专利名称：microRNA标准化的内参基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及microRNA标准化的内参基因及其用途。
背景技术：
微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA分子，它们在基因调控网络中起重要作用。在血清、血浆、唾液、尿液、乳液等体液中，miRNA高度稳定地存在于细胞外。miRNA与多种疾病有关，已经在多种病变条件下检测到miRNA，尤其是循环miRNA的异常表达，该病变条件包括癌症、糖尿病、心脏衰竭、急性心肌梗死和组织损伤等。在某些病理情况下，尤其在像癌症这样的疾病中，miRNA，特别是循环miRNA的表达谱可能随生理和病理条件的变化而发生显著变化。这些研究表明，miRNA作为分子诊断和预后的非侵入性生物标志物有着广阔的发展前景。近年来已有若干种方法被用于定量测量临床样本中的miRNA，如Solexa测序法、qRT-PCR法和microarray法，上述方法的准确性在很大程度上取决于使用的参照基因。参照基因可以是一个基因或者基因的组合，并且在多种实验条件和不同样本集中都稳定表达。在临床应用中，需要将miRNA作为生物标志物的检测标准化，使检测过程可在任何实验室重复。然而，在进行miRNA的定量检测时，原材料量的变化、样品的采集和储存方法不同、RNA的提取和酶解效率的不同，都可能导致潜在的偏差和量化的误差；小体积样本中的总RNA的量很低，甚至低于分光光度法准确定量的极限。上述问题都严重影响了 miRNA定量分析的准确性和可靠性。理想的miRNA标准化的参照基因应该具备下述条件:`
I)在所有样本中和实验条件下都稳定地表达；2)表达量可以与考察对象进行比较；3)具有与考察对象相似的属性，如RNA稳定性、大小等。迄今为止,标准化测量样本中miRNA时,对参照基因的选择都还停留于经验,还未确定出符合上述标准的参照基因。近年来出现了用人工合成的非人类(如线虫)miRNA作为miRNA检测标准化的外源性对照，但是，外源性对照不能纠正样本采集的差异，所以并不是理想的选择。同时，一些内源性基因常被用作组织/细胞miRNA检测的内参基因，比如5SrRNA、18SrRNA和U6等，但是由于这些基因不是miRNA，不能代表miRNA的组分，而且这些基因的提取、反转录和PCR扩增的效率可能与miRNA有所不同。因此，这些基因也不是最理想的选择。目前尚无研究对miRNA标准化的最佳参照基因进行系统性的鉴定和评估，因此，本领域迫切需要开发能够作为microRNA标准化的参照基因，并建立检测miRNA，特别是循环miRNA的有效标准化方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种作为microRNAs标准化的内参基因及其用途。
本发明的另一目的是提供一种筛选内参基因的方法及其应用。在本发明的第一方面，提供了一种微小核糖核酸(microRNA)或其对应的核酸序列或互补序列的用途，其中，所述的microRNA选自下组:let_7d、let_7g、let_7i,或其组合，它们用作microRNAs标准化的内参基因。在本发明的第二方面，提供了一种用于microRNA标准化的内参基因集，所述内参基因集包括选自下组2种或3种microRNA所构成的组合:let_7d、let_7g、和let_7i。在另一优选例中，所述的内参基因集由let_7d、let_7g、和let_7i三种microRNA构成，或所述的内参基因集至少包含上述三种microRNA。在另一优选例中，所述的内参基因集还包括选自下组的一种或多种辅助内参基因:U6、RNU44、RNU48、miR-16、miR-191、miR-103、miR-23a、GADPH、^ -actin、或其组合。在本发明的第三方面，提供了一种miRNA标准化定量的方法，包括步骤:(I)测定样本中待测miRNA的绝对浓度；(2)将步骤(I)获得的待测miRNA的绝对浓度与样本中内参基因的绝对浓度进行比较，获得待测miRNA的相对浓度。在另一优选例中，步骤(2)所述的内参基因选自下组:let-7d、let-7g、let-71、或
