用于血红蛋白测量和白细胞区分的不含氰化物的试剂及其方法

专利名称：用于血红蛋白测量和白细胞区分的不含氰化物的试剂及其方法
该发明关于一种用于测量血液中总的血红蛋白的试剂及其方法，其中该试剂不含氰化物和铁氰化物离子。此外，该试剂及其方法能够利用适当的电子设备在一个血样中对全部白细胞进行计数并确定至少两种白细胞。
血液样品中白细胞和血红蛋白的测量对诸如白血病和贫血症等疾病的临床诊断极为重要。为理解和解释该发明起见，定义下列术语。
1、血红蛋白----含在红细胞中，在血液中作为氧的载体。它是一种有色蛋白质，由四个血红素基团组成两个α和两个β珠蛋白链。
2、血红素基团----与氧相结合的能力依赖于血红素基团的存在。它也使血红蛋白具有特殊的颜色。血红素由一个称之为原卟啉的有机部分和一个铁原子组成。血红素中的铁原子在原卟啉环的中心与四个氮原子相结合。铁原子可以是亚铁状态，二价或是氧化铁状态，三价。
3、高铁血红蛋白(符号为Hi)----铁原子被氧化成三价铁的血红蛋白。替代术语为正铁血红蛋白和高价铁血红蛋白。
4、高铁血红蛋白氰化物----铁原子被氧化为三价铁并且已与氰化物离子相络合的高铁血红蛋白。替代术语为氰化正铁血红蛋白，氰化高铁血红蛋白和正铁血红蛋白氰化物。
5、血红蛋白类型----所有通常在循环血液中存在的铁血红蛋白衍生物。包括脱氧血红蛋白(Hb)、氧合血红蛋白(HbO2)、血红蛋白S和血红蛋白A2、碳氧血红蛋白(HbCO)、高铁血红蛋白(Hi)。
6、确定血液中的血红蛋白的NCCLS(临床试验标准国家委员会)参考步骤(H15-A Vol.4 No.3)。一个适用于通过高铁血红蛋白氰化物的方法测量血红蛋白浓度的所有临床试验人员和仪器、试剂和材料的生产者的标准过程。
7、血红蛋白测量----可根据血液的某些诸如比重和折射率等物理特性、血红蛋白分子的化学组成、血红蛋白结合氧、一氧化碳、硫等的能力以及血红蛋白的衍生物的波谱特性来测量全部血红蛋白浓度。
8、血红蛋白稳定剂----在血红蛋白测量期间，用于保持血红蛋白衍生物或所形成的色原稳定的物理化学特性(化学结构、光学密度等)的化学化合物。
通常用自动血液分析仪来对血液样本中的白细胞进行记数和区分，利用自动血液分析仪来对白细胞进行记数时，首先用一种等渗稀释剂将整个血液样品稀释，并加入一种红细胞溶解剂将样品中的红细胞溶解，得到含有白细胞的样品。然后，样品通过分析仪检测部分的一个细小的通道或一个精细的小孔。根据响应所通过的单个白细胞而产生的检测信号对白细胞进行记数，并对其进行区分。等渗透稀释剂的进一步说明包含在美国专利3,962,125、4,346,018和4,521,518中。红细胞溶胞剂的进一步说明包含在美国专利3,874,852、4,528,274、3,874,852、4,346,018和4,485,175中。
例如，美国专利4,346,018讲授一种等渗透多用途血液稀释剂和利用该溶胞剂系统区分两类白细胞的方法。美国专利4,485,175讲授了一种用季铵盐作为稀释剂和COULTERCOUNTER Model S-plus自动血液记数仪(佛罗里达迈阿密的考尔特(COULTER)公司的注册商标)对淋巴细胞、单核白细胞和粒性白细胞三类白细胞的区分的方法和试剂系统。美国专利4,485,175也讲授到，为形成一种用于测量血红蛋白的合适色原，也可用一种碱金属氰化物，例如氰化钾。
已经用氰化高铁血红蛋白的方法进行血红蛋白浓度的测量。根据这种方法，在血液样品中加入一种含有非离子表面活性剂的红细胞溶解剂，以降低红细胞的细胞膜引起的混浊度。被释放的血红蛋白被一种氧化剂的作用所氧化，诸如铁氰化钾氧化剂，以产生高铁血红蛋白。接着，氰化物离子与高铁血红蛋白相结合形成氰化高铁血红蛋白(HiCN)，可产生一种稳定的血红蛋白测量样品。用一个预定波长来测量氰化高铁血红蛋白样品的吸收。这种方法作为确定血红蛋白浓度的标准方法而被广泛采用。
