一种过量表达atp酶的基因工程醋酸菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌及其 构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 食醋是全球消费量最大的调味品之一，其主要成分是醋酸，而醋酸不仅是食品工 业最重要的辅料，而且是食品、医药、化工、纺织等领域广泛应用的化合物之一。醋酸菌 (Aceticacidbacteria)是一类能将乙醇氧化成醋酸等产物的细菌，有些还能氧化葡萄糖 为葡萄糖酸，在医药、食品等领域应用广泛。醋酸菌是革兰氏阴性菌，化能异养型，严格好 氧，最常见是醋杆菌属（Acetobacter)葡萄糖杆菌属（Gluconobacter)以及葡糖酸醋杆菌 属（Gluconacetobacter)等，其中醋杆菌属和葡萄糖杆菌属由于具有较高的乙醇氧化和醋 酸耐受能力，常用于醋酸的发酵生产。
[0003] 醋酸的发酵是在醋酸菌脱氢酶系的作用下完成从乙醇到醋酸的氧化反应，主要分 为二个阶段：乙醇在乙醇脱氢酶（AlcoholDehydrogenase，ADH)的催化下氧化成乙醛，接 着由乙醛脱氢酶（AldehydeDehydrogenase,ALDH)氧化成醋酸。发酵过程中菌体浓度、乙 醇浓度、菌体内催化酶的活性以及辅酶浓度，都是影响产酸速率的重要因素，而发酵过程中 醋酸的积累会对菌体活性产生较大影响。因此，提高醋酸菌的醋酸耐受性对于醋酸发酵工 业具有重大意义。近年来对于醋酸菌醋酸耐受性的研究中发现，各种耐酸机制大多需要消 耗ATP以实现对醋酸的耐受，因此高效快速的能量供应是醋酸菌在高酸发酵环境中进行正 常生理代谢的重要保障。其中，ATP酶（ATPase)在菌体能量代谢中起着重要的作用。
[0004] 三磷酸腺苷（Adenosinetriphosphate,ATP)是一种核苷酸（又叫腺苷三磷酸）， 是体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源，被誉为细胞内能量的"分子货币"，储 存和传递化学能，蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需它参与，可促使机体各种细胞的修 复和再生，增强细胞代谢活性。ATP酶，又称为三磷酸腺苷酶，是一类能将三磷酸腺苷（ATP) 催化水解为二磷酸腺苷（ADP)和磷酸根离子的酶，这是一个释放能量的反应。ATP酶可水 解ATP释放能量，其活性可反映细胞能量水平。生物体内大多反应都需要能量，醋酸菌发 酵乙醇产醋酸并将其体内的醋酸转运出体外都需要能量供应。有研究表明醋酸菌对醋酸的 耐受性与能量相关，但ATP酶在生物体内的浓度较低，制约了发酵的效率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种能够提升ATP酶表达量、减少能源消耗、提升生产效 率、降低生产成本的一种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌，本发明还提供该基因工程醋 酸菌的构建方法和应用。
[0006] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] -种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌的构建方法，包括如下步骤：
[0008]a.将乙醛脱氢酶启动子、ATP酶基因以及可在醋酸菌中稳定复制的质粒依次连 接，得到重组质粒；
[0009]b.将经过a步骤得到的重组质粒转入醋酸菌中，即得。
[0010] 本发明中，优选的方案为所述乙醛脱氢酶启动子来源于巴氏醋杆菌。
[0011] 本发明中，优选的方案为所述可在醋酸菌中稳定复制的质粒为pBBRRlMCS-4质 粒；所述重组质粒为pBBR-paldh-ATPase质粒。
[0012] 本发明中，优选的方案为所述a步骤具体包括如下步骤：
[0013] I .以巴氏醋杆菌基因组为模板，进行PCR反应，得到乙醛脱氢酶启动子序列，所 述乙醛脱氢酶启动子序列如序列SEQIDNo: 1所示；
[0014] 其中PCR反应所用到的引物对为：
[0015] Daldh-Ι:5'-CGCGGATCCCGGAATCCTGAAAACGGG-3' ；
[0016] Daldh-2:5'-AGCACTAGTCATGACCAATACCTTTGTATGT-3' ；
[0017]PCR反应的条件为：94-95°C预变性 5 分钟，94-95°C30 秒s，50-60°C20 秒， 72°C20-40 秒，25-30 个循环后 72°C10 分钟；
[0018]II.将质粒pBBRlMCS-4和步骤I得到的SEQIDNo:l序列分别用限制性内切酶 BamHI和SpeI处理，处理时间为2-12h、环境温度为37°C;纯化回收，将酶切纯化后的质 粒和SEQIDNo: 1序列按摩尔比1:0. 2-5混合，然后利用T4DNA连接酶进行连接反应，反应 温度为14_16°C，反应时间为4-12小时；接着将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中， 获得重组质粒pBBR-Paldh;