其组合。在另一优选例中，所述内参基因集包括选自下组3种microRNA所构成的组合:let_7d、let_7g、和 l et_7i。在另一优选例中，在步骤(2)中，将待测miRNAs的绝对浓度与样本中let_7d、let_7g和let_7i的总浓度进行比较。在另一优选例中，所述的样本选自下组:血液、血浆、血清、体液、细胞、组织、器官、或其组合。在另一优选例中，所述的样本来自正常个体或疾病个体。在另一优选例中，所述的待测样品来自人或非人哺乳动物，较佳地为人。在另一优选例中，所述的内参基因还包括选自下组的一种或多种辅助内参基因:U6、RNU44、RNU48、miR-16、miR-191、miR-103、miR_23a、GADPH、^ -actin、或其组合。在本发明的第四方面，提供了一种可用于定量检测微小核糖核酸的生物芯片，所述的芯片包括固相载体以及位于所述固相载体上的检测点，所述检测点用于特异性地检测本发明第一方面所述的微小核糖核酸(microRNA)或其对应的核酸序列或互补序列，或用于检测本发明第二方面所述的内参基因集。在本发明的第五方面，提供了一种用于检测微小核糖核酸(microRNA)的试剂盒，所述试剂盒包含一容器以及位于所述容器内的测定内参基因或内参基因集的试剂或本发明的第四方面所述的芯片，其中，所述内参基因或内参基因集包括选自下组的I种、2种或3种microRNA:let_7d、let_7g、let_7i ；其中，所述的试剂选自下组:(a)特异性扩增所述内参基因的引物或引物对；(b)特异性与所述内参基因的核酸分子进行杂交的探针；其中，所述的芯片是核酸芯片，所述芯片具有特异性检测所述内参基因的核酸分子的检测点。在另一样优选例中，所述的内参基因集包括let_7d、let_7g和let_7i。在本发明的第六方面，提供了一种筛选microRNA标准化内参基因的方法，包括步骤:(1)获得疾病和正常样本，提取并定量样本中的RNA ；(2)对步骤(I)获得样本的microRNA进行测序,获得样本中microRNA的序列信息；(3)分析microRNA的稳定性,选择稳定性高于平均水平的microRNA,作为候选基因。在另一优选例中，所述方法还包括步骤(4):对步骤(3)获得的候选基因进行验证。在另一优选例中，步骤(4)所述的验证包括步骤:⑴用qRT-PCR技术，比较对照内参基因和步骤(3)获得的候选基因的稳定性；(ii)利用geNorm和NormFinder算法对对照内参基因和候选基因进行评估。在另一优选例中，步骤(4)之后还包括步骤(5):鉴定候选基因在极端条件下的稳定性和准确性。在另一优选例中，所述的极端条件选自下组:存在核糖核酸酶、酸性条件、碱性条件、或其组合。在另一优选例中，步骤(2)所述的测序包括步骤:将获得的样本中的microRNA，与固相载体上固定的测序探针进行杂交，进行固相桥式PCR扩增，形成测序簇；然后对所述测序簇用“边合成-边测序”法进行测序，从而获得样本中microRNA的序列。在另一优选例中，步骤(3)所述的分析包括步骤:使用geNorm和NormFinder算法分析microRNA的稳定性,选择方差最小的基因,作为候选基因。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1显示了在本发明的一个优选例中，筛选用于microRNAs检测的最优参照基因的流程。图2显示了采用Solexa测序筛选稳定参照基因的结果,其中，图2A显示用Solexa测序方法测定其miRNA水平结果；图2B显示选定的miRNAs的平均表达值(Solexa读数土标准误差)结果；图2C显示，用geNorm从25个基因中选择最稳定的参照基因结果；图2D显示用geNorm确定准确标准化的参照基因的最优数量结果；图2E显示用geNorm筛选最稳定的参照基因或者基因组合结果；图2F显示用NormFinder确定最稳定的参照基因结果。图3显示了用实时荧光定量PCR检测验证选定的候选参照基因的稳定性结果，其中，图3A为候选参照基因的表达水平结果；图3B显示用geNorm确定准确标准化的参照基因的最优数量结果；图3C显示用NormFinder确定最稳定的参照基因结果；图3D显示大量血清样本中最优参照基因的表达水平结果。图4显示了血清let-7d/let-7g/let_7i在各种极端条件下的绝对浓度和稳定性的特征；其中，图4A显示实时荧光定量PCR测量let-7d/let-7g/let-7i(n = 5)的动态范围和灵敏度结果；图4B显示血清体积与Ct值(n = 5)的相关性结果；图4C显示延时储藏后血清中let-7d/let-7g/let-7i的稳定性(n = 5)结果；图4D显示血清中其他RNAs的不稳定性(n = 5)结果；图4E显示核糖核酸酶降解后血清中let-7d/let-7g/let-7i的稳定性(n = 5)结果；图4F显示核糖核酸酶降解后血清中其他RNAs的不稳定性(n = 5)结果；图4G和图4H分别显示在酸性或碱性条件下let-7d/let-7g/let-7i的稳定性(n = 5)结果。图5显示了不同标准化方法对目标循环miRNAs的影响结果。