一种开花提前的转基因植物的培育方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种开花提前的转基因植物的培育方法，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] MicroRNAs(miRNAs)是一种基本的、具有序列特异性的真核基因组的调节因子，通 常在转录水平或者转录后水平调节其靶基因的表达。成熟的miRNAs是一系列小的非编码单 链小分子RNA，在动物中，它通常由20-22核苷酸组成，而在植物中通常是20-24个核苷酸大 小。MicroRNAsUiRNAs)在植物的生长发育以及植物对环境的适应方面发挥了重要的作用， 成为近几年研究的热点。
[0003] miR172最早在拟南芥中通过小RNA测序获得的，由于它极度保守，在多种植物中也 被相继发现。之前的大多数研究显示miR172通过抑制一系列AP2-like类转录因子参与植物 花器官的形成与开花时间调控。然而，到目前为止，对大豆miR172家族的研究相对较少，尚 没有以大豆miRl72基因培育转基因植物的方法。
【发明内容】
[0004] 针对以上问题，本发明提供了一种开花提前的转基因植物的培育方法，所采取的 技术方案如下：
[0005] 本发明的目的在于提供一种开花提前的转基因植物的培育方法，该方法的步骤如 下：
[0006] 1)克隆待转基因的如体序列，并构建含有待转基因如体序列序列的表达载体；
[0007] 2)将步骤1)构建的表达载体导入到农杆菌中，并利用所得农杆菌侵染宿主植物；
[0008] 3)验证步骤1)中前体序列对靶基因的降解位点，并筛选鉴定步骤2)中被侵染的宿 主植物，获得转基因阳性单株；
[0009] 4)通过表型验证转基因株系。
[0010] 优选地，步骤1)所述前体序列，是含有大豆miRNA172a基因保守区域的序列，核苷 酸序列如SEQIDNO. 1所示;所述克隆所用引物的序列如SEQIDN0.2和SEQIDN0.3所示； 所述表达载体，还含有草丁膦抗性基因。
[0011] 优选地，步骤1)所述表达载体，所用质粒PCAMBIA3301。
[0012]优选地，步骤2)所述农杆菌，为农杆菌EHA105;所述宿主植物，为拟南芥。
[0013] 优选地，步骤3)所述靶基因为基因Glyma03g33470。
[0014] 更优选地，所述验证降解位点是验证miRNA172a对祀基因Glyma03g33470的降解位 点，是提取侵染宿主植物的总RNA合成cDNA，再利用核苷酸序列如SEQIDN0.5和SEQID NO. 6所示的引物进行两轮巢式PCR，并通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，回收目的 DNA片段后，再将回收产物连接到pGM-T载体上，转化到大肠杆菌后进行测序鉴定。
[0 015 ]优选地，所述测序鉴定，是分析确定降解位点是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5'-端第十和第^ 碱基之间。
[0016] 优选地，所述靶基因，扩增靶基因所用引物的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8 所示。
[0017] 所述培育方法的具体步骤如下：
[0018] 1)以大豆基因组为模板，以如SEQIDN0.2和SEQIDN0.3所示的核苷酸序列为引 物，克隆如核苷酸序列如SEQIDN0.1所示含有大豆miRNA172a基因保守区域的序列，并利 用所得序列与草丁膦抗性基因、质粒PCAMBIA3301构建表达载体；
[0019] 2)将步骤1)构建的表达载体导入到农杆菌EHA105中，再利用所得农杆菌侵染拟南 芥，获得侵染植物；
[0020] 3)提取步骤2)侵染植物中的总RNA并合成CDNA，再利用核苷酸序列如SEQIDN0.5 和SEQIDNO.6所示的引物进行两轮巢式PCR，并通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离， 回收目的DNA片段后，再将回收产物连接到pGM-T载体上，转化到大肠杆菌后进行测序鉴定， 分析确定所转序列对祀基因Glyma03g33470的降解位点是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5'-端第十和第^^一碱基之间，鉴定后通过草丁膦抗性筛选，PCR定量鉴 定，获得转基因阳性单株；
[0021] 4)通过与野生型对比验证步骤3)所得转基因阳性单株的开花时间是否提前，获得 转基因株系。
[0022] 以上所述培育方法在作物育种中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0023]本发明获得的有益效果是：
[0024] 本发明从大豆全基因组中克隆出miRNA172a(gma-miRNA172a)基因，并通过构建表 达载体将该基因转到拟南芥中成功获得转基因纯化植株及相应表型，该基因能够有效提前 拟南芥的开花时间。
[0025]利用本发明所提供的培育方法能够培育出具有大豆miRNA172a基因的开花提前的 拟南芥植株系。利用本发明所提供方法培育出的转基因植株，其长、短日照条件下开花时间 比对照组分别提前了 4和9天。本发明所提供的方法一方面验证了大豆miRNA172a基因的促 进提前开花的作用，同时，本发明确定了大豆miRNA172a基因在大豆体内的靶基因。
【附图说明】
[0026]图1为利用DNAman软件对大豆miR172家族成员的前体序列进行比对的结果。
[0027] 图2不同的生长天数、组织、光周期条件下的gma_miR172a和革E1基因Glyma03g33470 的表达情况；
[0028](其中，A为不同生长天数下不同miRNA172基因及靶基因Glyma03g33470的表达情 况;B为基因gma-miR172a和靶基因Glyma03g33470在植株不同部位的表达情况；C为大豆 miR172a的昼夜节律表达;D为大豆Glyma03g33470的昼夜节律表达）。
[0029] 图3利用5'RACE实验探索大豆miR172a对靶基因Glyma03g33470降解位点的位置。
[0030]图4为转基因植株的筛选鉴定结果；
[0031] (其中，A为T2代转基因植物中目的基因的PCR鉴定，其中M:DL2000plusDNA分子量 标准；1-20 :PPT抗性干涉拟南芥；21:野生型拟南芥；22 :水；23 :阳性质粒；B为抽提gma-miR172a转基因T3代植株RNA)。
[0032]图5以大豆miRNA172a的转基因拟南芥为实验组，野生型为对照组，比较转基因T3 代在长、短日照条件下的开花情况；
[0033](其中，A为不同日照条件下转基因植株的生长情况;B为不同日照条件下转基因植 株与对照植株的叶片生长情况;C为不同日照条件下转基因植株与对照植株的开花情况）。
【具体实施方式】
[0034]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0035]以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0036] 实施例1大豆miRNA172a的克隆与表达载体构建
[0037] 1.根据已知miRNA172a基因序列的保守区域，设计大豆miRNA172a引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。对由组织抽提的大豆全基因组DNA进行特异性PCR扩增；
[0038] 2.常温凝胶电泳分离产物，检测到大小约159bp的条带；
[0039] 3.回收条带纯化，再次用同一引物扩增后测序，结果如SEQIDN0.1。
[0040] 4.利用限制性内切酶Bgin、BstEII双酶切pCAMBIA3301质粒和pGM-T-miR172a质 粒，得到酶切片段；回收所得PCAMBIA3301酶切体系中的载体大片段和miR172a基因小片段， 利用T4DNA连接酶将miR172a基因替代原pCAMBIA3301质粒上的GUS基因，构建表达载体 pCAMBIA3301-miR172a;将得到的载体pCAMBIA3301-miR172a导入农杆菌EHA105,进行PCR检 测和酶切鉴定，用检测转化成功的农杆菌侵染植物，得到转基因植物。
[0041 ] 实施例2大豆miR172成员序列分析与比对
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