一种构建基因工程盐霉素高产菌株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术工程领域，涉及一种通过基因工程手段提高盐霉素产量的方 法，具体涉及白色链霉菌的基因组靶向修饰技术，理性优化盐霉素合成通路中的正效调控 基因和转运蛋白基因，以提高盐霉素的产量，属于工业微生物技术领域。
[0002] 背景介绍
[0003] 放线菌是一种高GC含量的革兰氏阳性菌。放线菌与人类的生产和生活关系极为 密切，由于其具有旺盛的次级代谢通路，医用、农用抗生素中约有70%由各种放线菌产生。 链霉菌是放线菌中的一大类进化较为高等的种系，具有繁多的次级代谢通路，能够产生诸 多天然活性产物，其中不乏具有抗菌、抗肿瘤、抗寄生虫等药用价值的物质，极具医学应用 前景。近些年的研究已经表明，链霉菌中与次级代谢产物合成相关的诸多基因大多成簇存 在，具有一定的空间紧密型，其中包括调控基因、合成基因、后修饰基因和抗性基因等。随着 研究的深入，链霉菌中次级代谢的调控合成机制已经越来越清晰。
[0004] 盐霉素（Salinomycin)又叫沙利霉素，是由日本科研制药株式会社于1968年从白 色链霉菌（Streptomycesalbus)的培养基中发现的一种聚醚类天然活性物质。1971年，盐 霉素产品在日本进行了实用性研究，结果表明其对鸡球虫具有良好的杀灭作用，且不易产 生耐药性，满足国际安全性标准。如今，盐霉素的药用价值已被全球各国认可，在全世界范 围内作为抗球虫药剂被广泛应用。而近几年的研究又发现，盐霉素素能够高效且特异性的 杀死上皮肿瘤干细胞，其抗肿瘤活性是紫杉醇的几十倍，这充分说明盐霉素具有极大的医 药应用前景。另外，盐霉素还是我国生产、使用和出口的主要兽用抗生素之一，其经济价值 也是极具潜力。
[0005]目前，国内盐霉素生产菌株的选育主要还是依赖于一些传统手段，比如紫外诱变 和LiCl诱变等方法。这些方法虽然操作简单，然而长期使用这些诱变剂处理同一菌种，由 于突变的不定向性及突变的累积使得在获得高产的同时菌株在生活能力、产孢量等方面会 明显减弱，并且多次诱变往往导致较高的负突变率和抗性饱和，从而使得菌株改善的空间 不足，且经过诱变的生产菌株，稳定性较差，不适用于稳定的工业生产应用。随着代谢组学 相关研究的不断深入，越来越多的次级代谢合成调控通路被解析，从分子生物学角度对合 成通路的调控、合成及后修饰进行靶向改造，优化天然产物的合成路径，已经越来越多地应 用到了工业菌株改造中，这为高效稳定的工业生产菌株的获取提供了新的途径。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种通过基因工程手段获取盐霉素高产菌株的改造方法。其 原理是将盐霉素合成相关的正效基因进行倍增表达，优化盐霉素合成路径，实现盐霉素的 高产。
[0007] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种构建基因工程盐霉素高产菌株 的方法，该方法通过在白色链霉菌ZD11体内靶向提高正向调控因子和转运蛋白基因表达 水平，从而实现盐霉素高产的目的，具体包括以下步骤：
[0008] 第一步：以pfu高保真酶分别扩增目的基因slnR和slnT，并将两个基因分别连 接入含有链霉菌高效启动子P*的整合型载体PIJ8660和pS0K804,以获得两个重组质粒， 所述的两个重组质粒为pIJ8660-p*-slnR和pS0K804-p*-slnT;或为pIJ8660-p*-slnT和 pS0K804-p*-slnR;所述链霉菌高效启动子为表达强度高于原生启动子表达强度的启动子； 所述基因slnR的氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示，基因slnT由slnTI和slnTII两个基因 融合而成，slnTI的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示，slnTII的氨基酸序列如SEQIDNo. 3 所示。
[0009] 第二步：利用接合转导方法将步骤1获得的两个重组质粒导入野生型白色链霉菌 ZD11体内，使两个重组质粒整合进入其基因组中，得到双重组突变菌株，即盐霉素高产菌 株。
[0010] 进一步地，所述的链霉菌强效启动子为ermEp*启动子。
[0011] 进一步地，所述步骤2中的接合转导方法具体为：
[0012] (2. 1)将步骤1获得的两个重组质粒分别经化学转化导入到两个E.coliET12567 中，培养后，分别获得含有重组质粒的E.coliET12567。
[0013] (2· 2)将其中一个含有重组质粒的E.coliET12567与液体培养获得的链霉菌 ZD11菌丝按照数量比10:1混合后，均匀涂布于含有20mMMgCl2、50mMCaCl2的新鲜固体 ISP4培养基表面；