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，对健康人和多种疾病患者体内循环miRNAs进行标准化，首次发现在众多的微小核糖核酸中，let_7d，let-7g, let_7i三个基因中的任意一个或其组合，均可用作miRNAs检测的内参基因，并具有极高的稳定性和准确度。在此基础上完成了本发明。具体地，本发明人 采用高通量Solexa测序方法，检测健康对照组和患者样本的血清miRNAs的表达水平,并采用geNorm和NormFinder两种算法,鉴定测序数据，得出最佳候选参照基因；采用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)进行验证性实验，在大量对照组和患者样本中检测最佳候选参照基因和常用的参照基因(U6、RNU44、RNU48等)，在大量健康对照组和不同疾病患者样本中，发现let-7d、let_7g、let_7i或其组合均可以作为内参基因。微小核糖核酸(miRNA)和循环miRNA微小核糖核酸是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，在进化上高度保守，广泛存在于动植物细胞中。微小核糖核酸在基因表达调控领域中起着重要作用，其序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使之成为信使RNA强有力的调控因子。微小核糖核酸的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在RNA水平对分子进行更迅速更有效调节的新方式，展现了细胞内基因表达调控全方位多层次的网络系统。某些miRNA即使在核糖核酸酶存在的情况下，也在体液中以高浓度和充分完整的形态循环，这些miRNA称为循环miRNA。循环miRNA之所以高度稳定，可能是因为:1.循环miRNA由微泡包裹保护；2.循环miRNA与蛋白(如Argonaute2蛋白、高密度脂蛋白和核磷蛋白I)相结合。本发明人经过广泛而深入的研究,在众多的内源miRNA中，let-7d、let-7g、I et-7 i，或其组合，均可以用作miRNA检测的内参基因。let-7d, let_7g, let_7i 的核酸序列见表 I。表ImicroRNA 名称~核酸序歹IjSEQ ID N0.Let-7dAGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUUI
Let-7gUGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU2
Let-7iUGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU3参照基因组合相对于单个参照基因的优势标准化通常采用单个参照基因，如GAPDH、a -tubulin或P -actin等等,但是这种参照基因的表达在不同条件下会发生显著变化，使用单个基因进行标准化，可能在对转录量的定量分析中导致显著错误。本发明提供了一种采用多参照基因进行标准化的方案，计算出let_7d、let_7g和let_7i的组合是用于标准化最佳的基因组合,三个miRNAs组合比两个miRNAs的组合或者单个miRNA,可使标准化更可靠。高通量测序本领域技术人员通常可以采用三种第二代测序平台进行高通量测序:454FLX(Roche 公司)、Solexa Genome Analyzer (Illumina 公司)和 Applied Biosystems公司的SOLID等。这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列，根据平台的不同，读取长度从25bp到450bp不等，因此不同的测序平台在一次实验中，可以读取IG到14G不等的碱基数。其中 ，Solexa高通量测序包括DNA簇形成和上机测序两个步骤:PCR扩增产物的混合物与固相载体上固定的测序探针进行杂交，并进行固相桥式PCR扩增，形成测序簇；对所述测序簇用“边合成-边测序法”进行测序。DNA簇的形成是使用表面连有一层单链引物(primer)的测序芯片(flow cell),单链状态的DNA片段通过接头序列与芯片表面的引物通过碱基互补配对的原理被固定在芯片的表面，通过扩增反应，固定的单链DNA变为双链DNA，双链再次变性成为单链，其一端锚定在测序芯片上，另一端随机和附近的另一个引物互补从而被锚定，形成“桥”;在测序芯片上同时有上千万个DNA单分子发生以上的反应；形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在扩增芯片的表面再次扩增，形成双链，双链经变性成单链，再次成为桥，称为下一轮扩增的模板继续扩增；反复进行了 30轮扩增后，每个单分子得到1000倍扩增，称为单克隆的DNA 簇。