利用可视薄膜感受器芯片检测特异核苷酸序列的方法

专利名称：利用可视薄膜感受器芯片检测特异核苷酸序列的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种快速检测和鉴定植物及其他机体中特异 核苷酸序列和单核苷酸多态性的方法。
背景技术：
在植物科学研究领域，能够快速、准确的鉴定特异核苷酸序列非常必要。目前，在 基因组水平上鉴定物种和生态型以及追踪遗传模式已经是常规的实验方法。另外，海关和 政府的检查员、作物育种者、商业食品加工部门经常需要检测植物商品中遗传修饰作物和 病原体是否符合相应的法规要求。对于植物商品的外源基因序列检测的需求日益升高，为 了满足这种需求，需要发明了一种应用广泛、价格低廉、高度特异性并且使用方便的测定方 法。目前已有的鉴定特异核苷酸序列和多态性的方法可以分为三大类1)以多聚酶链反应(PCR)为基础的检测方法。PCR是一种广泛使用的扩增特定 DNA序列的方法。用凝胶电泳技术可以显示被扩增序列的存在，同时也可以确定DNA的数 量、大小、甚至序歹Ij (Chiueh et al.，2002 ；German et al.，2003 ；Gilliland et al.，1990 ； Hoist-Jensen et al.,2003 ；Miraglia et al. ,2004 ；Rogers and Parkes,1999 ；Su et al.，2003)。实时PCR是一种普遍用来定量检测特异核苷酸片段的方法，使用荧光信号对扩 增产物进行实时定量。实时PCR技术要求特殊的热循环仪和荧光探针，虽然快速灵敏，但价 格昂贵，并且容易产生假阳性信号(Baric and Dalla-via, 2004 ；Hernandez et al. ,2004 ； Shibata et al. ，1998 ;Stubner，2002)。2)以分子标记为基础的检测方法。采用DNA标记鉴定植物物种已经成为一种常用 的方式(Andersen and Lilbberstedt，2003)。最常用的分子标记包括限制性片段长度多态 性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、简单序列重复(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)。RFLP 技术是将样本中的DNA消化后与探针进行杂交(Bai et al. ,2000 ；Cavallotti et al.， 2003 ；Yu et al. , 1995 ；Zhang et al.，1995)，包括限制性内切酶消化、凝胶电泳、转膜、与 标记的探针杂交。这个方法得到的结果精确但费时费力。RAPD技术是对植物基因组进行随 机PCR扩增，它需要进行大量的PCR实验，并且随着每个PCR反应的具体实验条件结果变化 差异很大(Bai et al. ,2000 ；Ilbi, 2003 ；Luo et al. ,2002) SSR 标记或者叫做微卫星标 记是分散于整个基因组中独特的串联重复序列，可以用位于这些标记两侧的引物进行PCR 扩增(Cordeiro et al. ,2000 ；Edwards et al.，1998)。变性的 DNA 模板 SSR 区域的两条 DNA链由于核苷酸组成的复杂度低其再聚合的倾向性高，在GenBank中可以查到相关物种 的SSR位点，或者通过基因组文库搜索来设计SSR引物。SNP是由于等位基因中的单个核苷酸差异而引起的植物基因组的多样性和自然变异(Maloof et al.，2001)。SNP普遍用于鉴别同一物种的不同品系和栽培种。例如，将两 种主要的拟南芥生态型(Col和Ler)的基因组序列进行比较发现，平均每3. 3kb就会有一 个 SNP (即 125Mb 中的 SNP 总数超过 37, 000) (http //www, arabidopsis. org/cereon/)。比 较水稻的两个主要亚种 indica 9311 (Yu et al. ,2005)和 japonica Nipponbare (IRGSP, 2005)发现，相同单位基因序列中的SNP标记数目是拟南芥的10倍。