虽然用氰化高铁血红蛋白的方法形成的化合物一旦形成后是一种极稳定的物质，但使用一种氧化剂对红细胞的氧化要用10多分钟的时间来完成使用Drabkins试剂的氧化。此外，红细胞的溶解、血红蛋白的稀释和红细胞及血小板膜的溶解比自动仪器所要求的慢一些。
为满足自动血液分析仪的时间要求，以往的方法是使用含有氰化物离子的红细胞溶解剂，它可以形成稳定的血色原，并具有一个类似于氰化高铁血红蛋白的吸收频谱。红细胞溶解剂也减少了细胞溶解、血红蛋白洗提和细胞膜溶解的时间需要。此外，必须用一种适当的方法，如次氯酸钠，对无用的液体进行去毒和处理，这是极其费力的工作。
由于这个原因，也利用另外一种所熟知的氧合血红蛋白方法。在氧合血红蛋白方法中，红细胞被用于溶解红细胞并释放血红蛋白的非离子表面活性物质所溶解。血红蛋白被释放，并以氧合血红蛋白的形式(HbO2)对其进行测量。用预定波长来测量氧合血红蛋白的吸收。因为氧合血红蛋白法不用氰化物，所以在处理试剂时不存在危险，也不需要进行麻烦的废液的处理操作。
然而，传统的氧合血红蛋白方法具有一个溶解剂不仅溶解红细胞，而且也使白细胞变得很小的缺陷。这对于吸收测量是有利的，因为它减小了白细胞引起的光散射，但在另一方面，它使得用溶胞剂对多于两种白细胞的测量变得非常困难。
为避免这个问题，使用氧合血红蛋白方法的自动血液样品分析仪，通过将一个样品送到两个检测部分为红细胞和白细胞的测定单独准备样本，一个用于红细胞的测量，一个用于白细胞的测量。然而，由于不仅需要两个单独的检测部分，而且也需要两套流水线来准备测量用的样本，所以这种方法有需要昂贵而复杂设备的缺点。
另外，使用氧合血红蛋白方法，不能精确地测量高铁血红蛋白含量高的血液样本，这是因为高铁血红蛋白并不是很容易地可以转化为氧合血红蛋白的。当使用对照血液时，高铁血红蛋白含量非常重要。对照血液通常用于控制自动血液分析仪的分析精度。对照血液通常存放在制冷状态，而且长时间具有稳定的血红蛋白浓度。然而在高于室温的储存期间，血液中的血红蛋白慢慢地转化为高铁血红蛋白。因此，当用氧合血红蛋白方法测量高于22℃储存的对照血液时，无法测量已转变为高铁血红蛋白的血红蛋白部分，因此经过几天之后，血红蛋白的测量值会变得慢慢低于初始值。
解决该问题的方法是使用一种十二烷基硫酸钠或等量的月桂基硫酸钠(SLS)、一种阴离子表面活性剂和Triton X-100----一种非离子表面活性剂在中性缓冲溶液(pH值为7.2)中的试剂来测量血红蛋白。这种方法由Oshiro等在《临床生物化学》的第15卷83(1982)中讲授。在该方法中，由SLS和Triton X-100的作用将红细胞溶解，而洗提出的血红蛋白被转化成SLS血红蛋白。因此，可以在不受高铁血红蛋白影响情况下进行血液中血红蛋白浓度的测量，而且因为不使用氰化物，没有必要进行对废液处置的特殊工艺。然而，不可能用该方法从同样处理的血液样本中进行白细胞区分和血红蛋白浓度的测量。在一个需要把洗提出的血红蛋白转化成SLS血红蛋白的SLS浓度下白细胞被溶解，使得不能与血红蛋白的测量同时进行。
美国专利5,250,437和5,242,832教授了这些问题的其他解决方法。这些公开出版物提到，为了测量血红蛋白的浓度，用合适的红细胞溶解剂通过可洗提红细胞中的血红蛋白的季铵盐的主要作用有选择地溶解红细胞。几乎同时，被洗提的血红蛋白变性，即其空间结构被改变，并且血红蛋白中的血红素铁被溶入试剂中的氧从二价离子氧化成三价离子，从而得到高铁血红蛋白。在美国专利5,250,437中，将适量的阳离子、非离子和两性表面活性剂加入红细胞溶解剂中来调整血红蛋白变性的程度，以得到稳定的血红蛋白。虽然没有明确血红蛋白的稳定机理，据推测，可能是多种具有不同分子结构的表面活性剂对血红蛋白的作用在预定的水平上导致变性程度的固定或转化为高铁血红蛋白的空间结构的变化。美国专利5,242,832通过添加一种血红蛋白稳定剂改善了美国专利5,250,437中的试剂。虽然没有弄清血红蛋白稳定剂的作用机理，但据推测血红蛋白稳定剂分子结构中的氮原子或酚式羟基中的氧原子的单个电子对可能与高铁血红蛋白中的血红素铁结合成螯合物，从而得到了稳定的血红蛋白。