DNA簇在Solexa测序仪上进行边合成边测序，测序反应中，四种碱基分别标记不同的荧光，每个碱基末端被保护碱基封闭，单次反应只能加入一个碱基，经过扫描，读取该次反应的颜色后，该保护集团被除去，下一个反应可以继续进行，如此反复，即得到碱基的精确序列。在Solexa 多重测序(Multiplexed Sequencing)过程中会使用Index (标签)来区分样品，并在常规测序完成后，针对Index部分额外进行7个循环的测序，通过Index的识别，可以在I条测序甬道中区分12种不同的样品。筛选标准化内参基因的方法为了提供循环miRNAs标准化适合的参照基因，本发明还提供了一种筛选方案(见图1)，在一个优选例中，筛选方案包括三个主要的步骤:
第一步:采用Solexa测序筛选样本集,代表广泛的生理和病理条件,采用geNormNormFinder统计算法,对基因的稳定性进行排序，筛选最稳定的候选基因，在不同样本中用最小方差表示。同时筛选文献，确定常用的参照基因；第二步:结合上述两方面结果，形成最佳候选参照基因集。采用qRT-PCR检测所述最佳候选基因，利用geNorm和NormFinder两种统计方法评估候选基因的稳定性。接着，在更大的样本集中，进一步验证鉴定出的最稳定候选基因，即最佳参照基因；第三步:应用所述最佳参照基因，检测其绝对浓度，评估在各种极端条件下所述最佳参照基因的稳定性，并利用所述最佳参照基因，对检测目标miRNAs进行标准化。检测方法
本发明还提供了一种miRNAs标准化定量的方法，包括步骤:(I)测定样本中待测miRNAs的绝对浓度；(2)将步骤(I)获得的待测miRNAs的绝对浓度与样本中内参基因的绝对浓度进行比较，获得待测miRNAs的相对浓度。在本发明的一个优选例中，步骤(2)所述的内参基因选自下组:let-7d、let_7g、let_71、或其组合，较佳地，将待测miRNAs的绝对浓度与样本中let_7d，let_7g和let_7i的浓度进行比较。在另一优选例中，所述的待测样品包括:血清、血浆、血液、尿液、乳汁、细胞、组织、器官、或其组合。在另一优选例中，所述的待测样品来自正常个体和疾病个体。待测样品来自人或非人哺乳动物，更佳地为人。在本发明中，检测微小核糖核酸的方法没有特别限制，代表性来自包括(但并不限于):RT-PCR 方法、real-time PCR 方法、Northern blotting 法、Solexa 测序法、原位杂交(ISH)、恒温滚环扩增(RCA)、Solexa测序法或生物芯片方法。芯片本发明还提供了一种用于检测微小核糖核酸的生物芯片，所述的芯片包括固相载体以及位于所述固相载体上的检测点，所述检测点用于特异性地检测微小核糖核酸(let-7d、let_7g、let_7i，或其组合)或其对应的核酸序列或互补序列，或用于检测微小核糖核酸构成的内参基因集。该芯片包括以下组分:固相载体(如基片或微球)以及有序固定在固相载体上的寡核苷酸探针。本发明的检测芯片可以含有一种或多种，较佳地含有> 5种，更佳地> 10种，最佳地彡20种miRNA的检测点。所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片，未修饰的玻片、塑料片等。所述的寡核苷酸探针是生物素化或带荧光标记的探针。所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，放置过夜以固定，就可得到本发明的miRNA芯片。
试剂盒本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含测定内参基因或内参基因集的试剂或芯片，所述内参基因或内参基因集包括选自下组的I种、2种或3种microRNA:let_7d、let_7g、和 let-7i ；其中，所述的试剂选自下组:(a)特异性扩增所述内参基因的引物或引物对；(b)特异性与所述内参基因的核酸分子进行杂交的探针；其中，所述的芯片是核酸芯片，所述芯片具有特异性检测所述内参基因的核酸分子的检测点。在另一样优选例中，所述的内参基因集包括let_7d，let_7g和let_7i。本发明的主要优点(I)筛选的内参基因使得miRNAs标准化过程的准确度获得了极大地提高；(2)本发明的内参基因适用于各种实验条件；(3)本发明的内参基因稳定性高，且能够用于极端条件下。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。通用方法 1.从血清样本中提取RNA从每个捐助者身上收集静脉血液样本(约5ml)，置于血清分离管中。样本处理应在I小时内处理。