一种抗烟草马铃薯y病毒疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种烟草抗病毒疫苗的制备及应用，属于植物病害预防与保护领域。
【背景技术】
[0002] 马铃薯Υ病毒（PotatoVirusΥ,PVY)是马铃薯Υ病毒属（Potyviruses)的典型 代表，最早是1931年由K.M.Smith在马铃薯上首次发现。马铃薯Y病毒在自然条件下主要 依靠蚜虫传播，可以在世界范围内侵染茄科植物，是目前我国烟草生产中普遍发生的重要 病毒病之一。烟草感染马玲薯Y病毒后，表现出明显黄化、矮化、脉坏死、叶片斑驳、整株凋 萎，根系严重变褐、坏死，叶片失去烘烤价值，造成严重的减产、降质，直至绝产。
[0003] 利用病毒抗性基因进行病毒防治是作物抗病育种研究的重要研究手段，这些抗性 基因包括能诱发植物过敏反应或极端抗性的显性基因（R基因）。它们主要属于R基因核 酸结合位点-亮氨酸富集的重复序列超家族（nucleotidebindingsite,leucine-rich r印eat,NBS-LRR)，包括N、Rxl、Rx2和Sw-5基因等。其他类型的R基因则不诱发植物过 敏反应或极端抗性，但却能阻止病毒在植物体内的远距离扩散，包括RTM1和RTM2基因等。 隐性抗病基因编码的蛋白常常不能促进病毒的增殖和/或移动，而它们相应的显性感病基 因的功能则相反。迄今，已从多个植物物种中分离出多个隐性抗病基因，包括pvrl/pvr2、 moll/mol2、sbml、rym4/5、potl、rymvl、nsv和pvr2+pvr6 等。这些隐性抗病基因都编码真 核生物翻译起始因子（eukaryotictranslationinitiationfactor,elF)，包括eIF4E、 eIF4G以及它们的异构体。多项研究表明，PVY病毒Y端的病毒基因组连接蛋白（viral genome-linkedprotein,VPg)能通过与eIF4E家族成员中的一个蛋白相互作用来启动病 毒基因组的翻译，从而促进病毒的增殖。
[0004] 烟草PVY病毒目前还没有有效的防治药剂，生产上主要以预防为主，一些常规防 病毒药剂受环境等因素影响一方面很难对PVY病毒进行有效防治，另一方面过量使用易造 成大量的农药残留，对环境和其他生物安全具有很大危害。因此，防治效果好、安全性高的 生物药剂对烟叶生产中PVY病毒的防治具有重要意义。本发明基于烟草eIF4E基因，利用 pCaPVX440载体构建一种抗烟草马铃薯Y病毒的疫苗，用于马铃薯Y病毒的防治。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种抗烟草马铃薯Y病毒疫苗的制备方 法。
[0006] 为解决本发明的第一个技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种抗烟草马铃薯Y病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0008] 1)制备pCaPVX440-eIF4E-6质粒，其含有的eIF4E-6基因的DNA片段，该DNA片段 序列如序列表SEQIDNo. 1所不；
[0009] 2)将PCaPVX440-eIF4E-6质粒转化至脓杆菌中制备获得抗烟草马铃薯Y病毒疫 苗。
[0010] 优选地，步骤2)制得的抗烟草马铃薯Y病毒疫苗可以进一步扩增。
[0011] 所述pCaPVX440-eIF4E-6质粒的制备方法包括如下步骤：
[0012] 1)获得c-DNA扩增模板；
[0013] 2)扩增eIF4E-6基因，获得DNA片段；
[0014] 3)分别酶切所述DNA片段和pCaPVX440质粒；
[0015] 4)连接步骤3)酶切后的DNA片段和pCaPVX440质粒；
[0016] 5)转化步骤4)的连接产物并获得pCaPVX440-eIF4E_6质粒。
[0017] c-DNA模板为从烟草中提取RNA，然后通过反转录获得c-DNA扩增模板。
[0018] 扩增eIF4E_6基因的方法为如下：以步骤1)获得的c_DNA为模板、以上游引 物：PVX-BF :CCTTCGAACTGATACCAGCTGGCTATAC(序列如SEQ ID N0 :2所示）和下游引物： PVX-MR :GCACGCGTGCCTCATTGAGTCGTCATG(序列如SEQ ID N0 :3所示）来扩增eIF4E-6基因， 获得eIF4E-6基因的DNA片段。其中上游引物和下游引物分别加入BstB I和Miu I酶酶 切位点。优选地，扩增获得的eIF4E-6基因片段可以连接至用于克隆的T载体，以提高酶切 效率。
[0019] 步骤3)中获得酶切后的eIF4E-6基因DNA片段，可以通过酶切扩增获得的 eIF4E-6基因DNA片段获得，也可以通过酶切连接有eIF4E-6基因DNA片段的T载体来获 得。
[0020] 本发明方法制备的抗烟草马铃薯Y病毒疫苗中的目标片段是通过比对分析烟草 基因组中eIF4E基因家族成员后选择的eIF4E-6基因特异序列，以该片段制备的抗烟草马 铃薯Y病毒疫苗可以特异地降解eIF4E-6基因，从而阻断其与PVY病毒的互作，减少PVY病 毒在烟株内的复制，达到防治烟草PVY病毒的目的。
[0021] 本发明的有益效果如下：
[0022] 本发明方法制备的抗烟草马铃薯Y病毒疫苗适于烟草PVY病毒的预防及防治，对 于烟叶生产过程中PVY病毒引起的病害防治具有重要的实用价值。与现有技术相比，本发 明具有以下的技术优势和积极效果：
[0023] 1、特异性强：本发明方法制备的抗烟草马铃薯Y病毒疫苗可以特异地降解 eIF4E-6基因，从而阻断其与PVY病毒的互作，减少PVY病毒在烟株内的复制，达到防治烟草 PVY病毒的目的。
[0024] 2、安全性好：可以有效减少化学农药防治对环境及生物的危害及影响，属于生防 范畴，不属于转基因，不存在转基因安全性问题。
[0025] 3、操作简便快速：抗烟草马铃薯Y病毒疫苗，稀释后在烟草大棚苗期可以直接利 用喷壶喷施烟苗，进行烟草PVY病害预防。
[0026] 4、成本低：抗烟草马铃薯Y病毒疫苗进行PVY病毒的预防，可以有效减少人工、机 械防病成本。
【附图说明】
[0027] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0028] 图1示出PCR扩增eIF4E-6基因片段的电泳检测图片。
[0029] 图2示出PCaPVX440载体和目的基因片段双酶切的电泳图片。
[0030] 图3示出eIF4E-6-PVXVIGS重组载体菌落PCR验证的电泳图片。
[0031] 图4示出不同处理组LJ911烟苗接种PVY病毒后发病情况照片。
[0032] 图5示出荧光实时定量PCR检测eIF4E_6基因转录水平及PVY病毒量扩增曲线。
[0033] 图6示出荧光实时定量PCR检测接种PVY病毒后各种处理烟叶中eIF4E-6基因和 PVY病毒表达量。
【具体实施方式】
[0034] 为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说 明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具 体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0035] 实施例1:
[0036] l.c-DNA模板的制备
[0037] 应用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini kit提取烟草LJ925鲜叶片RNA，利用 TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0试剂盒逆转录合成c-DNA作为模板。具体操作参见试剂盒的 说明书。
[0038] 2.eIF4E_6基因的扩增
[0039]在0· 5mL的PCR管中加入 10XPCR缓冲液（Buffer) 2.5μL、lOpmol/μL的 P