专利名称：用于向下调节促炎标记物的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，该组合物包括获自Boswellia(乳香树)物种的乳香酸 (Boswellic acid)成分(部分，fraction)和多糖成分。该组合物在呈现增强的生物活性， 特别是向下调节(下调)促炎标记物方面是协同的。本发明还涉及多糖成分单独或与乳香酸成分组合(联合)在抑制PGE2中的应用。
背景技术：
在没有免疫系统的准确调节的情况下，存活是不可能的。促炎细胞因子的产生是在发育、组织再生、愈合、创伤或感染过程中协同免疫和代谢反应的关键生理过程并且是保护我们的身体免于出血、局部缺血、癌症和脓毒症的关键生理进程。促炎细胞因子，如白介素(IL)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的受控产生激发有益的炎性反应，所述炎性反应促使局部凝血以限制感染和组织损伤(Ulloaand Tracey，20(^)。然而，这些细胞因子的不受限制的产生比初始损伤更加危险，并且它是导致人类发病率和死亡率的主要原因之一。这种过程的一个最显著的实例是“严重脓毒症”，是重病护理病区中死亡的重要原因和发达社会中死亡的主要原因之一(Martin et al.，2003)。严重脓毒症的特征在于过量产生促炎细胞因子，其诱发系统性炎症、新血管功能障碍和致命性多器官衰竭(Van der Poll andLowry, 1995 ；Hotchkiss and Karl, 2003 ；Rice and Bernard, 2005) 这种效应通过研究来阐明， 所述研究表明中和促炎细胞因子(单克隆抗-TNF抗体和IL-I受体拮抗剂)已证实在炎性病症如类风湿性关节炎、克罗恩病、强直性脊柱炎和牛皮癣方面是成功的(Feldmarm，2002 ； Ulloa and Tracey,2005 ；Rutgeerts et al. ,2006 ；Ulloa andMessmer,2006)。除细胞因子以外，其他的介体如组胺、前列腺素类、白细胞三烯(白三烯)、缓激肽等在炎症中也发挥作用。因此，它们用作标记物并可用于诊断疾病病症，尤其是它们以升高水平存在的那些病症。因此，调节标记物以精确控制免疫系统是必要的。齿叶乳香树(Boswelliaserrata) (N. 0. Burseraceae)的树胶脂(称为“Dhup，，)、 印度蓝丹andian Frankincense)或印度乳香Qndianolibanum)用于宗教仪式和香料应用中已有悠久的历史。在Ayurvedic传统中长久已知的印度蓝丹的保健应用已经成为西方世界的焦点，过去三十年间，导致树胶脂渗出物的标准化提取物的广泛应用。这样的提取物被用作膳食补充剂(饮食补充剂，dietarysupplements)和化妆品中的成分以支持(维持) 健康性老化。膳食补充剂中的最普遍应用是关节健康支持产品以支持正常的关节功能和活动。近来的科学证据越来越多地支持齿叶乳香树的保健效应。典型地，齿叶乳香树的树胶含油树脂提取物被报道含有类倍半萜烯精油(8-12% w/w)、多糖05-60% w/w)、和高级类萜05-35% w/w)。树胶脂提取物中的生物标记物成分是称为乳香酸的一组五环三萜烯化合物。
乳香酸已表明可抑制酶5-脂肪氧合酶，这种酶催化由花生四烯酸形成促炎白细胞三烯。除了该机制之外，乳香酸还可降低酶，人白细胞弹性蛋白酶(HLE)的活性。这种双重作用是乳香酸独有的(Safayhi，H et al.，1997)。由于在多种炎症和基于超敏性人类疾病中通过中性粒细胞刺激来同时提高白细胞三烯的形成和HLE释放，因此通常认为通过乳香酸进行的两种促炎酶的已报道的阻断和它们对补体蛋白质的有利效果以及肥大细胞的稳定化活性可能是Boswellia提取物的保健效应的基本原理，其在多次临床前和临床研究中被证明。齿叶乳香树树胶脂的提取物的特性一般为树脂性的，并且生物标记物乳香酸 (亲脂性化合物)不溶于水。US2003/0186932描述了一种分离自齿叶乳香树的树胶脂提取物中的水溶性生物活性成分。其进一步披露了该成分与乳香酸以等比率(1 1)的组合对于抗关节炎活性表现出加性效应而不是协同效应。US7582314描述了一种通过给予包含乳香酸和元素硒的组合物来治疗牛皮藓影响的个体的方法。US20080275117描述了一种通过以大于65%的量使用包含乳香酸和/或它们的乙酸酯的组合物来治疗关节炎的方法。该组合物还声称进一步包括多糖和乙酸正辛酯、因香酚(incensole)、因香酚醋酸酯(incensole acetate)、里哪醇、莰醇(龙脑)、莰烯、榄香烯、 石竹烯、因香酚氧化物(incensole oxide)、氧化因香酚醋酸酯(incensoleoxide acetate) 或它们的组合。本发明包括一种组合物，该组合物包含获自Boswellia物种的乳香酸成分和多糖成分，在向下调节(下调)/抑制促炎标记物中表现出增强作用。