室温下以800g离心10分钟，后在室温下以10，OOOg高速离心15分钟，以彻底去除细胞碎片。收集上清，储存于_80°C，以备分析用。混合若干个样本(每个5mL)创建血清株，用力搅拌，然后用TRIzol试剂(Invitrogen公司，卡尔斯巴德,美国加利福尼亚州)从50mL混合血清中提取总RNA。实时荧光定量PCR检测分析:从100 u L血清中用一步酚/氯仿纯化法提取总RNA。具体地，依次向100 u L血清中加入300 i! L无RNase的水、200 u L苯酚、200 u L氯仿。剧烈搅拌混合物，并在室温下培养15min。分层后,水层混合1.5倍的异丙醇和0.1倍的3mol/L醋酸钠(pH 5.3)。将混合液储存于_20°C，Ih ;在4°C下以16，OOOg离心分离得到RNA沉淀。用75%的乙醇清洗一次RNA沉淀,并置于室温下IOmin干燥。最后用20 y L无RNase的水溶解RNA沉淀，并储存于-80°C下，以备下一步分析用。2.Solexa 测序分析循环 miRNAs30个碱基对(bp)以下的小RNA分子经过PAGE纯化，使一对Solexa接头(adaptor)与其5’端和3’端相结合后，使用接头引物扩增17个循环后，从PAGE凝胶中分离出大约90bp的片段(小RNA+接头)。经纯化的DNA直接用于产生测序簇，按照制造商的说明使用Illumina Genome Analyzer分析器分析序列。将测序器生成图像文件处理为数
字数据。随后的程序包括:汇总生成数据、评估测序质量和深度、计算小RNA长度分布及过滤污染的读数。屏蔽结合序列后，参照基于Smith-Waterman算法的miRBase数据库16.0,对齐清洁的读数。只有与参照miRNA基因有相同序列和长度的候选基因，才能记为miRNA匹配型。最后，每个样本总的测序频率可以调试到100万的同等规模。3.采用实时荧光定量PCR检测方法定量测定循环miRNAs采用Taqman miRNA PCR试剂盒(Biosystems公司，美国加利福尼亚州福斯特城)进行循环miRNAs的定量测定。具体地，用AMV反转录酶(TaKaRa，中国大连)和茎环RT 引物(Applied Biosystems),将 5 U L 的总 RNA 反转录成 cDNA。用 TaqMan miRNA 探针(Applied Biosystems 公司)和 Biosystems7300 Sequence Detection System (AppliedBiosystems)，进行实时PCR。所有反应，包括无样本的对照组都重复三次。所有反应完成后，采用固定的阈值设置确定CT值。4.基因稳定性分析采用geNorm和NormFinder软件计算候选参照基因表达的稳定性。Solexa读数直接用于计算稳定性，用2_A ACT方法将Ct值转化成相对数量。geNorm软件通过基因的表达稳定值(M值)将测定基因进行排序，从而为标准化确定两个最稳定的参照基因或者多个稳定基因的组合。M值代表候选参照基因与同一试验小组中其他参照基因相比的平均比对差异。M值最低的基因被认为最稳定。通过逐步排除M值最高的基因，来确定每个候选基因稳定性的排序，再重新计算剩余基因的稳定性，直到发现最稳定的两个基因。此外，geNorm程序需通过计算两个序列的标准化因子(NFn和NFn+1)的比对差异(Vn/Vn+1)准确标准化，来确定参照基因的最优数量。大的差异值(> 0.15)意味着，计算更可靠的标准化因子需要再加入一个参照基因。如果差异值/\+1低于建议的阈值0.15，则不需再加入参照基因。NormFinder是一种基于模型的方法，通过组间(如肿瘤与正常)和组内的表达差异来确定候选参照基因的表达稳定性。该方法的主要目的是确定组间和组内的差异，并将这两种结果结合进每个 被考察基因的稳定值。根据此算法，稳定性最低的基因将会排在最前。在本研究中，利用NormFinder分析了两组对应不同类型的样本(疾病与对照)。实施例1Solexa测序并统计分析，筛选最稳定的参照基因本实施例首先生成和筛选Solexa测序的数据集，在各种生理和病理条件下确定稳定的循环miRNAs。共对23个样本进行了分析，符合下列条件的miRNAs被认为是稳定的:(I)在所有样本中都表达；(2)相对于测量平均值高表达；(3)通过测量标准偏差确定其表达水平稳定。根据这些标准，筛选出25个miRNAs作为候选参照基因，结果见图2。如图2A中所示，将Solexa读数转换成对数值，基因按平均表达水平和标准偏差排序；在筛选出的所有miRNAs中，25个miRNAs在数据集中具有较高的丰度(1g2-转化读数> 10)和较低的标准偏差(< I)。选取的25个miRNAs的平均表达值如图2B所示。采用两种不同的算法(geNorm和NormFinder)进一步评估候选参照基因的稳定性。