对于已建立的SNP技 术平台的调查显示，高通量的检测技术(IrwaderTM and SNiPerTM)需要非常昂贵的仪器设 备投入(Mashima et al. ,2004 ；Pati et al.，2004)，而低通量的检测技术，尽管不需要昂 贵的仪器但是费时费力。可视薄膜感受器芯片是一种经过特殊处理的硅晶片，其结构可分为三层即直径 10厘米的硅基质为基底层；上面有一层475埃的氮化硅，构成可视层；在可视层之上涂上便 于进行分子反应的T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷构成反应层。基底层和可视层构成薄膜 硅质基片，涂上反应层后它可以将分子反应转化为肉眼可见的信号，这个过程主要包括当 检测物与反应层分子发生相互作用时，物质沉积在薄膜表面，产生酶催化反应，通过可视层 改变反射光波长，最后导致膜表面可见的颜色变化，从而将分子反应转化为肉眼可见的信 号(Sandstrom, T.，Steinberg, Μ. &Nygren, H. (1985) Appl. Opt. 24，472-479.)。

发明内容
本发明的目的在于提供一种利用可视薄膜感受器芯片技术快速、准确、低廉的检 测特异核苷酸序列和SNP标记(或点突变)的方法。本发明的技术方案简要地讲，首先将特异序列的单链寡核苷酸作为捕捉探针通过 乙醛共价结合于胼衍生的感受器芯片表面；然后通过生物素标记的PCR产物与感受器表面 的捕捉探针杂交，可以鉴定特异的DNA序列，或者PCR产物与感受器表面的捕捉探针在生 物素标记的检测探针和热稳定的连接酶的混合物中进行杂交反应，可以鉴定位点突变序列 (如SNP位点)，只有目标序列与探针完全匹配的情况下生物素标记的检测探针才能通过连 接酶作用共价结合于芯片的表面，即便是一个核苷酸不匹配也不可以；最后，将杂交后的芯 片与辣根过氧化物酶标记的生物素抗体温育，再加入辣根过氧化物酶的底物，如果PCR产 物中存在特异性的目标序列，那么芯片的表面会有颜色的变化，金色变为蓝色或紫色，能够 被人的裸眼所分辨。整个检测过程在30分钟内即可完成。这项检测技术具有准确、灵敏度 高和特异性强的特点，并且低通量和高通量可自由选择，非常经济实惠。采用可视薄膜感受器芯片检测特异核苷酸序列的原理如图1所示，捕捉探针通过 5’端的乙醛基与芯片表面的胼基共价结合而固定于芯片上(见图1A)，然后将生物素标记 的PCR片段与其进行杂交。其中一、检测特异的基因或DNA片段时，需要合成正反向两个引物并且将带有正向链 序列的捕捉探针点在芯片表面。其中，反向引物的5’端带有共价结合的生物素(参见表 1和图1B)。捕捉探针的5’端带有乙醛基团，从5’到3’依次是10-12个脱氧腺嘌呤残基 (作为间隔)和35-50个的与PCR扩增子完全匹配的正向链序列，捕捉探针的5’端与芯片 表面共价结合(参见表1和图1A)。用正反向两个引物对待测样品进行PCR扩增，靶DNA的 扩增产物中生物素标记的链与芯片表面的探针序列互补并特异性杂交，然后采用抗生物素 的抗体进行显色反应(参见图1B)。反应的产物沉淀于芯片上从而增加薄膜的厚度，由于薄膜厚度的改变使其表面的颜色发生变化，由金色变为蓝色或紫色，从而肉眼可进行辨别或 采用数字成像系统进行记录。二、检测SNP位点或点突变时，合成一对寡聚核苷酸作为Pl捕捉探针，通过5’端 与芯片表面共价结合(参见图IA和图1C)。这两个Pl探针分别由10-12个碱基的间隔序 列和35-50个碱基的序列组成，该35-50个碱基的序列互补于靶基因中相关SNP位点(或 点突变位点)一侧的DNA序列，它们的差别仅在于其3’末端核苷酸分别与该SNP (或点突 变)的不同等位基因相对应。P2探针互补于该SNP(或点突变)位点另一侧的相邻序列，其 3’端有生物素标记，5’端带有磷酸基。在杂交体系中加入热稳定的连接酶以便进行P1-P2 连接，在55-65°C条件下完成DNA杂交过程和连接反应，反应时间不超过20分钟。