[0019] III.以巴氏醋杆菌基因组为模板，进行PCR反应，得到ATP酶基因序列，所述ATP 酶基因序列如序列SEQIDNo:2所示；
[0020] 其中PCR反应所用到的引物对为：
[0021] ATPase-Ι:5'-AGCACTAGTATGTGGTCTAAACCGATCACA-3' ；
[0022] ATPase-2 :5'-TGCTCTAGATCACGCTCTAGAGAGGCTG-3' ；
[0023]PCR反应条件为：94-95°C预变性 5 分钟，94-95°C30 秒，50-60°C20 秒，72°C1-2 分 钟，25-30个循环后72°C10分钟；
[0024]IV.将步骤II得到的重组质粒pBBR-Paldh、步骤III得到的ATP酶基因序列分别用 限制性内切酶SpeI和XbaI处理，处理时间为2-12h、环境温度为37°C;纯化回收，将酶切 纯化后的质粒和ATP酶基因序列按摩尔比1:0. 2-5混合，然后利用T4DNA连接酶进行连接 反应，反应温度为14-16°C，反应时间为4-12小时；然后将连接产物转入大肠杆菌DH5α 感受态中，获得重组质粒pBBR-Paldh-ATPase。
[0025] 本发明中，优选的方案为所述b步骤中采用电激转化法将a步骤得到的重组质粒 转入醋酸菌中。
[0026] 本发明中，优选的方案为所述b步骤中的醋酸菌选自葡糖杆菌、醋杆菌和葡糖酸 醋杆菌。
[0027] 本发明还提供由上述构建方法得到的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌。
[0028] 本发明还提供该过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，所述醋酸 发酵以乙醇或含有乙醇的酒醪为原料。
[0029]本发明中，所述的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，具体包 括如下步骤：将过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在培养基中进行扩繁培养，然后将扩繁 培养后的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌和原料一起置于发酵罐中，进行发酵；具体的， 所述醋酸发酵的方式可以为分批发酵、补料分批发酵或分割发酵。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0031] (1)本发明通过构建含有ATPase的重组质粒并转入醋酸菌中，获得过量表达ATP 酶的基因工程醋酸菌，从而提高醋酸菌体内乙醇转化为醋酸过程和生长代谢所需要的能 量。
[0032] (2)本发明利用乙醛脱氢酶启动子控制重组质粒中ATP酶的表达，实现了乙醛脱 氢酶和ATP酶的同时合成，具有协同效果。当培养基中不含有乙醇时，该启动子不进行ATP 酶的重组表达，提高了菌体的稳定性，并且，通过比较原始菌株和基因工程菌株生长曲线， 发现基因工程质粒对菌体生长没有影响。
[0033] (3)利用该基因工程醋酸菌以乙醇为主要原料进行醋酸发酵具有发酵延迟期短， 发酵速率尚等优点，从而减少能源消耗、提尚生广效率、提尚企业效益。
[0034] 下面结合附图及【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
【附图说明】
[0035]图1为本发明实施例1的基因工程醋酸菌和原始菌株在第一组发酵培养基中的醋 酸发酵比较数据图；
[0036]图2为本发明实施例1的基因工程醋酸菌和原始菌株在第二组发酵培养基中的醋 酸发酵比较数据图；
[0037]图3本发明实施例2的基因工程醋酸菌和原始菌株以含乙醇8%、醋酸浓度10g/L 的培养基中的醋酸发酵比较数据图；
[0038]图4本发明实施例3的基因工程醋酸菌和原始菌株以苹果酒为原料的醋酸发酵比 较数据图；
[0039] 其中，图1-图2中，基因工程醋酸菌为含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase 的Acetobacter pasteur ianus CGMCC 3089基因工程菌，原始菌株为Acetobacter pasteurianus CGMCC 3089菌株；
[0040] 图3中，基因工程醋酸菌为含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacter acetiCGMCCl. 1809基因工程菌，原始菌株为Acetobacter acetiCGMCCl. 1809菌株；
[0041] 图4中，基因工程醋酸菌为含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的Gluconobacter oxydans