发明内容
本发明涉及一种组合物，该组合物包含获自Boswellia物种的乳香酸(Boswellic acid)成分和多糖成分，用于向下调节(下调)促炎标记物如TNF-α、IL_li3、氧化一氮(一氧化一氮，nitric oxide) ,IFN-γ和LTB4。乳香酸成分以约60%的浓度存在，而多糖成分以约40%的浓度存在。与单独的成分相比，包含乳香酸成分和多糖成分的组合物表现出其活性的增强。本发明进一步涉及多糖成分单独或与乳香酸成分组合在抑制PGE2中的应用。
图1 获自Boswellia物种的多剂量乳香酸成分对来自处理的kilb/c小鼠的血浆中胞外的体内TNF-a和IL-I β测定(评估)的影响。图2 获自Boswellia物种的多剂量多糖成分对来自处理的kilb/c小鼠的血浆中胞外的体内TNF-α和IL-I β测定的影响。图3 多剂量的组合物对来自处理的balb/c小鼠血浆中胞外的体内TNF-a和 IL-I β测定的影响。图4 获自Boswellia物种的多剂量乳香酸成分对来自处理的kilb/c小鼠血浆中胞外的体内NO测定的影响。图5 获自Boswellia物种的多剂量多糖成分对来自处理的kilb/c小鼠血浆中胞外的体内NO测定的影响。图6 多剂量组合物对来自处理的balb/c小鼠血浆中胞外的体内NO测定的影响。图7:乳香酸成分、多糖成分和组合物在大鼠(注射的爪)中结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculli)诱导的炎性关节炎中的比较抗关节炎活性(预防性)。图8 在以分级的剂量水平用乳香酸成分、多糖成分和组合物处理的大鼠中，来自结核分枝杆菌诱导的炎性关节炎中关节炎爪的组织勻浆的上清液中TNF-α的表达。图9 在以分级的剂量水平用乳香酸成分、多糖成分和组合物处理的大鼠中，来自结核分枝杆菌诱导的炎性关节炎中关节炎爪的组织勻浆的上清液中PGE2的表达。图10 在以分级的剂量水平用乳香酸成分、多糖成分和组合物处理的大鼠中，来自结核分枝杆菌诱导的炎性关节炎中关节炎爪的组织勻浆的上清液中LTB4的表达。图11 乳香酸成分、多糖成分和组合物对结核分枝杆菌诱导的炎性关节炎动物的脾细胞中通过流式细胞术的胞内IFN-Y表达的影响。图12 乳香酸成分、多糖成分和组合物(有效剂量)在大鼠(注射的爪)中结核分枝杆菌诱导的确定的炎性关节炎中的抗关节炎活性(治疗性)。图13 示出了乳香酸成分和本发明的组合物的水溶性的比较。图14 示出制备本发明的组合物的步骤的流程图。
具体实施例方式本发明涉及一种协同组合物(增效组合物)，其包含约60%浓度的乳香酸成分和约40%浓度的多糖成分、可选地连同药用赋形剂。在本发明的另一种实施方式中，乳香酸成分和多糖成分获自Boswellia物种。在本发明的又一种实施方式中，乳香酸成分包括β -乳香酸、乙酰基-β -乳香酸、 11-酮- β -乳香酸和乙酰基-11-酮- β -乳香酸。在本发明的又一种实施方式中，多糖成分包括半乳糖、阿拉伯糖、D-葡糖醛酸和 4-0-甲基-葡糖醛酸阿拉伯糖基-半乳聚糖G-O-methyl-glucuronoarabino-galactan)。在本发明的又一种实施方式中，药用赋形剂选自包括抗粘附剂、粘合剂、涂布剂、 崩解剂、填充剂和稀释剂、调味剂(芳香剂)、着色剂、助流剂、润滑剂、防腐齐 、吸附齐 、甜味剂以及它们的组合的组。在本发明的又一种实施方式中，该组合物被配制成选自包括液体、锭剂、糖锭、粉剂、颗粒、胶囊、片剂、贴剂、凝胶、乳液、膏剂、洗剂、牙膏(dentrifice)、滴剂、混悬液、糖浆、 酏剂、植物剂(phyotceuticals)和营养剂(neutraceuticals)的组中的剂型。