用氢氧 化钠进行严格洗涤以去除未连接的DNA分子，当Pl与靶DNA完全匹配时带有生物素标记的 P2附着于芯片上，使用HRP标记的抗生物素IgG和可沉淀的底物进行检测(参见图1C)。具言之，本发明利用可视薄膜感受器芯片检测特异DNA序列的方法包括如下步 骤1)将特异序列的单链寡核苷酸探针通过乙醛共价结合于胼衍生的可视薄膜感受 器芯片表面，该探针从5’到3’端依次是10-12个碱基的脱氧腺嘌呤残基和35-50个碱基 的与特异DNA序列完全匹配的正向链序列；2) PCR扩增待测样品的目标DNA序列，其中反向引物5’端带有共价结合的生物 素；3)将变性后的PCR产物与芯片进行杂交，洗涤；4)芯片与辣根过氧化物酶(HRP)标记的生物素抗体杂交，洗涤；5)在芯片上加辣根过氧化物酶的底物进行反应，如与四甲基联苯胺室温反应 5min，然后水洗，干燥，观察结果，芯片表面从金色变为蓝色或紫色表明样品中含有该特异 DNA序列。上述步骤1)具体又可通过下列步骤实现1-1)利用旋转涂布方式在构成可视薄膜感受器芯片的薄膜硅质基片表面涂布 145埃T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷，然后将含有聚(苯丙氨酸-赖氨酸)的芯片在含 1-10 μ M的琥珀酰亚氨基烟酸沙星的ΡΗ8. 2的0. IM硼酸钠溶液中处理2小时，去离子水洗 干净，备用；1-2)合成捕捉探针，该探针从5’到3’端依次是10-12个碱基的脱氧腺嘌呤残基和 35-50个碱基的与特异DNA序列完全匹配的正向链序列，并用乙醛基团修饰探针的5’端；1-3)将5’端带有乙醛基团的探针稀释为不同浓度，取l_200nl点样至芯片上，室 温反应2小时后用去离子水浸洗，60°C浸于0. SDS中2小时，水洗，干燥。上述步骤3)杂交液为5 X SSC (1 X SSC溶液含有柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 · 2H20) 2. 2 克，氯化钠4. 4克，定容至500毫升蒸馏水)和5mg/ml酸解酪蛋白溶液，45°C杂交10-15分 钟，在这个过程中目标PCR扩增子中生物素标记的反向链通过碱基配对与捕捉探针结合， 然后用0. IXSSC溶液室温洗涤芯片以去除非特异性的结合。上述步骤4)杂交液为5XSSC、5mg/ml酸解酪蛋白及10%甘油溶液，在杂交液中 18-25°C温育5min后用0. 1 X SSC溶液室温洗涤芯片，其中HRP标记的生物素抗体通常是抗 生物素的IgG。
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本发明利用可视薄膜感受器芯片检测特异DNA位点(SNP位点或点突变)的方法 包括如下步骤1)将一对特异序列的单链寡核苷酸捕捉探针Pl通过乙醛共价结合于胼衍生的可 视薄膜感受器芯片表面的不同点样点，所述Pl探针从5’到3’端依次是10-12个碱基的脱 氧腺嘌呤残基和35-50个碱基组成的序列，两个Pl探针的3’末端碱基分别与SNP或点突 变的不同等位基因相对应，其余的34-49个碱基组成的序列互补于靶基因中相关SNP或点 突变位点一侧的相邻序列；2)合成一个P2探针，P2探针互补于SNP或点突变位点另一侧的相邻序列，其3’ 端有生物素标记，5’端带有磷酸基；3) PCR扩增待测样品的目标DNA序列；4)在共价结合了 Pl探针的芯片上加P2探针和变性后的PCR产物，在热稳定连接 酶的存在下同时进行DNA杂交反应和P1-P2连接反应；5)用0. OlM的NaOH 60°C严格洗涤芯片，然后用0. 1 X SSC溶液室温洗涤芯片；6)芯片与辣根过氧化物酶标记的生物素抗体杂交，洗涤；7)在芯片上加辣根过氧化物酶的底物进行反应，水洗，干燥后观察结果，芯片表面 从金色变为蓝色或紫色表明该点样点的Pl探针与样品的SNP位点或点突变相匹配。上述步骤1)具体又可通过下列步骤实现1-1)利用旋转涂布方式在构成可视薄膜感受器芯片的薄膜硅质基片表面涂布 145埃T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷，然后将含有聚(苯丙氨酸-赖氨酸)的芯片在含 1-10 μ M的琥珀酰亚氨基烟酸沙星的ΡΗ8. 