用于弓形虫体膜系统，由于膜受药物损伤，进入虫体内的药物浓度增高，加强了青蒿琥酯对弓形虫的抑杀能力，另一方面是组合物对虫体细胞核酸的抑制作用，致使与药物接触的虫体失去繁殖能力和感染力。
五、按药理学方法测定组合物在临床应用中的一般药理作用以大鼠、小鼠和猫为试验模型，在口服10于倍抗弓形虫剂量ED90(60-120mg/kg)的组合物后，观察28天，动物无明显的药理学反应。剂量提高到16倍于ED90时，动物(豚鼠、兔、狗、猴)的神经系统均未出现异常，剂量增至32倍于ED90时，家兔的脑电波呈现从兴奋到抑制的变化，剂量增至64倍于ED90时，狗的呼吸速率和心率均减缓，血压下降，但心电图无异常，表明上述剂量的组合物对健康动物机体的神经、心血管和呼吸等系统均未出现严重的药理活性变化。
六、按毒理学方法对组合物的安全性评价急性毒性鉴定是以小鼠为试验模型，其半数致死量(LD50)为1011mg/kg(♂)和1358mg/kg(♀)对动物灌胃给药，同时以LD50700mg/kg(♂)和690mg/kg(♀)腹腔注射给药;对大鼠LD50为873mg/kg(♂)和586mg/kg(♀)灌胃给药后，连续观察28天，结果按化学毒物分级标准评价，该组合物的毒性级别属于低毒级药物，实验所得青蒿琥酯的安全指数为79.9mg/kg。组合物大剂量毒性试验是用大鼠和Beagle狗为模型，大鼠试验组的组合物划分为大剂量(150mg/kg)组中剂量组100mg/kg和小剂量(50mg/kg)组Beagle狗大剂量(150mg/kg，中剂量82.5mg/kg，小剂量15mg/kg，口服给药，均为每天一次，连服28天，其间连续检查动物的饮食、体重、血液和生化等指标以及主要脏器和药物靶器官的病理形态学观察。结果证明大剂量鉴定组大鼠的基本安全剂量为25MKD，相当于临床剂量的8倍。Beagle狗的安全剂量为15MKD，相当于人用剂量的5倍。大剂量组动物的毒性表现特点是靶器管骨髓、造血功能受到轻度抑制，肠粘膜、肝、肾、肺仅有轻度损伤，停药28天后，除骨髓恢复稍慢以外，其它脏器的损伤灶已完全消失。对各脏器的损伤只是一过性可逆反应，属于低毒药物、安全范围较宽。
七、该组合物和乙胺嘧啶磺胺的抗弓形虫病临床对比观察正在积极进行中通过查新了解，迄至目前未见到和本发明技术方案相同的或相似的利用青蒿琥酯组合物治疗弓形虫病的报道(附查新证明书)。
本发明提出的技术方案实施例如下实施例1青蒿琥酯组合物中β-环糊精和青蒿琥酯剂量配比的确定取白色粒状结晶青蒿琥酯60mg溶于0.6ml5%碳酸氢钠溶液中，待充分溶解，加入系列浓度的β-环糊精配成青蒿琥酯最终浓度为0.5-20%溶液，然后以此系列浓度的青蒿琥酯组合物和不加β-环糊精的青蒿琥酯溶液进行平行对比观察24小时，以不出现沉淀物析出者为青蒿琥酯的最佳溶解度，由此确定2-8%的β-环糊精浓度范围内求出β-环糊精和青蒿琥酯的最佳剂量配比。
实施例2组合物抑杀入侵机体的或在机体细胞内增殖弓形虫的鉴定方法以感染弓形虫的Hela细胞为体外试验模型，设定三个实验组(一)不同浓度组合物处理组;(二)乙胺嘧啶磺胺处理组和(三)无治疗阳性对照组，三组平行对比观察24、48和72小时，其间计算细胞群体感染率(%)和单个细胞内虫体的增殖率(%)的变化，用此方法证实组合物的最小有效杀虫剂量。
实施例3组合物的感染弓形虫动物机体保护作用的确定以受弓形虫感染(腹腔攻击)2小时后的小鼠为模型，用胃饲管给药，每天1次，连续7天停药，继续观察7天，同时以不治疗的阳性对照组平行对照观察，其间，录两组动物的一般症状，死亡和存活情况，并作统计学处理(P值)。
实施例4用电子显微镜观察青蒿琥酯组合物对弓形虫的药理学作用，在2-4万倍电镜下可以看到①与组合物接触一定时间的弓形虫虫体膜系统受药物损伤，导致进入虫体内组合物浓度的增高;②虫体细胞内核酸受抑制，使弓形虫失去繁殖力和感染力。
实施例5按药理学方法确定组合物临床应用中的药理学反应。
以三种动物(小鼠、大鼠和猫)为试验模型，口服组合物10倍于ED90(mg/kg)抗弓形虫剂量，连续观察28天，测定并记录动物的临床反应，包括动物的神经、心血管和呼吸系统的药理活性变化，以确定其有否药理学影响。