本发明还涉及一种用于制备协同组合物的方法，该组合物包含浓度为约60%的乳香酸成分和浓度为约40%的多糖成分，可选地具有药用赋形剂，所述方法包括以下步骤-由BoswelIia物种获得乳香酸成分和多糖成分；-合并浓度为约60%的乳香酸成分和浓度为约40%的多糖成分，可选地连同药用赋形剂，以获得该组合物。在本发明的又一种实施方式中，乳香酸成分包括β -乳香酸、乙酰基-β -乳香酸、 11-酮- β -乳香酸和乙酰基-11-酮- β -乳香酸。在本发明的又一种实施方式中，多糖成分包括半乳糖、阿拉伯糖、D-葡糖醛酸和4-0-甲基-葡糖醛酸阿拉伯糖基(glucuronoarabino)-半乳聚糖。本发明涉及一种用于向下调节/抑制促炎标记物的方法，所述方法包括给予需要其的受试者组合物的步骤，该组合物包含浓度为约60%的乳香酸成分和浓度为约40%的多糖成分，可选地连同药用赋形剂。在本发明的又一种实施方式中，乳香酸成分和多糖成分获自Boswellia物种。在本发明的又一种实施方式中，受试者是动物，包括人类。在本发明的又一种实施方式中，促炎标记物选自包括TNF-α、IL-I β、IFN-γ、氧化一氮和LTB4的组。本发明涉及一种用于向下调节/抑制PGE2的方法，所述方法包括给予需要其的受试者组合物的步骤，该组合物包含单独的多糖成分或与乳香酸成分的组合，可选地连同药用赋形剂。在本发明的又一种实施方式中，乳香酸成分和多糖成分获自Boswellia物种。在本发明的又一种实施方式中，受试者是动物，包括人类。本发明还涉及一种膳食补充剂，其单独或组合包含上面提及的组合物。本发明相对于现有的传统Boswellia提取物表现出改善，为制造商提供了更大的水溶性形式，其具有增强的关节健康支持潜力。该组合物赋予活性成分独特的释放分布。除乳香酸以外，(Boswellia提取物常规标准化的有效组分)，来自齿叶乳香树的树胶脂的多糖成分也具有生物活性并且是水溶性的。多糖成分增强了提取物中乳香酸的保健(卫生) 作用，如体外和体内研究所揭示的，其水平超过仅为加性的期望值。包含获自Boswellia物种的乳香酸成分和多糖成分的组合物表现出促炎标记物的向下调节。与组合物的单独组分相比，该组合物在向下调节促炎细胞因子或介体中表现出增强的活性，因而具有增效(协同)特性。Boswellia物种的多糖成分是水溶活性的并因此提高乳香酸的溶解性(图13)，降低较高浓度下乳香酸的毒性并允许持续的抗炎作用。用乙醇提取BoswelIia树胶，并用酸-碱接着通过水洗来处理乙醇提取物以给出乳香酸成分。弃除在该过程中获得的己烷残留物(油成分(油部分))。在用乙醇提取 Boswellia树胶后剩余的残渣用蒸馏水提取并用醇沉淀以获得多糖成分。将乳香酸成分和多糖成分分别以约60%和40%的浓度合并以获得本发明的组合物(图14)。乳香酸成分包括β-乳香酸、乙酰基-β-乳香酸、11-酮-β-乳香酸和乙酰基-11-酮-β -乳香酸。多糖成分包括半乳糖、阿拉伯糖、D-葡糖醛酸和4-0-甲基-葡糖醛酸阿拉伯糖基(glucuronoarabino) -半乳聚糖。该组合物可以可选地包含药用赋形剂，其选自包括抗粘附剂、粘合剂、涂布剂、崩解剂、填充剂和稀释剂、调味剂、着色剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂以及它们的组合的组。本发明的组合物被配制成选自包括液体、锭剂、糖锭、粉剂、颗粒、胶囊、片剂、贴剂、凝胶、乳液、膏剂、洗剂、牙膏、滴剂、混悬液、糖浆、酏剂、植物剂和营养剂的组中的剂型。测试该组合物抑制/向下调节/减少促炎标记物如TNF- α、IL-I β、氧化一氮、 IFN- y、PGE2和LTB4水平的潜力。TNF- α (肿瘤坏死因子-α )是参与系统性炎症并刺激急性阶段反应的细胞因子。 TNF产生的调节关系到各种人类疾病、以及癌症。其在LPS诱导的败血性休克的发病机制中起到非常重要的作用。IL-I β是最有效的促炎细胞因子之一，其参与生理性免疫反应和各种免疫病理性障碍的发展。检测IL-I β的水平可用于监测和诊断各种疾病，包括炎症、免疫疾病和骨病。氧化一氮合适水平的氧化一氮产生在保护器官如肝脏免受局部缺血损害方面是重要的。然而，持续水平的NO产生导致直接组织毒性并促进与败血性休克相关的血管塌陷 (血管萎陷)。NO的慢性表达与各种癌和炎性病症包括小儿糖尿病、多发性硬化、关节炎和溃疡性结肠炎相关。