2的0. IM硼酸钠溶液中处理2小时，去离子水洗 干净，备用；1-2)合成一对捕捉探针Ρ1，从5’到3’端依次是10_12个碱基的脱氧腺嘌呤残基 和35-50个碱基组成的序列，两个Pl探针的3’末端碱基分别与SNP或点突变的不同等位 基因相对应，其余的34-49个碱基组成的序列与靶基因中相关SNP或点突变位点一侧的相 邻序列互补，用乙醛基团修饰Pl探针的5’端；1-3)将5’端带有乙醛基团的一对Pl探针稀释为不同浓度，分别取l_200nl点样 至芯片上的不同位置处，室温反应2小时后用去离子水浸洗，60°C浸于0. 1 % SDS中2小时， 水洗，干燥。上述步骤4)先在芯片上加P2探针和变异Ampligase，在含20mM Tris-HCl, pH 8. 3,25mM KCl, IOmM MgCl2,0. 5mM 烟酰胺腺苷酸二核苷酸，0. 01 % Triton X-100 和 5mg/ml 酸解酪蛋白的连接反应体系中55-65 °C预热，然后加入变性后的PCR产物，于55-65°C同时 进行DNA杂交反应和P1-P2连接反应。上述步骤6)杂交液为5XSSC、5mg/ml酸解酪蛋白及10%甘油溶液，在杂交液中 18-25°C温育5min后用0. 1 X SSC溶液室温洗涤芯片，其中HRP标记的生物素抗体通常是抗 生物素的IgG。本发明利用可视薄膜感受器芯片技术检测植物或其他机体基因组的特异核苷酸 序列和分子标记，具有下列优点 可以替代其它检测特异核苷酸序列的方法，包括实时PCR:此方法的特点是快速、灵敏，但是价格昂贵，要求特定的热循环仪和特定的荧光探针，并且易于产生假阳性信号；限制性片段长度多态性此方法冗长费时；随机扩增多态性DNA 要求大量PCR扩增工作，并且对实验条件敏感，重复性差；简 单序列重复易于造成错误信息；单核苷酸多态性需要采用昂贵的仪器进行高通量的分析，或不采用昂贵的仪器 但是比较费时费力；微阵列技术要求昂贵的仪器和训练有素的技术人员。 结果可肉眼看见 方法快速、强大、灵敏度高、特异性高 不需要昂贵的仪器投资，此方法可应用于任何可进行基本的PCR操作的分子生 物实验室 灵敏度比凝胶电泳高1000倍以上。这项技术可针对任何核苷酸序列的检测进行定制，可以广泛应用于作物育种、性 状基因测序、谷物和食品及环境中的病源微生物检测、转基因植物及其产品的鉴定、外来植 物物种入侵和植物疫情的快速检测及生物物种资源的快速检测等任何需要进行特异核苷 酸序列鉴定的工作中。具体说来，其应用领域包括快速、经济的检测和鉴定 特异的单核苷酸对 用于快速的植物后代基因分型 商品化食品样品中的植物转基因的存在 检测植物的交叉授粉 检测植物疫情眷植物物种资源 食品和环境中的病原体的存在 任何有机体的基因突变 转基因动物中转基因的存在总之，本发明提供了一种利用可视薄膜感受器芯片检测有机体或环境中特异核苷 酸序列的新方法，该方法的突出优点是采用了可视薄膜感受器芯片，使得实验结果肉眼可 见。同时，该方法快速、易用、高通量、灵敏度高、特异性强、应用广泛，并且与已存在的实验 方法相比价格低廉，无需昂贵的设施和仪器，可以广泛用于可进行普通PCR实验的实验室。 这项技术首先可应用于遗传修饰植物，也可用于动物和微生物的检测。对于普遍的植物基 因探针，完全选择性的灵敏度可达10_15M。可以定制芯片用于从已商业化的遗传修饰植物中 检测转基因标记，芯片上信号的强弱与特定基因标记的浓度相关。这项技术可以在干扰核 酸浓度高于靶核酸100倍的混合物体系中精确检测出靶核酸序列。


图1是采用可视薄膜感受器芯片检测特异核苷酸序列的原理示意图。其中A示意了捕捉探针通过5’端的乙醛基与芯片表面的胼基共价结合而固定于芯片 上；
