一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种共表达透明颤菌血红蛋白基因（vgb)和纤维素酶蛋白的重组毕 赤酵母系统的构建，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶是一类多组分酶的总称，能够将难以被生物利用的纤维素水解为利于被 生物利用的葡萄糖，因此被认为是潜力巨大的酶制剂之一。纤维素酶属于糖苷水解酶，能 够降解纤维素的纤维素酶系至少包括三类组分，分别为葡聚糖外切酶（CBH)，葡聚糖内切酶 (EG)以及β-葡萄糖苷酶（BG)。其中EG作用于纤维素非结晶区，水解β-1，4糖苷键，可 将线性纤维素多聚物截断生成大量纤维素小分子；CBH水解1，4-β-D-糖苷键，作用于线性 纤维素多聚物末端，生成纤维二糖分子；BG则将纤维二糖水解成为葡萄糖。通过纤维素酶 复合酶组分相互协同作用，可以将地球上最丰富的生物高聚物一纤维素，转化为微生物可 以轻易利用的葡萄糖，通过发酵产生生物燃料，用以缓解目前能源短缺问题。
[0003] 纤维素酶来源广泛，产生纤维素酶的生物包括昆虫、软体动物、原生动物、细菌和 真菌。然而，这些自产酶天生具有一定的配比缺陷，就目前工业应用最为广泛的产纤维素酶 真菌里氏木霉（Trichodermareesei)而言，其纤维素酶系中缺乏外切酶CBHII和β-葡 萄糖苷酶BG，导致其纤维素酶系酶解效率低下。另外，无论是来源于生物的自产酶系还是人 工制成的商业纤维素酶系，其中所含蛋白多达八十余种，甚至更多，导致核心酶组分比酶活 降低，这同样也是纤维素酶系酶解效率低下的原因。更为重要的是，不同木质纤维素材料中 纤维素、半纤维素以及木质素的比例有显著差异，导致同一类商业纤维素酶制剂或自产酶 并不能发挥最佳的酶解效果。所以，优化定制纤维素酶，使各组分达到最佳配比，才能在最 少酶用量时获得最优的水解效果。因此，为了优化定制纤维素酶，获得纤维素酶单酶组分十 分关键。
[0004] 近些年来，异源表达纤维素酶基因获得单酶组分是研究热点。Pichiapastoris 可以实现翻译后修饰作用，如糖基化、二硫键形成，使蛋白可以进行正确折叠，并获得有活 性的目标蛋白，另外，毕赤酵母并不产生内源性木质纤维素酶组分，且胞外蛋白成分并不复 杂，重组毕赤酵母菌发酵上清液甚至可以不经过纯化直接作为单酶制剂进行使用，因此，以 Pichiapastoris作为首选宿主菌，实现纤维素酶组分异源表达以获得高浓度和高纯度的 纤维素酶蛋白组分，已成为研究热点。
[0005] 资料表明，透明颤菌血红蛋白（VHb)产自严格好氧细菌透明颤菌，VHb是在透明颤 菌处于缺氧状态时的一种自动急救蛋白。关于其功能的假说表明VHb能在低氧环境中捕获 氧气，供给与呼吸作用相关的氧化酶，从而提高呼吸效率并促进ATP的生成。以毕赤酵母作 为宿主菌实现纤维素酶蛋白组分异源表达，其工业化的前提是必须在氧气供应不足的高密 度培养方面具有优质潜力，通过在毕赤酵母中实现VHb与纤维素酶蛋白的共表达，可以提 高重组毕赤酵母的产酶水平以及工业化应用潜力。
【发明内容】
：
[0006] 本发明的目的在于构建一种共表达透明颤菌血红蛋白基因和纤维素酶蛋白基因 的毕赤酵母。
[0007] 本发明提供的共表达VHb蛋白和葡聚糖内切酶II的毕赤酵母系统具体步骤如 下：
[0008] 1、EGII密码子偏向性优化：
[0009] 本发明实现了EGII密码子偏向性优化，其原始密码子序列如下：
[0010]SEQIDNO. 1
[0013] 密码子优化前EGII氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0014]SEQIDNO. 2
[0016] 本发明利用GeneDesigner(DNA2. 0,MenloPark,CA,USA)实现对SEQIDNO. 1 所 示的EGII核苷酸序列密码子偏向性优化，优化后核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0017] SEQIDNO. 3
[0020] 经过密码子优化后，EGII氨基酸序列与SEQIDNO. 2相同。