通过向下调节/减少细胞因子或其它介体，该组合物发现可有效用于各种疾病/ 障碍(表现出升高水平的这些细胞因子或其他介体)如关节炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合症、哮喘(呼吸障碍)等的管理。借助于以下实施例将更进一步详细地描述本发明。然而，这些实施例不应被解释成限制本发明的范围。实施例1 生物活性评估急性安全性研究急性口服毒性研究在小鼠中按照OECD指导原则No. 423 [经济合作与发展组织。关于化学测试的OECD指导原则。指导原则423，急性口服毒性-急性毒性分类方法，米用，1996 年 3 月 22 日(Organization for Economic Cooperation and Development. OECDguidelines for testing of chemicals. Guideline 423, acute oral toxicity-acute toxic class method, adopted, March 22，1996) ]。￠: 白勺 24/j、^t 内周期性地单独观察动物，其中在最初的4小时内特别注意，并且之后每日一次，同时观察总共14天。口服给予各组雌性小鼠的2000mg/kg的口服(p. o.)单一剂量组合物在这些测试动物的总体一般性行为方面并没有表现出任何变化。还评估了 5000mg/kg的口服(ρ. ο.) 单一剂量。当与载体对照组的实验动物相比时，以这种高口服剂量并没有观察到死亡或正常行为的任何变化。体外研究实施例1 鼠中性粒细胞中胞内的体外TNF- α测定对测试材料进行体外研究，由此，进行流式细胞计数研究以确定多剂量乳香酸成分、多糖成分和本发明的组合物对从全血中通过histopaque梯度分离的鼠中性粒细胞中胞内TNF-α细胞因子表达的影响。用LPS刺激细胞并在(X)2恒温箱中用测试材料以梯度浓度(μ g/ml)温育细胞3 小时。将渗透性溶液(permeabilising solution)加入到细胞中，然后对其温育10分钟。 然后用结合的抗-小鼠TNF-α单克隆抗体标记细胞并在黑暗下进行另外的30分钟的温育。在用磷酸盐缓冲盐水冲洗后，直接在BD-CantoII流式细胞仪(Beckton-Dickinson Biosciences,CA,USA)上获取样品。荧光激发器(fluorescence trigger)设置为门控中性粒细胞群的FLl参数(10，000个事件)并且荧光补偿、数据分析和数据显示使用CellQuest Pro 软件进行[Clara, B. , R. C. Arancha, G.M.Andre ‘ s, P. Atanasio, A. Julia, and 0. Alberto. 2003. A new method for detectingTNF-α -secreting cells using direct immunofluorescence surfacemembrane stainings. J. Immuno. Methods 264 :77-87.] [Khurshid A. Bhat, Bhahwal A. Shah, Kuldeep K. Gupta, Anjali Pandey, Sarang Bani,Subhash C. Taneja. Semi-synthetic analogs of pinitol as potential inhibitors of TNF-a cytokine expression in human neutrophils. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 2009，1939-1943]。根据表1、表2和表3 (流式细胞计数研究)中给出的结果， 清楚的是，当与单独的乳香酸成分和多糖成分相比时，该组合物对于鼠分离的中性粒细胞响应LPS刺激物的TNF-α细胞因子分泌上表现出最大的抑制效应。用25、50、100、200、400 和800 μ g/ml浓度的乳香酸成分、多糖成分和组合物体外处理的中性粒细胞在200 μ g/ml 的剂量水平下分别表现出30. 52%,29. 31%和59. 83%的TNF-α抑制。由数据可清楚地证实，与单独的成分相比，以相同剂量水平的组合物表现出增强的抑制TNF-a的活性。表1 获自Boswellia物种的多剂量乳香酸成分对鼠中性粒细胞中胞内TNF-α表达的影响