另外其他的方法包括美国专利4,853,338，它使用pH值至少为11.3的阴离子表面活性剂来测量全部血红蛋白。离子表面活性剂可以作为一种碱，或在组合物中含有另外一种独立于表面活性剂的强碱给予碱性高铁血红素反应所要求的pH值。适合给予所要求的pH值的表面活性剂包括长链的烷基三甲基氢氧化铵。适合与给予所要求的pH值的独立成分相结合的表面活性剂包括两性离子表面活性剂和阳离子季铵卤化物。文献还提到，可以使用阴离子表面活性剂，例如烷基硫酸碱金属盐。然而，由于碱性高铁血红素的pH值，这种方法不是最理想的。
其他的方法还包括美国专利4,656,139和4,617,275，它们公开了一种防止血红蛋白转变成高铁血红蛋白的氧合血红蛋白方法。为了防止血红蛋白转变成高铁血红蛋白，把(2-吡啶基硫代-1-氧化)钠作为一种保护剂加到硼酸缓冲溶液中。此外，在试剂系统中，用EDTA-2K作为一种螯合剂。试剂系统的pH值为6～8，渗透压为240～310mOsm/kg。
另外，其他方法包括美国专利3,874,852公开的用一种由含有能充分溶解红细胞和血小板细胞并将血红蛋白转化成用于测量的血色原的季铵离子和氰化物离子的无铁氰化物的水溶液组成的试剂来进行血液中白细胞和血红蛋白的测量。
另外一种方法包括美国专利4,185,964中提到的用于血液分析仪的溶解试剂，快速破坏白细胞。试剂与血红蛋白反应或络合，形成一种具有足够稳定性的血色原，允许进行血红蛋白的光谱测量。
另外一种方法也包括美国专利4,800,167，它提到一种用来测量全血中的血红蛋白含量的试剂系统，全血包括分子量大约从10,000～360,000的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，pH值大于8，聚乙烯吡咯烷酮水溶液使全血中的血红蛋白变性，形成一种可以在大约575纳米的波长测量的稳定物质。
尽管有以上讨论的已有技术，但还有研制其他具有下列之一或多个特点的试剂的必要它应是无毒，当与一种并不有害影响血红蛋白稳定性的等渗的溶液一起使用时产生一种稳定血色原，并与其他血液测量参数相兼容，如白细胞计数和白细胞区分。
本发明涉及一种不含氰化物或铁氰化合物离子的试剂组合物和一种测量血液样品中的血红蛋白浓度的方法。试剂组合物包括至少一种从季铵盐、吡啶鎓盐和其混合物中选取的、含量能充分溶解红细胞并释放血红蛋白的溶胞剂，和一种能足够将释放的血红蛋白转换成高铁血红蛋白的防氧化剂。一般地，当溶胞剂和防氧化剂组合时，试剂组合物具有大约6～7.5的pH值。试剂组合物在5～115的pH值范围内能有效地充分溶解红细胞并释放血红蛋白，优选从pH9-11，最优选95-105。在试剂组合物中可以加入一种pH值调节剂，提供大约在5～115范围内的pH值。
本发明也涉及一种由以下步骤组成的测量血红蛋白浓度的方法让血液样品与一种不含氰化物或铁氰化物离子的试剂组合物发生反应，其中所述的试剂组合物包括(ⅰ)至少一种从季铵盐、吡啶鎓盐和其混合物中选择的、含量能够充分溶解红细胞并释放血红蛋白的溶胞剂，和(ⅱ)一种含量足能将释放的血红蛋白转换成高铁血红蛋白从而形成一种反应产物的防氧化剂；及测量所述反应产物的吸收来确定所述血液样品的血红蛋白浓度。一般地，当溶胞剂和防氧化剂组合时，试剂组合物具有大约6～75的pH值。试剂组合物在5～115、优选的是在9～11而最好的是在95～105的pH值范围内能有效地充分溶解红细胞并释放血红蛋白。在试剂组合物中可以加入一种pH值调节剂，提供大约在5～115范围内的pH值。