B示意了用可视薄膜感受器芯片检测遗传修饰作物的原理，进行PCR反应的反向 引物的5’端标记有生物素，扩增产物中一条生物素标记的链与芯片表面的探针序列互补并 特异性杂交，然后采用抗生物素的抗体进行显色反应；C示意了利用可视薄膜感受器芯片进行SNP检测的原理。图2显示了用可视薄膜感受器芯片检测遗传修饰作物中的转基因的特异性和敏 感性。其中A显示了用手工进行不同浓度的捕捉探针点样时检测的特异性和敏感性。Iectic 基因和CaMV35S启动子的捕捉探针(浓度分别为0. 001，0. 01，0. 1，1 μ M，分别手工点样 200nl于芯片表面上(左栏)。CaMV35S启动子的PCR产物(浓度分别为100 μ 1的反应体 系中含0，0· 1，1，10和IOOfmol)分别加样于五个同样的芯片上(右栏)。B显示了计算机控制的移液器进行捕捉探针点样时检测的特异性和敏感性。每 个点点样40nl的Ι.ΟμΜ探针溶液。捕捉探针的点样顺序显示在左栏，其中Μ是生物 素-dA20，正对照标记；点1-4是内源基因=LLectin凝集素(大豆)；2. Ivrl(玉米)； 3. Accg8 (油菜)；4. Sadl (棉花)；点5-8是筛选标记5. CaMV35S promoter,花椰菜花叶病 毒的35S启动子；6. NOS terminator ；胭脂碱合成酶基因终止子；7. nptll，新霉素-3，-磷 酸转移酶基因；8.⑶S gene ；点9_12是鉴定标记9. CrylAb，苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 cryIAbB)基因；10. CrylAc，苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryAc基因；11. BAR (pat)草丁膦 乙酰转移酶基因；12. cp4-印sps，农杆菌CP4的5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因。Accg8 PCR 扩增子(浓度分别每IOOul反应体系含0，0. l，l，10，100fmol)用于5个同样的芯片上。图3显示了用可视薄膜感受器芯片对遗传修饰作物进行检测的结果。其中A是遗传修饰作物种子中的转基因和内源基因的PCR产物的凝胶电泳检测图；B是PCR产物的混合物与芯片进行杂交，对遗传修饰作物的转基因和内源基因进 行检测的结果照片。图4显示了用可视薄膜感受器芯片对水稻、拟南芥、番茄中的SNP标记进行检测的 结果。其中A显示了四个SNP捕捉探针的点样位置(左栏)和不同水稻(indica and japonica)的SNP检测结果代表图(右栏)；B显示了两个生态型特异的SNP(1_4)和COPl基因的两个点突变(5_8)的捕捉 探针的点样位置(左栏)，以及Col，Ler，copl-4，copl-6的PCR产物检测结果代表图(右 栏)；C显示了番茄育种图中的两个母本和六个F2子代的SNP基因分型图。图5显示了样品中的特异SNP分子的丰度与芯片检测信号强度的相关性。其中上部为芯片检测结果图，下部为定量图，当两种SNP的比例范围小于1000时，信号 与两种PCR产物的相对量成比例关系。图6是用可视薄膜感受器芯片SNP技术对一个新的突变进行染色体作图的示意 图。以拟南芥2号染色体下部的COPl位点为例，其中A收集突变体分离的F2代群体并进行作图过程的说明。F2代群体汇集为一个池， 提取DNA，进行基因组范围的SNP标记分离分析。
B拟南芥Col-和Ler-生态型2号染色体中特异的SNP频率。SNP标记在靠近COPl 位点时，会偏向产生原始突变的亲本。
具体实施例方式下面通过具体实验及其结果进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。材料与方法1.可视薄膜感受器芯片的设计和制作可视薄膜感受器芯片的薄膜硅质基片购自Inverness Medical-Biostar, Louiville,C0. USA，是直径10厘米、表面覆盖475埃氮化硅的晶片。利用旋转涂布方式在晶 片表面涂布145埃T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷，此层吸收了聚(苯丙氨酸-赖氨酸)。 将含有聚(苯丙氨酸-赖氨酸)的晶片在25毫升含1-10 μ M的琥珀酰亚氨基烟酸沙星的 0. IM硼酸钠(ρΗ8. 2)中处理2小时，去离子水洗干净，备用。