[0021] 2、构建表达载体pPIC9K_eg2 :
[0022] 以质粒pPIC9K作为载体，将优化后的EGII基因插入启动子A0X1下游，5'端酶切 位点为EcoRI，3'端酶切位点为NotI，构建pPIC9K-eg2表达载体。
[0023] 3、获取重组菌株：
[0024] 以SacI作为pPIC9K_eg2表达载体线性化位点，实现表达载体线性化，通过电转 化转入毕赤酵母。
[0025] 4、获得vgb基因：
[0026] 从NCBI中获取透明颤菌血红蛋白核苷酸序列（GenBankAccession No.M30794. 1)，在5'端添加EcoRI酶切位点，3'端添加NotI酶切位点，通过人工合成获 得目的基因。
[0027] 5、构建表达载体pPICZaA-vgb:
[0028] 以质粒pPICZαA作为载体，将vgb基因插入启动子A0X1下游，5'端酶切位点为 EcoRI，3'端酶切位点为NotI，构建pPICZaA-vgb表达载体。
[0029]6、获取共表达重组菌株：
[0030] 以SacI作为pPICZaA-vgb表达载体线性化位点，实现表达载体线性化，通过电 转化转入已含有eg2基因的重组毕赤酵母。
[0031]7、重组VHb蛋白活性检测：
[0032] 利用C0差光谱检测方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的VHb蛋白。
[0033]8、发酵产酶以及产酶水平比较：
[0034] 通过摇瓶发酵产酶，比较EGII重组菌株与EGII和VHb共表达菌株的产酶水平。
[0035] 本发明有益效果：
[0036] 1、本发明实现了里氏木霉葡聚糖内切酶II(EGII)基因密码子偏向性优化，偏向 对象为毕赤酵母菌，优化过程中降低了GC含量，由55. 9%降低为46. 2%，提高重组毕赤酵 母菌表达效率。
[0037] 2、本发明对里氏木霉葡聚糖内切酶II(EGII)基因密码子偏向性优化过程中，利 用RNA二级结构折叠软件RNAstructure对优化后的核苷酸序列实现二级结构折叠，并调整 碱基序列，使起始密码子端碱基呈开环结构，利于核糖体结合，提高重组毕赤酵母菌表达效 率。
[0038]3、本发明实现了纤维素酶蛋白与透明颤菌血红蛋白（VHb)在毕赤酵母中共表达， 提高了重组毕赤酵母菌在低氧高密度发酵过程中的产酶效率，提升重组毕赤酵母菌的工业 生产潜力。
【附图说明】
[0039] 图1 :实验思路与方案；
[0040] 图2 :eg2核苷酸序列优化前后对比；
[0041] 图3 :eg2氨基酸序列优化前后对比；
[0042] 图4 :pPIC9K_eg2表达载体图谱；
[0043] 图5 :1 %核酸胶电泳：
[0044] 1:SacI单酶切表达载体pPIC9K-eg2，
[0045] 2:EcoRI与NotI双酶切表达载体pPIC9K_eg2;
[0046] 图6:高产重组EGII蛋白菌株筛选；
[0047] 图7:pPICZaA-vgb表达载体图谱；
[0048] 图8:1 %核酸胶电泳：
[0049] 1:SacI单酶切表达载体pPICZaA-vgb，
[0050] 2:EcoRI与NotI双酶切表达载体pPICZaA-vgb;
[0051]pPICZaA-vgb构建成功，酶切后核酸电泳图
[0052] 图9:高产重组EGII蛋白共表达菌株筛选
[0053] 图10:菌落PCR验证共表达菌株：
[0054]P:毕赤酵母原菌，
[0055]E:EGII重组毕赤酵母菌，
[0056]VE1,VE25,VE31 等：EGII和VHb共表达菌株；
[0057] 图11 :全波长扫描C0气体处理后的EG II和VHb共表达菌株发酵上清液；
[0058] 图12:EGII重组菌株与EGII和VHb共表达菌株生长与产酶能力比较：
[0059]A:菌株产酶能力比较，
[0060] B:菌株生长能力比较。
【具体实施方式】
[0061] 本发明构建了一种共表达透明颤菌血红蛋白基因和里氏木霉葡聚糖内切酶II基 因的毕赤酵母，以提高重组菌株氧气利用效率，从而提高其菌浓以及产酶能力，构建思路如 图1所示。
[0062]