此外，本发明涉及一种能从同一血液样品与试剂组合物的反应产物中进行血红蛋白浓度测量和白细胞区分的试剂组合物和方法。试剂组合物包括至少一种选自季铵盐、吡啶鎓盐和其混合物的、含量能够充分溶解红细胞并释放血红蛋白的溶胞剂，和一种含量能有效地将释放的血红蛋白转换成高铁血红蛋白、从而形成反应产物的防氧化剂。一般地，当溶胞剂和防氧化剂组合时，试剂组合物具有大约6～7.5的pH值。试剂组合物在5～11.5、优选的是从9～11而最好是从9.5～10.5的pH值范围内能有效地充分溶解红细胞并释放血红蛋白。在试剂组合物中可以加入一种pH值调节剂，提供大约在5～11.5范围内的pH值。
在一种血液样品中测量血红蛋白浓度和区分至少两类白细胞的方法中，改进措施包括测量血液样品与本发明的试剂组合物反应所得的反应产物血色原的吸收和根据所述的反应产物区分至少两类白细胞。


图1示出了使用佛罗里达州迈阿密的考尔特公司制造的COULTER COUNTERModel S-plusⅣdiff仪器的正常全血的不同样品中血红蛋白浓度测量之间的相关性。x轴表示利用市售产品LYSESⅢ diff溶胞剂(佛罗里达州迈阿密的考尔特公司的注册商标)，由考尔特公司生产，而y轴表示使用实施例1的试剂，在图中表示为LYSE S4。
图2示出了图1中使用COULTER COUNTER Model S-plusⅣdiff仪器的异常全血的不同样品中血红蛋白浓度测量之间的相关性。x轴表示利用市售产品LYSES Ⅲ diff溶胞剂，而y轴表示使用实施例1的试剂，在图中表示为LYSE S4。
图3示出了利用实施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-plus Ⅳ diff仪器的正常全血样品中的白细胞(WBC)测量之间的相关性。x轴表示利用市售产品LYSES Ⅲ diff溶胞剂，而y轴表示使用实施例1的试剂，在图中表示为LYSE S4。
图4示出了利用实施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-plus Ⅳ diff仪器的异常全血的白细胞计数测量之间的相关性。x轴表示利用市售产品LYSES Ⅲ diff溶胞剂，而y轴表示使用实施例1的试剂，在图中表示为LYSE S4。
图5示出了利用实施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-plus Ⅳ diff仪器的正常全血的样品中白细胞的淋巴细胞种类测量之间的相关性。x轴表示利用市售产品LYSES Ⅲ diff溶胞剂，而y轴表示使用实施例1的试剂，在图中表示为LYSE S4。
图6示出了利用实施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-plus Ⅳ diff仪器的正常全血的样品中白细胞的单核细胞种类测量之间的相关性。x轴表示利用市售产品LYSES Ⅲ diff溶胞剂，而y轴表示使用实施例1的试剂，在图中表示为LYSE S4。
图7示出了利用实施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-plus diff仪器的正常全血样品中的白细胞的粒性白细胞种类测量之间的相关性。x轴表示利用市售产品LYSES Ⅲ diff溶胞剂，由考尔特公司生产，而y轴表示使用实施例1的试剂，在图中表示为LYSE S4。
本发明给出了一种测量血液中血红蛋白浓度的新试剂组合物和方法，其中试剂组合物中不含氰化物或铁氰化物离子。更优选的是，该试剂组合物和方法利用血液样品和试剂反应的产物能够进行血红蛋白的测量和至少两种白细胞的区分。
试剂组合物包括一种红细胞溶胞剂和一种防氧化剂，并且不含有毒物质，例如氰化物离子。进行这种测量的样液包括全部血液和用于校准和确定血液分析仪的正常性能的血液校准剂和血液对照品。校准剂和对照品可以取自于人或动物。