[0014] (2. 3)30°C倒置培养18h后，在ISP4培养基表面涂布硫酸阿布拉霉素和萘啶酮酸， 继续倒置培养至长出链霉菌单克隆；所述硫酸阿布拉霉素的终浓度为50ug/mL，萘啶酮酸 的终浓度为25ug/mL;
[0015] (2. 4)将链霉菌单克隆转接至含有硫酸阿布拉霉素和萘啶酮酸的新鲜ISP4固体 培养基上，培养5-7天后，获得抗性菌株；
[0016] (2. 5)通过PCR对步骤2. 4获得的抗性菌株进行验证，筛选出成功组合的单重组突 变菌株；
[0017] (2. 6)将另一个含有重组质粒的E.coliET12567与步骤2. 5获得的单重组突变菌 株按照数量比10:1混合后，均匀涂布于含有20mMMgCl2、50mMCaClJUjf鲜固体ISP4培养 基表面，倒置培养至长出链霉菌单克隆；
[0018] (2. 7)重复步骤2. 4进行培养，通过PCR进一步对培养获得的抗性菌株进行验证， 筛选出成功组合的双重组突变菌株。
[0019] 本发明的有益效果在于：采用链霉菌常用强效启动子ermEp*重构盐霉素合成基 因簇中的途径特异性调控基因slnR和盐霉素转运蛋白slnT的表达盒，并利用整合型载体 对野生型盐霉素生产菌株的分子改造，实现将盐霉素合成相关的正效基因倍增表达的目 的，使盐霉素产量提升60 %，摇瓶产量达到16g/L。另外，为了提高重组突变株得率，对链霉 菌传统接合转导操作进行了优化，通过提高MgCl2浓度至20mM，并同时添加50mMCaCl2，是遗 传操作难度较大的白色链霉菌接合转导效率明显提高。最终成功实现盐霉素高产突变株的 获得。
【附图说明】
[0020] 图1为白色链霉菌中靶向倍增盐霉素合成正相关基因表达盒的构建示意图，将 slnR基因和slnT基因共同过表达以后，获得高产突变株白色链霉菌。
[0021] 图2为筛选到的两株高产突变株白色链霉菌ZD21和ZD22与野生型白色链霉菌 ZD11盐霉素产量的对比。
[0022] 图3为不同MgCl2、CaCl2浓度配比对接合转导效率的影响，20mMMgCl2、50mMCaCl2 时接合转导效率最高。
[0023] 图4为利用不同启动子对目的基因slnR和slnT进行改造，盐霉素产量对比。结 果表明，强效启动子ermEp*使盐霉素产量提升幅度最大，为最佳启动子。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1:本实施例构建基因工程盐霉素高产菌株，具体的操作步骤如下：
[0025]第一步：构建整合型重组质粒pIJ8660 -ermEp*-slnR和pS0K804 -ermEp* -slnT〇
[0026] 以pfu高保真酶分别扩增目的基因slnR和slnT，经测序验证无误后，分别用限制 性内切酶消化后，与限制性内切酶消化过的载体PIJ8660 -ermEp*和pS0K804 -ermEp*进 行连接。强效启动子的核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示。
[0027] 所述基因slnR的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，基因slnT由slnTI和slnTII 两个基因融合而成，slnTI的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，slnTII的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示
[0028] 第二步：重组质粒导入野生型白色链霉菌，获得双重组突变菌株。
[0029] 2. 1构建重组质粒
[0030] 2. 1. 1将两个重组质粒分别经化学转化导入到两个E.coliET12567中。
[0031] 2. 1. 2将含有重组质粒的E.coliET12567均转接至5mL含有硫酸阿布拉霉素、氯 霉素、卡那霉素的液体LB培养基中过夜培养；所述硫酸阿布拉霉素浓度为50ug/mL，氯霉素 浓度为25ug/mL，卡那霉素浓度为50ug/mL;
[0032] 2. 1. 3将过夜培养后得到的E.coliET12567培养液按照体积比1:100转接至 50mL含有硫酸阿布拉霉素，氯霉素，卡那霉素的液体培养基中，37°C，200rpm的摇床中培养 2 -3h，至0D6。。~0· 4 -0· 6。离心收集E.coliET12567;所述硫酸阿布拉霉素浓度为50ug/ mL，氯霉素浓度为25ug/mL，卡那霉素浓度为50ug/mL;
[0033] 2. 1. 4用新鲜液体LB培养基，对E.coliET12567菌体清洗3次，清除细胞表面残 留的抗生素，获得两个含有重组质粒的E.coliET12567。