一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及糖化血红蛋白检测技术领域，尤其涉及一种检测糖化血红蛋白的一体 化试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一组病因和发病机制尚未完全明了的内分泌代谢疾病，目前发病率仅次 于心血管疾病和肿瘤。目前，糖尿病的发病率呈不断上升趋势，是严重威胁人类健康的世界 性公共卫生问题。传统的糖尿病诊断和治疗监测采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐 量试验等，但是血糖参数仅代表抽血时的瞬间血糖水平，而糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin, GHb)作为反映长期血糖水平的金标准，也是监测糖尿病治疗的重要指标 GHb是指结合了任何形式碳水化合物的血红蛋白（hemoglobin，Hb)。人类Hb主要是HbA (95%~97%)、!《^2(〈3%)、肋？(〈1%)。!《^中未结合糖的为肋40(90%)、结合糖的为肋八1 (5%~7%)即GHb。其中HbAl包括结合果糖-1，6_二磷酸葡萄糖的HbAlal、结合葡萄糖-6-磷 酸的HbAla2、结合未知碳水化合物的HbAlb和结合葡萄糖的HbAlc，HbAlc占 GHb的70%~ 90%。池六1(：在组织中由葡萄糖的游离醛基与HbA的β链N末端缬氨酸的氨基进行不可逆的非 酶促的反应，此过程称为糖基化，GHb的形成主要取决于血糖浓度及血糖与Hb的接触时间。 GHb可以反映最近2~3个月的平均血糖水平。2002年美国糖尿病协会已明确规定应定期检 测HbAlc，并将其作为监测糖尿病血糖控制的金标准。
[0003] GHb的测定方法有几十种之多，目前常用的基本上可分为两大类:一类是基于GHb 和Hb的电荷不同，如离子交换层析法、电泳法；另一类是基于Hb上糖化基团的结构特点，如 亲和层析法、免疫法和酶法等。多个研究表明不同的原理测定的结果存在差别，而糖尿病患 者治疗目标要求测定值不受测定方法的影响，因此在实验室里应用不同GHb测定方法所产 生的结果可比性非常重要。
[0004] 离子交换层析法主要有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC)和手工微柱法。此方法是基于血红蛋白β链N末端缴氨酸糖化后所 带电荷不同而建立。但由于此方法所使用的仪器昂贵，难以在比较基层的医院和实验室普 及;微柱法手工操作步骤繁琐，层析时间和微柱的质量不易控制，易产生操作技术误差，重 复性欠佳；而且干扰因素很多，尤其对pH值和温度的变化敏感，HbF及变异血红蛋白（ HbS、HbC、HbE等）对结果干扰，干扰程度根据柱的分离能力而定，所以一定要仔细观察图 谱。
[0005] 电泳法（以琼脂凝胶电泳为例)Hb于酸性缓冲液条件下（pH6. 0)在琼脂糖凝胶 上的电泳迀移取决于Hb在凝胶上的吸附情况及其所带的电荷。该方法标本用量少，分辨率 高，重复性好，有研究发现血糖值与HbAlc值有显著相关性，且结果不受温度及胎儿血红蛋 白的影响。另外，因为它可测定的Hb线性范围较宽（13.0-39.0g/L)，可发现异常Hb。该方法 的缺点是每次测定均需成批进行样本分析，速度比较慢，无法进行实时个体检测，自动化程 度较差，所测结果与技术人员扫描和对电泳的波峰判断有关，受主观因素影响，并且费用昂 贵，因此并不适合临床实验室常规使用。
[0006] 亲和层析法硼酸具有与整合在Hb分子上葡萄糖的顺位二醇基作可逆结合反应的 性质。通常使用的是间-氨基苯硼酸琼脂糖，将血样本加到层析柱后，所有的GHb与硼酸结合 留在柱中，非GHb直接流出层析柱;再加入高浓度也包含顺位二醇基的多羟基复合物(如山 梨醇），GHb与硼酸的结合被替换而被洗脱下来，分别测量两组分，并计算比值。亲和层析法 对变异血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对其他方法不敏感，但测定的是HbAi即6池总量。 另外，金标法和硼酸亲和层析法密切相关，操作均简便易行、快速准确、试剂稳定。据报道， 该法不受除HbS和HbC之外的任何血红蛋白变异体和降解产物的干扰，结果可靠，比较适用 于临床随时检测。