在寡核苷酸的5’端合成乙醛 亚磷酸胺。用0. IM硼酸钠(ρΗ7. 8)将乙醛标记的寡核苷酸稀释为不同浓度，取l_200nl点 样至晶片上。室温(20-25°C)反应2小时后，用去离子水浸洗晶片，60°C浸于0. SDS中 2小时，水洗，干燥。制备好的芯片可以在室温保存6个月。在本发明的具体实验中，对于检测遗传修饰作物(GMO)中的特异核苷酸序列，在 GenBank数据库中检索序列来设计PCR引物和捕捉探针。PCR引物来自于四个转基因作物 大豆、玉米、油菜籽、棉花，序列如表1所示。反向引物的5’端标记有生物素用来显示结果。 捕捉探针的5’端有乙醛基团修饰，可以与薄膜上的胼基团反应，从而将捕捉探针固定于芯 片上，以10个脱氧腺嘌呤为间隔，与互补于靶序列的40个核苷酸成为一条链。寡核苷酸由 Invitrogen (USA)合成。表1. GMO检测中所用PCR引物和捕捉探针的寡核苷酸序列
权利要求
一种利用可视薄膜感受器芯片检测特异DNA序列的方法，包括以下步骤1)将特异序列的单链寡核苷酸探针通过乙醛共价结合于肼衍生的可视薄膜感受器芯片表面，该探针从5’到3’端依次是10 12个碱基的脱氧腺嘌呤残基和35 50个碱基的与特异DNA序列完全匹配的正向链序列；2)PCR扩增待测样品的目标DNA序列，其中反向引物5’端带有共价结合的生物素；3)将变性后的PCR产物与芯片进行杂交，洗涤；4)芯片与辣根过氧化物酶标记的生物素抗体杂交，洗涤；5)在芯片上加辣根过氧化物酶的底物进行反应，水洗，干燥后观察结果，芯片表面从金色变为蓝色或紫色表明样品中含有该特异DNA序列。
2.如权利要求1所述的检测特异DNA序列的方法，其特征在于，所述步骤1)具体通过 下列步骤实现1-1)利用旋转涂布方式在构成可视薄膜感受器芯片的薄膜硅质基片表面涂布145埃 T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷，然后将含有聚(苯丙氨酸-赖氨酸)的芯片在含1-10 μ M 的琥珀酰亚氨基烟酸沙星的ΡΗ8. 2的0. IM硼酸钠溶液中处理2小时，去离子水洗干净，备 用；1-2)合成探针，该探针从5’到3’端依次是10-12个碱基的脱氧腺嘌呤残基和35-50 个碱基的与特异DNA序列完全匹配的正向链序列，并用乙醛基团修饰探针的5’端；1-3)将5’端带有乙醛基团的探针稀释为不同浓度，取l_200nl点样至芯片上，室温反 应2小时后用去离子水浸洗，60°C浸于0. 1% SDS中2小时，水洗，干燥。
3.如权利要求1所述的检测特异DNA序列的方法，其特征在于，所述步骤3)杂交液为 5 X SSC和5mg/ml酸解酪蛋白溶液，45°C杂交10-15分钟后用0. 1 X SSC溶液室温洗涤芯片。
4.如权利要求1所述的检测特异DNA序列的方法，其特征在于，所述步骤4)杂交液为 5XSSC、5mg/ml酸解酪蛋白及10%甘油溶液，在杂交液中18_25°C温育5min后用0. IXSSC 溶液室温洗涤芯片。
5.如权利要求1所述的检测特异DNA序列的方法，其特征在于，所述步骤5)所用的辣 根过氧化物酶的底物为四甲基联苯胺，室温反应5min。
全文摘要
本发明提供了一种利用可视薄膜感受器芯片技术检测特异核苷酸序列和SNP标记(或点突变)的方法。将特异序列的单链寡核苷酸作为捕捉探针通过乙醛共价结合于肼衍生的感受器芯片表面；然后通过生物素标记的PCR产物与捕捉探针杂交，可以鉴定特异的DNA序列，或者捕捉探针、在生物素标记的检测探针和PCR产物同时进行杂交和连接反应，可以鉴定位点突变序列(如SNP位点)；最后将芯片与辣根过氧化物酶标记的生物素抗体温育，加底物显色，如果PCR产物中存在特异目标序列，那么芯片的表面会有肉眼可辨的颜色变化，金色变为蓝色或紫色。这项检测技术快速、准确、低廉、灵敏度高、特异性强，并且低通量和高通量可自由选择，非常经济实惠。
文档编号C12Q1/68GK101942516SQ20101027593
公开日2011年1月12日 申请日期2007年6月26日 优先权日2006年6月28日
发明者白淑兰, 邓兴旺, 钟晓波, 魏宁 申请人:邓兴旺