专利名称：一种弓形虫快速检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及检测弓形虫基因组DNA的环介导等温扩增技术，具体说是一种弓形虫 快速检测试剂盒，本发明包括该试剂盒的制备方法。
背景技术：
目前常用的诊断弓形虫病的方法包括凝集试验、酶联免疫吸附法和PCR等，这些 方法都有一定的缺点。凝集试验主要是间接血凝法，该方法的缺点是检测灵敏度低，会出现 漏检的情况；酶联免疫吸附法的缺点是所需的仪器设备昂贵，需要配合使用专门的酶标仪、 操作过程相对复杂、检测时间比较长；而且这两种方法是针对弓形虫抗体检测，检测为阳性 的动物可能是接种弓形虫疫苗引起的。PCR和LAMP方法都是基于分子生物学基础上的灵 敏、特异、高效新型诊断技术。但PCR方法需要昂贵的PCR仪来配合使用，反应的时间长，反 应后需要进行琼脂糖凝胶电泳用凝胶呈像仪观察结果，且在动物基因组DNA提取过程中， 可能会有一些遗留的PCR反应的抑制因子影响其特异性和敏感性。
发明内容
本发明的目的是为了克服当前弓形虫病诊断技术中的不足，提供一种基于分子生 物学领域的的高敏感性、高特异性、高效性、操作简单的弓形虫快速检测试剂盒，同时提供 该试剂盒的制备方法。一种弓形虫快速检测试剂盒，包括2XLAMP反应液、引物混合物、大片段链置换 DNA聚合酶、显色剂、标准阳性模板以及dd H2O0所述引物混合物包括40pmol上游内部引 物FIP、40pmol下游内部引物BIP、5pmol上游外部引物F3、5pmol下游外部引物B3、20pmol 上游环形引物LF及20pmol下游环形引物LB。所述引物针对弓形虫三磷酸核苷水解酶(NTPase)基因设计，引物序列为上游内部引物FIP(Flc+F2)5 ‘ -ACCTAGCTGGGTCTTCGCCTAG-TTTT-GCCTCTTCGCGTTTATCACG-3‘下游外部引物BIP(Blc+B2)5 ‘ -AATACGGGGTGAAGCATTGCCG-TTTT-AGAAGCACCCCCAACCTC-3‘上游外部引物F3:5' -CGATCACAGGAGCTGAGGA-3‘
下游外部引物 B3 :5 ‘ -CGGTACCTTCCTGTAGTGGA-3 ‘上游环引物LF 5 ‘ -AAAGAGGGCGTCGCGGTAC-3 ‘下游环引物LB:5' -GAGGAAGGCCTCTTCGCGTTTATC-3‘所述2 X LAMP反应液包括4%三羟甲基氨基乙烷(Tris-HCl，pH8. 8)、20mM氯化钾 (KCl)、16mM 硫酸镁(MgSO4)、20mM 硫酸铵((MM)2SO4)、0· 2% 吐温 20 (Tween20)、2· 8mM 脱氧 核苷酸混合物(dNTPs)和1.6M甜菜碱。所述弓形虫快速检测试剂盒的制备方法如下(1)制备2XLAMP反应液①配置Tris-HCl:配置浓度为12. ll%Tris，并用HCl调节pH8. 8，备用；②配置含有终浓度为22. 2mM的KC1、17. 8mM的MgS04、22. 2mM的(MM)2SO4 和1. 78M的甜菜碱的混合溶液，并加入0. 22% Tween20和4. 4%的Tris-HCl，备用；③将② 中配置的溶液与25mM dNTPs按照体积比为9 1的比例混合；(2)制备引物混合物①针对弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的一段高度保守的区 域设计引物；②混合引物中FIP BIP F3 B3 LF LB为8 8 1 1 4 4， 按照如上体积比例混勻。(3)制备标准阳性模板①体重为20 25g小鼠每只按IX IO5 IX IO6弓形虫 速殖子腹腔接种，经3 4日，小鼠出现精神沉郁、不食、被毛粗乱等症状时，脱颈致死小白 鼠，浸泡于70 75%酒精内体表消毒；②每只小鼠用2毫升PH7. 2PBS缓冲液冲洗腹腔收 集虫体；③提取弓形虫基因组DNA，此为标准阳性模板。反应体系为50% 2XLAMP反应液、3. 6%引物混合物、0. 4% BstDNA聚合酶、8%标 准阳性模板以及34.4% dd H2O0反应条件为65°C，30min ;80°C，2min ;4°C，永久保存。反 应后按体积比为25 1将LAMP产物与显色剂混合，观察颜色变化，判断结果。本发明是建立在分子生物学基础上，基于弓形虫高度保守的三磷酸核苷水解酶基 因，应用环介导等温扩增(LAMP)的方法快速检测弓形虫的试剂盒，具有敏感性高、特异性 强、反应迅速、操作简单等特点，不需要特殊的仪器设备，解决了弓形虫病检测时间长、工作 量大、操作复杂等缺陷，可以用于检测临床样本是否携带弓形虫，以及弓形虫病的早期诊断 和分子流行病学调查。
具体实施例方式一种弓形虫快速检测试剂盒，包括2XLAMP反应液、引物混合物、BstDNA聚合酶、 显色剂、标准阳性模板以及dd H2O02 X LAMP 反应液包括4 % Tris-HCl (ρΗ8· 8)、20mM KCl、16mM MgSO4, 20mM(NH4)2S04、0. 2% Tween 20、2. 8mM dNTPs 禾口 1· 6M 甜菜碱。引物混合物包括40pmol上游内部引物FIP、40pmol下游内部引物BIP、5pmol上游外部引物F3、 5pmol下游外部引物B3、20pmol上游环形引物LF及20pmol下游环形引物LB。下面结合实施例对本发明做进一步详细说明实施例1(1)制备LAMP反应液①配置Tris-HCl 称取 121. Ig Tris 于 800mLddH20 中溶解，用 HCl 调节 ρΗ8· 8，定 容至IOOOmL,备用；②称取1.49g KCl、3.96g MgSO4 · 7Η20、2· 64g(NH4)2S04、187. 