通过两两比较，采用geNorm算法计算一个基因的平均表达稳定值(M值)，根据样本集表达谱的相似性排列推定的参照基因。25个候选参照基因的平均表达稳定值如曲线图2C所示，这条曲线是通过逐步回归排除不稳定的候选参照基因形成的，其中，let-7g是这组中表达最稳定的基因，其次是let-7i和let_7d。geNorm算法分析还可以评估可靠而准确的标准化所需的参照基因的稳定数。该算法采用名为V的度量，确定参照基因的最佳数值，其中两个序列标准化因素(NFn/NFn+1)成对变化(Vn/Vn+1)。Cut-off值为0.15视为临界值，V值低于0.15时则不需再添加参照基因。结果表明，let-7d、let-7g和let_7i的组合足以准确地规范数据集中的目标基因，产生V值为0.13，低于0.15的临界值(图2D)。三个miRNAs的组合(let-7d+let-7g+let_7i)在统计学方面优于二个 miRNAs (let-7d+let_7g、let-7d+let_7i或 let-7g+let-7i)或者单个基因 let_7d、let_7g 或 let_7i (图 2E)。此外，NormFinder算法采用固定的统计框架,不仅评估候选参照基因的整体表达变化，而且还分析了组间(例如，肿瘤与正常)差异。NormFinder软件单独评估基因表达的稳定性，评估结果与geNorm算法确定的结果基本相同。NormFinder算法选择let_7i作为标准化的最佳参照基因，其次是let_7d和let_7g(图2F)。实施例2筛选其他候选参照基因本实施例对上一实施例选定的三个候选参照基因与一些常用的参照基因做进一步的评估分析，常用参照基因包括，大分子RNA(GAPDH和P -actin)、小核RNA/核仁小分子 RNA (snRNA/snoRNA) (U6、RNU44 和 RNU48)及管家 miRNA (miR-16、miR-191、miR-103和miR-23a)。基于先前关于其在组织或细胞中稳定表达的报道，本发明人选取GAPDH和3 -actin。选取 U6、RNU44、RNU48、miR-16、miR-191、miR-103 和 miR_23a，是因其在测定组织/细胞miRNAs时，常用于参照基因。另外，对U6和miR-16给予特别关注，因其已被用作循环miRNAs标准化的参照基因。实施例3验证候选参照基因的稳定性本实施例用实时荧光定量PCR检测法，进一步评估21例癌症患者和35例健康对照组的样本中候选参照基因的表达模式。首先，对血清中let_7d、let_7g 和 let_7i 进行了检测，并以 “let-7d/let_7g/let-7i” 代表 let-7d、let-7g 和 let_7i 的组合。以 miR-20a、miR-21、miR_24 和 miR-25 作为对照。结果表明(图3)，参照基因的Ct值分布范围较广，介于20.9到33.0之间；GAPDH表达最高(平均 Ct±SE = 20.9±0.27);而 miR-25 表达最低(平均 CT±SE = 33.0±0.23)；^ -actin表达变异系数最大(SE = 0.35);而let-7d/let-7g/let-7i表达变异系数最小(SE = 0.15)，所有参照基因的平均数及Ct值的范围如图3A所示。然后，采用geNorm和NormFinder算法,按照候选参照基因表达的稳定性将其进行排序，基于geNorm算法,稳定值最低的let-7d/let-7g/let_7i具有最稳定的表达水平，从而被选作最佳的参照基因(图3B)，相比之下，miRNA实时荧光定量实验常用的参照基因miR-191、miR-103、U6、miR-16、RNU48 和 RNU44，排在 let-7d/let-7g/let_7i 之后，表明它们不能视为可靠的数据标准化的参照基因。MiR-21、miR-24和miR-25排名最低，表明，它们在血清中的表达模式确实在 疾病条件的反射中显著变化。NormFinder 算法证实了从 geNorm 得出的结果,表明 let-7d/let-7g/let_7i 是最稳定的参照基因，而miR-24的稳定性最低(图3C)。最后，在包含1278例健康对照、254例癌症患者、201例炎症性疾病患者和320例2型糖尿病患者的大样本集中，对选定的最佳参照基因，进行进一步验证。结果如图3D所示，所选定的参照基因在疾病条件独立、个体检测中，表达水平保持恒定。实施例4血清中循环let-7d/let-7g/let_7i绝对浓度的特征本实施例用qRT-PCR检测方法测量let-7d/let-7g/let-7i的线性动态范围和敏感度。将合成的单链let-7d/let-7g/let-7i连续稀释十个以上数量级，并用qRT-PCR检测方法测定，将所得到的Ct值对应输入的let-7d/let-7g/let-7i的量，绘制标准曲线。let-7d/let-7g/let-7i量减少导致平均Ct值相应增加，Pearson相关系数R =