实施例6按毒理学方法对组合物的毒性鉴定及其安全性评价急性毒性鉴定是以鼠类为试验模型，对小鼠的半数致死量(LD50)为1011mg/kg(♂)和1358mg/kg(♀)灌胃给药，同时以700mg/kg(♂)和690mg/kg(♀)腹腔注射给药;对大鼠的LD50为873mg/kg(♂)和586mg/kg(♀)灌胃给药，连续观察28天，结果按化学毒物分级标准评价组合物的药物毒性级别;该组合物大剂量毒性鉴定是以大鼠和Beagle狗为试验模型，将组合物划分为大、中、小三个剂量组，其中大鼠大剂量组为150mg/kg、中剂量组为100mg/kg，小剂量组为50mg/kg，Beagle狗的大剂量组为150mg/kg、中剂量组为82.5mg/kg，小剂量组为15mg/kg。各组动物均以口服给药，每天1次，连续给药28天，停药后观察28天，其间连续检查动物的饮食、体重、血液、生化等指标以及主要脏器和药物靶器官的病理形态学变化，然后根据结果计算出大鼠的基本安全剂量(MKD);Beagle狗的安全剂量(MKD)。
实施例7组合物产品的剂型是根据不同情况的病人需要，制成片剂、胶囊、胶丸、栓剂。
实施例8感染弓形虫的Hela细胞试验模型的制备方法，以RH株弓形虫悬液1ml(含虫体300个)加入预先准备的Hela细胞培养物即感染细胞片中，然后以37℃孵育24、48和72小时，再以Henks溶液漂洗Hela细胞，用丙酮固定，进行不同时间的姬姆萨染色，镜检、记录其感染细胞数、虫体总数等，按不同时间计算弓形虫的细胞感染率和单个感染细胞的虫体均数，最后确定感染虫体的Hela细胞标本能否作为体外实验模型。
实施例9青蒿琥酯对受弓形虫感染机体的保护作用，将含有2-4×105个虫体/0.5ml的溶液腹腔攻击小鼠，2小时后用组合物灌胃给药，每天1次，连续7天，停药后继续观察7天，其间每天记录动物的一般症状表现、死亡和活存情况，并用统计学处理。
权利要求
1.一种抗弓形虫病新药青蒿琥酯(青蒿琥珀单酯)和β-环糊精(环状低聚糖物质)的最佳剂量配比组成，其特征在于①由系列配比实验法确定β-环糊精和青蒿琥酯组合物的最佳配比；②以Hela细胞模型实验方法确定组合物最小有效杀虫剂量；③以动物模型实验方法证明组合物对机体的保护效应；④以药理毒理学方法确定对组合物的安全性评价，
2.如权利要求1所述一种抗弓形虫病新药青蒿琥酯组合物，其特征在于确定组合物最佳剂量配比关是采用系列配比试验法优选出来的，即以青蒿琥酯60mg溶于0.6ml5%的碳酸氢钠溶液中，加入系列浓度的β-糊精，取其0.5-20%浓度范围内最佳溶解度的样品进行抑杀弓形虫观察，从中选出最小有效杀虫浓度作为最佳剂量配比，
3.如权利要求1所述一种抗弓形虫病新药青蒿琥酯组合物，其特征在于以感染弓形虫的Hela细胞为模型，给与不同浓度组合物处理后24、48、和72小时，测定细胞的总感染率(%)和单个细胞内虫体增殖率(%)的变化情况来确定组合物最小有效杀虫剂量，
4.如权利要求1所述一种抗弓形虫病新药青蒿琥酯组合物，其特征在于组合物对机体保护作用的确定是采用经2-4×105个虫体/ml弓形虫0.5ml腹腔攻击的小鼠而进行的，以灌胃给药，每天1次，连续7天，停药后再观察7天，并以乙胺嘧啶磺胺治疗组为平行对照，观察记录动物的一般症状，存活和死亡情况，并作统计学处理，
5.如权利要求1所述一种抗弓形虫病新药青蒿琥酯组合物，其特征在于用电子显微镜2-4万倍下能观察到弓形虫的膜系统受组合物损伤情况，以及虫体细胞内核酸受抑制而失去繁殖力和感染力的情况，
6.如权利要求1所述，一种抗弓形虫病新药青蒿琥酯组合物，其特征在于对组合物的安全性评价是以小鼠半数致死量(LD50)1011mg/kg(♂)和1358mg/kg(♀)，对大鼠LD50875mg/kg(♂)和586mg/kg(♀)对Beagle狗的大剂量为150mg/kg，中剂量82.5mg/kg，小剂量为15mg/kg口服给药，分别观察28天，然后按化学毒物分级标准评定组合物的毒性级别，并测出其安全指数的安全界量(mg/kg)，
7.如权利要求1所述一种抗弓形虫病新药青蒿琥酯组合物，其特征在于组合产品的剂型是根据病人的不同需要制成口服片剂，
8.如权利要求1所述一种抗弓形虫病新药青蒿琥酯组合物，其特征在于根据病人不同情况制成口服胶丸。
全文摘要
一种抗弓形虫病新药青蒿琥酯组合物，由青蒿琥珀单酯和环状低聚糖物质β-环糊精的最佳剂量配比组成。该组合物的药理学效应一、是破坏弓形虫的膜系统增加虫体内药液浓度；二、是抑制虫体细胞核酸，使弓形虫丧失繁殖力和感染力。属于高效低毒药物，临床安全范围较宽。
文档编号A61K31/715GK1092293SQ9310274
公开日1994年9月21日 申请日期1993年3月19日 优先权日1993年3月19日
发明者王明道, 徐在海, 孔惟惟, 王京燕, 曹军田, 李予川, 孙国璋, 王翠娥, 杨树森, 武苏平, 吴增强, 杨秀珍 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所