4g 甜菜碱，并加入 40mL①中配置的Tris-HCl以及2mL Tween 20，加dd H2O定容至900mL，备用；③取900 μ L②中配置的溶液，加入100 μ L25mM dNTPs，混勻。(2)制备引物混合物①针对弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的一段高度保守的区域，利用 PrimerExpolorer V4在线软件设计引物；②混合引物包括22. 4 μ L FIP 和 BIP,2. 8 μ L F3 和 Β3 以及 11. 2 μ L LF 禾口 LB,混勻。(3)制备标准阳性模板①20 25克体重小鼠每只按1 X IO5 1 X IO6弓形虫速殖子腹腔接种，经3 4 日，小鼠出现精神沉郁、不食、被毛粗乱等症状时，脱颈致死小白鼠，浸泡于70 75%酒精 内体表消毒；②每只小鼠用2毫升PH7. 2PBS缓冲液冲洗腹腔收集虫体；③提取弓形虫基因组DNA，此为标准阳性模板。检测时按照如下反应体系LAMP 反应液12.5yLBstDNA 聚合酶1 μ L引物混合物0. 9yL模板 DNA2 μ Ldd H2O8. 6 μ L总反应体系25 μ L(4) LAMP 反应反应条件为65°C，30min ；— 80°C,2min ；— 4°C，永久保存。反应结果判定反应后加入1 μ L的显色剂，肉眼观察阳性结果是染料由橘红色变 为绿色，紫外下发绿色荧光；阴性结果染料不变色，仍为橘红色，紫外下无荧光。
权利要求
一种弓形虫快速检测试剂盒，包括2×LAMP反应液、引物混合物、BstDNA聚合酶、显色剂、标准阳性模板以及dd H2O，其特征在于所述引物混合物包括40pmol上游内部引物FIP、40pmol下游内部引物BIP、5pmol上游外部引物F3、5pmol下游外部引物B3、20pmol上游环形引物LF及20pmol下游环形引物LB。
2.根据权利要求1所述的弓形虫快速检测试剂盒，其特征在于针对弓形虫三磷酸核苷 水解酶基因设计引物，所述引物序列为上游内部引物FIP(Flc+F2)5 ‘ -ACCTAGCTGGGTCTTCGCCTAG-TTTT-GCCTCTTCGCGTTTATCACG-3‘下游外部引物BIP(Blc+B2)5 ‘ -AATACGGGGTGAAGCATTGCCG-TTTT-AGAAGCACCCCCAACCTC-3‘上游外部引物 F3 5 ‘ -CGATCACAGGAGCTGAGGA-3 ‘下游外部引物 B3 :5‘ -CGGTACCTTCCTGTAGTGGA-3‘上游环引物 LF 5 ‘ -AAAGAGGGCGTCGCGGTAC-3 ‘下游环引物 LB 5 ‘ -GAGGAAGGCCTCTTCGCGTTTATC-3 ‘
3.根据权利要求1所述的弓形虫快速检测试剂盒，其特征在于所述2XLAMP反应液 包括 4% ρΗ8· 8 的 Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgS04、20mM(NH4)2S04、0. 2% Tween 20,2. 8mM dNTPs和1. 6M甜菜碱。
4.一种根据权利要求1所述弓形虫快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于按下述工 艺方法制备a、制备2XLAMP反应液①配置Tris-HCl配置浓度为12. 11% Tris，并用HCl调节 pH8. 8，备用；②配置含有终浓度为22. 2mM的KC1、17. 8mM的MgS04、22. 2mM的(MM)2SO4和 1. 78M的甜菜碱的混合溶液，并加入0. 22% Tween20和4. 4%的Tris-HCl，备用；③将②中 配置的溶液与25mM dNTPs按照体积比为9 1的比例混合；b、制备引物混合物①针对弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的一段高度保守的区域设计 引物；②混合引物中FIP BIP F3 B3 LF LB为8 8 1 1 4 4，按照如 上体积比例混勻。C、制备标准阳性模板①20 25克体重小鼠每只按1 X IO5 1 X IO6弓形虫速殖子腹 腔接种，经3 4日，小鼠出现精神沉郁、不食、被毛粗乱等症状时，脱颈致死小白鼠，浸泡于 70 75%酒精内体表消毒；②每只小鼠用2毫升PH7. 2PBS缓冲液冲洗腹腔收集虫体；③提 取弓形虫基因组DNA，此为标准阳性模板。
全文摘要
本发明是一种弓形虫快速检测试剂盒及其制备方法，建立在分子生物学基础上，基于弓形虫高度保守的三磷酸核苷水解酶基因，应用环介导等温扩增(LAMP)的方法快速检测弓形虫的试剂盒。该试剂盒包括LAMP反应液、引物、Bst DNA聚合酶、显色剂、标准阳性模板以及dd H2O。本发明的试剂盒具有敏感性高、特异性强、反应迅速、操作简单等特点，不需要特殊的仪器设备，解决了弓形虫病检测时间长、工作量大、操作复杂等缺陷。可以用于检测临床样本是否携带弓形虫，以及弓形虫病的早期诊断和分子流行病学调查。
文档编号C12Q1/68GK101974634SQ20101052639
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月30日 优先权日2010年10月30日
发明者付宝权, 张德林, 李文卉, 王艳华, 王萌 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所