0.992 (图4A)。研究结果表明，qRT-PCR检测方法测量let-7d/let-7g/let_7i至少有十个数量级的变化范围，在PCR反应中let-7d/let-7g/let-7i能够被检测到的量可少至
0.0lamol (相当于6000个拷贝)。此外，采用qRT-PCR检测方法研究了从多种量的血清中提取的RNA样本中let-7d/let-7g/let_7i表达水平的特征。结合所得到的Ct值对用于RNA提取的血清量作图，qRT-PCR检测显示血清量与Ct值之间存在良好的线性度(R = 0.9865)(图4B)。多个样本的结果表明，在少至10 y L的血清中可有效地检测并可靠地比较let-7d/let-7g/let-7i，通过参考标准曲线，计算出血清中 let-7d/let-7g/let-7i 的绝对浓度为 271.35±21.48fmol/L。实施例5血清中let-7d/let-7g/let_7i 的稳定性作为适用于临床试验的参照基因，血清中let-7d/let-7g/let_7i必须在合适的时间内保持稳定，耐受恶劣条件，从而适用于临床样本的常规处理。因此，在本实施例中，利用延期储存或在恶劣条件下处理后的血清，评估循环let-7d/let-7g/let-7i的稳定性，恶劣条件包括核糖核酸酶(RNase)降解，极端pH值和循环冻融等。首先，考察血清中let-7d/let-7g/let_7i存储在不同温度(室温、4 °C、-20 °C或-80°C)不同时间(1、2、3、7、14或30天)的稳定性。结果表明，储存时间(长期与短期)或储存条件(零度以下与高温)不同时，Ct值无显著差异(图4C)。与此相比，大分子量的 RNA ( P -actin、GAPDH 和 28s rRNA)和 snRNA/snoRNA (U6、RNU44、RNU48、snoRNA24、snoRNA38b、snoRNA43、snoRNA66和snoRNA74a)在室温下存放24小时内很快降解(图4D)。因此，血清中固有的RNase导致大分子量的RNA和snRNA/snoRNA快速降解，但是对循环let-7d/let-7g/let_7i 的影响较少。其次，向血清样本加入RNase后,循环let-7d/let-7g/let_7i对RNase的裂解表现相当大的耐受力，但是合成的let-7d/let-7g/let_7i则快速被降解(图4E)。RNase处理后血清中大分子量的RNA和snRNA/snoRNA的浓度也快速降低(图4F)。在次，还考察了酸性条件(pH = 2.0)或碱性条件(pH12.0)下血清miRNAs的稳定性，检测冻融条件对血清let-7d/let-7g/let-7i表达水平的影响。结果表明，在酸性或碱性条件培养4小时,血清中let-7d/let-7g/let_7i的表达水平不会大幅变化。此外，反复冻融血清样本8个循环，对血清中let-7d/let-7g/let_7i表达水平影响不大(图41)。综上所述，延期储藏、RNase处理、酸性/碱性条件和冻融对循环let-7d/let-7g/let-7i无显著影响,稳定性很高。实施例6不同标准化方法对miRNAs定量的显著影响本实施例考察miRNAs标准化采用稳定或不稳定参照基因的检测结果。已有研究明确证明循环miR-25、miR-214、miR-223和miR-483_5p为癌症患者血清中表达上调的致癌基因，本实施例选择这四个基因作为目标基因。采用实时荧光定量PCR检测和2_AACT方法，测定癌症患者和健康对照组血清中上述四种miRNAs相对表达水平，分别相对于血清体积、U6、miR-191或者let_7d、let_7g和let-7i的组合标准化，只认为其平均倍数变化> 2和P值< 0.05的miRNAs明显上调。结果表明，标准化方法确实显著影响变化倍数(图5)，具体地，相对于let_7d、let-7g和let-7i的组合(最稳定的参照基因)标准化，癌症患者血清中miR-25、miR_214、miR-223和miR-483-5p相对于正常对照显著上调。相对于血清体积标准化后，变化倍数趋势与相对于let-7d/let-7g/let-7i标准化后一致，但仅miR-223在癌症患者血清中表达显著增加。然而，相对于U6(最不稳定的参照基因)标准化后，癌症患者与对照组的血清中miR-25,miR-214,miR-223和miR-483_5p表达无显著差异。当使用稳定参照miRNAs标准化后显示，与非恶性肿瘤对照样本相比，癌症样本中miR-25、miR-214、miR-223和miR-483_5p表达上调,相对于miR-191标准化显示上述miRNAs的表达无明显变化。