[0034] 2. 2液体培养获得链霉菌ZD11菌丝
[0035] 2. 2. 1将ISP4固体培养基上生长良好的野生型白色链霉菌，取下1cm2表层菌丝接 入不含玻璃珠的TSB培养基中，置于30°C，250rpm的摇床中培养。
[0036] 2. 2. 2摇床培养20h，加入适量玻璃珠后，继续培养4h，备用。
[0037] 2. 3将其中一个含有重组质粒的E.coliET12567与步骤2. 2获得的链霉菌菌丝按 照数量比10:1混合后，均匀涂布于含有20mMMgCl2、50mMCaCl2的新鲜固体ISP4培养基表 面。
[0038]2. 430°C倒置培养18h后，在该培养基表面覆盖适量的硫酸阿布拉霉素和萘啶酮 酸后，继续倒置培养至长出链霉菌单克隆。所述硫酸阿布拉霉素的终浓度为50ug/mL，萘啶 酮酸的终浓度为25ug/mL;
[0039] 2. 5将链霉菌单克隆转接至含有适量硫酸阿布拉霉素和萘啶酮酸的新鲜ISP4固 体培养基上（硫酸阿布拉霉素的终浓度为50ug/mL，萘啶酮酸的终浓度为25ug/mL)，培养 5 - 7天后，获得抗性菌株；
[0040] 2. 6刮取菌丝接至含有玻璃珠的TSB液体培养基中，30°C，250rpm的摇床培养24h， 以供PCR验证，通过PCR对步骤2. 5获得的抗性菌株进行验证，筛选出成功组合的单重组突 变菌株；
[0041] 2. 7将另一个含有重组质粒的E.coliET12567与步骤2. 6筛选出的单重组突变菌 株按照数量比10:1混合后，均匀涂布于含有20mMMgCl2、50mMCaClJUif鲜固体ISP4培养 基表面；
[0042] 2. 8重复步骤2. 5进行培养，通过PCR进一步对培养获得的抗性菌株进行验证，筛 选出成功组合的双重组突变菌株。
[0043] 本实施例所用的各种培养基具体如下：
[0044] LB培养基：0· 5 %酵母浸提物，1 %蛋白胨，1 %NaCl。
[0045] ISP4培养基：购自BD公司的成品培养基，按照说明书灭菌后使用。
[0046] TSB培养基：3%胰蛋白胨大豆肉汤（TSB)。
[0047] 比较例1 :由于接合转导过程中所使用的MgCl2、CaCl2浓度对接合转导效率影响较 大，为了确定最佳的浓度比例以获得最高接合转导效率，进行MgCl2、CaCl2*度梯度筛选实 验，结果表明：20mMMgCl2、50mMCaCl2S最佳浓度配比。实验结果如图3所示。
[0048] 比较例2 :本比较例分别采用强效启动子ermEp*、kasOp*和自身启动子slnRp*/ slnTp*按照实施例1中的步骤，获得3个双重组突变菌株。发酵检测不同启动子对盐霉素 产量的影响。结果表明ermEp*为最佳启动子。实验结果如图4所示。
[0049] 实施例2 :本实施例通过发酵验证实施例1中获得的双重组突变株确实为盐霉素 高产株，具体的操作步骤如下：
[0050] 1.将实施例1获得的双重组突变菌株，在固体ISP4培养基上培养5 - 7天，至气 生菌丝生长茂密厚实，刮取约lcm2的菌丝接入含有玻璃珠的液体TSB培养基中，置于30 °C， 250rpm的摇床中培养24h。
[0051] 2.将培养好的菌液转接100D6。。至含有玻璃珠的种子培养基中，置于30°C，250rpm 的摇床中继续培养29h。
[0052] 3.将含培养完成的种子培养基按照1:10的比例转接入含有玻璃珠和5 %大豆油 的发酵培养基中，置于30°C，250rpm的水浴摇床中发酵培养5天。
[0053] 4.向发酵培养基中补加5%大豆油，后置于30°C，250rpm的水浴摇床中继续发酵 培养5天。
[0054] 5.取发酵完成的发酵液，按照1:9的比例与甲醇混合后超声破碎细胞，12000rpm 离心lOmin，取上清，利用0. 45um有机滤膜过滤后，利用高效液相色谱（HPLC)检测发酵液中 盐霉素含量。
[0055] 本实施例中所使用的高效液相色谱检测方法为：
[0056] 有机相为HPLC级乙腈，水相为0.2um滤膜过滤后的超纯水，有机相：水相为91:9， 所用检测色谱柱为C1S色谱柱，流速为0. 4mL/min，检测波长为210nm，样品检测时间为 45min〇
[0057] 所用的各种培养基具体如下：
[0058] TSB培养基：3%胰蛋白胨大豆肉汤（TSB)。
[0059] 种子培养基：4%葡萄糖，3%黄豆饼粉，1 %酵母粉，0.2%碳酸钙，pH天然。
[0060] 发酵培养基：4.5%糊精，0.6 %小麦胚芽粉，0.3 %黄豆饼粉，0.3 %KC1，0.3 % ΝΗ4Ν03,0· 04%K2HP04,0. 1%CaC03,10%大豆油，ρΗ7· 0 - 7. 2。