[0007] 免疫比浊法利用抗原、抗体反应的原理进行测定。GHb的β链N末端提供了一个容 易被抗体识别的抗原表位，可以用单克隆抗体或多克隆抗体，特异识别GHb的β链Ν末端最后 4~6个氨基酸组成的抗原表位，结合比色或比浊法，以GHb为标准，测定HbAlc的含量，再 测定Hb的含量，最后计算出HbAlc占总Hb的百分含量。此类方法只能作为判断糖尿病血 糖水平的指标，不可用于变异血红蛋白的研究。与其相比，免疫比浊法检测的方法更为简 单，不需要额外添加仪器，为临床提供了一种快速、准确、可靠、简便的常规方法，在临床应 用中有着更为广阔的前景。
[0008] 酶法全血经溶血处理后，用特异蛋白内切酶将Hb酶解消化成果糖氨基酸，再经果 糖氨基酸氧化酶作用下产生过氧化氢(hydrogen peroxide，H2〇2)，H2〇2的浓度与血液中GHb 的含量成正比，H2〇2在过氧化物酶的作用下与相应的色原耦联，从而根据颜色变化程度可得 H2〇2浓度，进而得知样本中GHb的含量；同时测定同一管消化液的总Hb浓度，计算GHb和Hb的 浓度比值，即为GHb结果。此法提供了一个像临床生化反应一样快速均一的反应系统（如葡 萄糖、谷氨酸氨基转移酶），有很好的精密度，可同时检测GHb和Hb，且与常规HPLC法和免疫 测定法有很好的相关性。
[0009] 离子捕获法应用抗原抗体反应原理，并联以荧光标志物，通过连接带负电的多阴 离子复合物，吸附到带正电的的纤维表面，经过一系列彻底清洗等步骤后，测定荧光强度变 化率，计算GHb浓度。其检测系统易于规范和重复，可减少操作技术误差，检测的敏感度和 特异度高，批内、批间变异系数小。有文献报道此法影响因素少，准确度高，回收率达98. 85%，交叉污染率<0.01%。该方法是近几年发展起来的新方法，采用自动分析仪，适用于批量 标本的检测。
[0010] 对基层医疗单位而言，上述几种方法，要么试剂、仪器成本高，要么操作复杂、要么 准确度低，稳定性差，且均不适合社区及基层医院。因此，需要对现有的测定糖化血红蛋白 比例的方法进行改进，提出一种新方法来解决这些问题。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供了一种检测糖化血红蛋白的一体 化试剂盒，只需要微量的全血样本，即可在3~5分钟内实现定量检测糖化血红蛋白的含量， 且结构简单，适合大规模生产。
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种使用上述试剂盒检测糖化血红蛋白的检测方法， 只需要微量的全血样本，即可在3~5分钟内实现定量检测糖化血红蛋白的含量，特异性好， 灵敏度高。
[0013]为解决上述技术问题，本发明的技术方案为:提供一种检测糖化血红蛋白的一体 化试剂盒，包括:反应分析垫、位于所述反应分析垫右侧的装有亲和反应液的亲和反应液微 孔、位于所述亲和反应液微孔右侧的装有清洗液的清洗液微孔和位于所述清洗液微孔右侧 的条码区。
[0014]优选的，上述检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒中，所述亲和反应液微孔的孔径 为5mm~6mm，高度8mm~10mm，内装有250yL亲和反应液。
[0015] 优选的，上述检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒中，所述亲和反应液包括如下浓 度的组分： 甘氛酸 20~150mmol/L， 氯化锌 2~50mmol/L， 氯化镁 5~50mmol/L， 氯化钾 50~500mmol/L， 叠氮化钠 0.1~1.5g/L， 蓝色苯硼酸染料 0.05~0.50 mmol/L， 甲醇 体积浓度为1.5~5.0%， 乙基苯基聚乙二醇质量体积浓度为0.05~0.1%。优选的，上述检测糖化血红蛋白的一 体化试剂盒中，所述亲和反应液的PH值为8.5~10.5。
[0016] 优选的，上述检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒中，所述清洗液微孔的孔径为5mm ~6mm，高度为8mm~10mm，内装有60~80yL的清洗液。
[0017] 优选的，上述检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒中，所述清洗液包括如下浓度的 组分： 三羟甲基氨基甲烷 20~200mmol/L， 叠氮化钠 0.1~1.5g/L， 聚乙二醇辛基苯基醚体积浓度为0.05~0.5%。
[0018]