因此，使用适合的标准化的基因会提高结果的灵敏度和可重复性，而选择非最佳的参照基因可能导致结果 不准确。实施例7试剂盒本实施例提供了一种试剂盒，该试剂盒包含测定内参基因的试剂，所述内参基因包括:microRNA let_7d、microRNA let_7g、和 microRNA let_7i,其中，所述的试剂选自下组:(a)特异性扩增所述内参基因的引物或引物对；(b)特异性与所述内参基因的核酸分子进行杂交的探针。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种微小核糖核酸(HiiciX)RNA)或其对应的核酸序列或互补序列的用途，其中，所述的microRNA选自下组:let_7d、let_7g、let_7i,或其组合，其特征在于，它们用作microRNAs标准化的内参基因。
2.一种用于microRNA标准化的内参基因集，其特征在于，所述内参基因集包括选自下组2种或3种microRNA所构成的组合:let_7d、let_7g、和let_7i。
3.如权利要求2所述的内参基因集，其特征在于，所述的内参基因集由let-7d、let_7g、和let_7i三种microRNAs构成,或所述的内参基因集至少包含上述三种microRNA。
4.如权利要求2所述的内参基因集，其特征在于，所述的内参基因集还包括选自下组的一种或多种辅助内参基因:U6、RNU44、RNU48、miR-16、miR-191、miR-103、miR-23a、GADPH、& -actin、或其组合。
5.一种miRNA标准化定量的方法，其特征在于，包括步骤: (1)测定样本中待测miRNA的绝对浓度； (2)将步骤(I)获得的待测miRNA的绝对浓度与样本中内参基因的绝对浓度进行比较，获得待测miRNA的相对浓度。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的内参基因选自下组:let_7d、let_7g、let_71、或其组合。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，将待测miRNAs的绝对浓度与样本中let-7d、let_7g和let_7i的总浓度进行比较。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的样本选自下组:血液、血浆、血清、体液、细胞、组织、器官、或其组合。`
9.一种可用于定量检测微小核糖核酸的生物芯片，其特征在于，所述的芯片包括固相载体以及位于所述固相载体上的检测点，所述检测点用于特异性地检测权利要求1中所述的微小核糖核酸(microRNA)或其对应的核酸序列或互补序列，或用于检测权利要求2所述的内参基因集。
10.一种用于检测微小核糖核酸(microRNA)的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含一容器以及位于所述容器内的测定内参基因或内参基因集的试剂或权利要求9所述的芯片， 其中，所述内参基因或内参基因集包括选自下组的I种、2种或3种microRNA:let_7d、let_7g、let-7i ； 其中，所述的试剂选自下组: (a)特异性扩增所述内参基因的引物或引物对； (b)特异性与所述内参基因的核酸分子进行杂交的探针； 其中，所述的芯片是核酸芯片，所述芯片具有特异性检测所述内参基因的核酸分子的检测点。
11.一种筛选microRNA标准化内参基因的方法,其特征在于,包括步骤: (1)获得疾病和正常样本，提取并定量样本中的RNA; (2)对步骤(I)获得样本的microRNA进行测序，获得样本中microRNA的序列信息； (3)分析microRNA的稳定性,选择稳定性高于平均水平的microRNA,作为候选基因。
全文摘要
本发明涉及microRNA标准化的内参基因及其用途。具体地，本发明人结合Solexa测序、实时荧光定量PCR检测、文献筛选、统计分析方法，对大量取自健康对照组和不同疾病患者的样本进行研究，发现microRNA let-7d、let-7g、let-7i，或其组合能够作为microRNA标准化的管家基因，且与目前microRNA定量中最常用的参照基因(如U6、RNU44、RNU48和miR-16等)相比，具有极高的稳定性和准确度。
文档编号C12N15/113GK103205483SQ20121006568
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者张辰宇, 陈熹 申请人:北京命码生科科技有限公司