[0061] 根据以上结果，在白色链霉菌ZD11体内，盐霉素合成相关的正效调控基因slnR和 slnT对盐霉素的产量有直接、显著的影响。当对正效调控基因进行倍增表达（使用自身启 动子），盐霉素产量有所提升，说明其对盐霉素产量有直接影响；当进行强效倍增表达（使 用强效启动子），盐霉素产量大幅提升，说明其对盐霉素产量的影响显著。同时，针对某些 链霉菌菌株接合转导效率低下的情况，本发明中也对其进行了分析优化，即MgCl2、CaCl2* 度对效率影响较大，不同的浓度配比，将会导致不同的结合转导效率。而针对白色链霉菌 ZD11，MgCl2、CaCl2*度最佳配比为MgCl220mM，CaCl250mM。
【主权项】
1. 一种构建基因工程盐霉素高产菌株的方法，该方法通过在白色链霉菌ZD11体内靶 向提高正向调控因子和转运蛋白基因表达水平，从而实现盐霉素高产的目的，其特征在于， 所述方法具体包括以下步骤： 第一步：以pfu高保真酶分别扩增目的基因slnR和slnT，并将两个基因分别连接入 含有链霉菌高效启动子P*的整合型载体PIJ8660和pS0K804,以获得两个重组质粒，所 述的两个重组质粒为pIJ8660-p*-slnR和pS0K804-p*-slnT;或为pIJ8660-p*-slnT和 pS0K804-p*-slnR;所述链霉菌高效启动子为表达强度高于原生启动子表达强度的启动子； 所述基因slnR的氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示，基因slnT由slnTI和slnTII两个基因 融合而成，slnTI的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示，slnTII的氨基酸序列如SEQIDNo. 3 所示。 第二步：利用接合转导方法将步骤1获得的两个重组质粒导入野生型白色链霉菌ZD11 体内，使两个重组质粒整合进入其基因组中，得到双重组突变菌株，即盐霉素高产菌株。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的链霉菌强效启动子为ermEp*启动 子。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的接合转导方法具体为： (2. 1)将步骤1获得的两个重组质粒分别经化学转化导入到两个E.coliET12567中， 培养后，分别获得含有重组质粒的E.coliET12567。 (2. 2)将其中一个含有重组质粒的E.coliET12567与液体培养获得的链霉菌ZD11菌 丝按照数量比10:1混合后，均匀涂布于含有20mMMgCl2、50mMCaClJUjf鲜固体ISP4培养 基表面； (2. 3) 30°C倒置培养18h后，在ISP4培养基表面涂布硫酸阿布拉霉素和萘啶酮酸，继续 倒置培养至长出链霉菌单克隆；所述硫酸阿布拉霉素的终浓度为50ug/mL，萘啶酮酸的终 浓度为25ug/mL; (2. 4)将链霉菌单克隆转接至含有硫酸阿布拉霉素和萘啶酮酸的新鲜ISP4固体培养 基上，培养5-7天后，获得抗性菌株； (2. 5)通过PCR对步骤2. 4获得的抗性菌株进行验证，筛选出成功组合的单重组突变菌 株； (2. 6)将另一个含有重组质粒的E.coliET12567与步骤2. 5获得的单重组突变菌株按 照数量比10:1混合后，均匀涂布于含有20mMMgCl2、50mMCaCl2的新鲜固体ISP4培养基表 面，倒置培养至长出链霉菌单克隆； (2. 7)重复步骤2. 4进行培养，通过PCR进一步对培养获得的抗性菌株进行验证，筛选 出成功组合的双重组突变菌株。
【专利摘要】本发明提供了一种利用分子生物学手段改造白色链霉菌，获得盐霉素高产菌株的方法。首先利用启动子重构技术，将盐霉素合成基因簇中的正效调控基因slnR和转运蛋白基因slnT与ermEp*高效启动子连接，利用位点特异整合技术，将其整合插入白色链霉菌ZD11的基因组，定向优化盐霉素合成通路中的元件，获得稳定、高效合成盐霉素的高产菌株。采用本发明的方法，可以使盐霉素的发酵中产量提高60％，摇瓶产量达到16g/L。
【IPC分类】C12N15/76, C12N1/21
【公开号】CN105420266
【申请号】CN201510903801
【发明人】李永泉, 管文军, 李涵, 朱振洪
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月9日