权利要求
1.一种协同组合物，包括浓度为约60%的乳香酸成分和浓度为约40%的多糖成分、可选地连同药用赋形剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述乳香酸成分和所述多糖成分获自 Boswellia 物种。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述乳香酸成分包括乳香酸、乙酰基-β-乳香酸、11-酮-β-乳香酸和乙酰基-11-酮-β-乳香酸。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述多糖成分包括半乳糖、阿拉伯糖、D-葡糖醛酸和4-0-甲基-葡糖醛酸阿拉伯糖基-半乳聚糖。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述药用赋形剂选自包括抗粘附剂、粘合剂、 涂布剂、崩解剂、填充剂和稀释剂、调味剂、着色剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂以及它们的组合的组。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物被配制成选自包括液体、锭剂、糖锭、粉剂、颗粒、胶囊、片剂、贴剂、凝胶、乳液、膏剂、洗剂、牙膏、滴剂、混悬液、糖浆、酏剂、植物剂和营养剂的组中的剂型。
7.一种用于制备协同组合物的方法，所述组合物包括浓度为约60%的乳香酸成分和浓度为约40%的多糖成分、可选地连同药用赋形剂，所述方法包括以下步骤由Boswellia物种获得乳香酸成分和多糖成分；合并浓度为约60%的所述乳香酸成分和浓度为约40%的所述多糖成分、可选地连同药用赋形剂，以获得所述组合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述乳香酸成分包括β-乳香酸、乙酰基-β-乳香酸、11-酮-β-乳香酸和乙酰基-11-酮-β-乳香酸。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述多糖成分包括半乳糖、阿拉伯糖、D-葡糖醛酸和4-0-甲基-葡糖醛酸阿拉伯糖基-半乳聚糖。
10.一种用于向下调节/抑制促炎标记物的方法，所述方法包括给予需要其的受试者组合物的步骤，所述组合物包括浓度为约60%的乳香酸成分和浓度为约40%的多糖成分、 可选地连同药用赋形剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述乳香酸成分和所述多糖成分获自 Boswellia 物种。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述受试者是动物，包括人类。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述促炎标记物选自包括TNF-a、IL-Ιβ、 IFN- γ、氧化一氮和LTB4的组。
14.一种用于向下调节/抑制PGE2的方法，所述方法包括给予需要其的受试者组合物的步骤，所述组合物包括单独的多糖成分或多糖成分与乳香酸成分的组合、可选地连同药用赋形剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述多糖成分和所述乳香酸成分获自 Boswellia 物种。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述受试者是动物，包括人类。
17.一种膳食补充剂，包含权利要求1和/或权利要求14中的所述的组合物。
全文摘要
本发明提供了一种用于向下调节促炎标记物的组合物。该组合物包括特定浓度的获自Boswellia物种的乳香酸成分和多糖成分，与单独的乳香酸成分和多糖成分相比，该组合物表现出其活性的增强。本发明进一步包括多糖成分单独或与乳香酸成分组合在抑制PGE2中的应用。
文档编号A23L1/30GK102218075SQ201010275989
公开日2011年10月19日 申请日期2010年9月1日 优先权日2010年3月2日
发明者安贾莉·潘迪, 穆罕默德·马吉德, 萨朗·巴尼, 贝纳·巴特 申请人:穆罕默德·马吉德