溶胞剂含有至少一种从季铵盐、吡啶鎓盐和其混合物中选取的成分。季铵盐具有如下的分子式
其中R1是C8～C20烷基、链烯基或链烯基基团；R2、R3和R4是C1～C8烷基、链烯基或链烯基基团；而X-是形成盐的根，如Cl、Br、I、PO4和CH3SO4。优选的是，R1表示一种具有至少12个碳原子的烷基，而R2、R3和R4表示具有1～6个碳原子的短烷基。吡啶鎓盐具有下列形式
其中，n是从7～19的整数，而X-是一个阴离子基团。
优选的溶胞剂是利用至少两种季铵化合物的混合物。更特殊地，优选的溶胞剂由其中R1代表一种具有12个碳原子的烷基的季铵化合物和其中R1代表一种具有14～16个碳原子的烷基的季铵盐化合物的混合物组成。最好，溶胞剂包括含有十四烷基三甲基溴化铵的十二烷基三甲基氯化铵。其它可以给出有效结果的季铵盐包括与十四烷基三甲基氯化铵相混合的十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基二甲基乙基溴化铵。
试剂组合物含有的有效含量能够从红细胞中释放血红蛋白的溶胞剂。优选的是，试剂组合物含有在5～80克/升范围内的溶胞剂。最好含溶胞剂量的范围是在15～35克/升。
用溶胞剂将血红蛋白从红细胞中释放出来，并且被释放的血红蛋白与一种防氧化剂发生反应。防氧化剂用来将释放的血红蛋白转化成血色原。所使用的防氧化剂的量能有效地把被释放的血红蛋白转化成血色原。如果使用的防氧化剂的量不足，那么与使用市售产品LYSE S Ⅲdiff溶胞剂相比，在COULTER COUNTER Model S-Plus Ⅳdiff仪器上血红蛋白到血色原的转化就不足以精确地测量血红蛋白的浓度值。优选地，防氧化剂的含量范围从0.1克/升到10克/升，更优选是从1克/升到3克/升。这些范围可以改变，因为防氧化剂的量与血液样品的体积之比取决于加入到血液样品中的稀释剂的量和加入到血液样品中的溶胞剂的量。
防氧化剂包括还原剂，例如抗坏血酸、亚磷酸、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠和具有还原特性硫的含氧酸碱金属盐，也包括其混合物，其中硫的氧化值从+2～+4。优选的是，防氧化剂包括亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和它们的混合物。最好，防氧化剂包括亚硫酸钠。
一般地，当溶胞剂和防氧化剂组合时，试剂组合物具有大约6～7.5的pH值。试剂组合物的pH值可以在大约5～11.5的范围内，优选的是9～11，最好是9.5～10.5。为了得到试剂组合物pH值范围内的一个pH值，应当加入一种pH调节剂。
适于给与所希望的pH值的pH调节剂的例子包括强酸，例如盐酸，和强碱，例如碱金属氢氧化物。令人满意的碱金属氢氧化物的例子包括氢氧化钠和氢氧化钾。次优选的例子包括氢氧化四烷基铵，烷基可以含有1～4个碳原子，例如氢氧化四丁铵。
已经测定，与使用市售产品LYSE S Ⅲ diff溶胞剂相比，在pH值5之下获取精确的血红蛋白浓度值时会出现严重问题。在pH值9之下，试剂组合物的稳定性降低。
试剂组合物应具有其它的特性，以使其与其预期用途相适合。这些特性包括具有220～370毫渗压单位的渗透压和大约3～11西门子的导电率。
已经发现，当使用一种已经混合并在70℃存放了几天的溶胞剂和防氧化剂的水溶液时，所测量的血红蛋白的浓度不同于使用溶胞剂和防氧化剂的水溶液新鲜混合物所获得的值。利用溶胞剂和防氧化剂的水溶液新鲜混合物测量得到的血红蛋白的浓度可以与使用LYSE S Ⅲdiff溶胞剂所获得的值相比较。更特殊地，当在升高的温度下存放溶胞剂和防氧化剂的混合物时，所测得的血红蛋白的浓度值明显低于当与使用LYSE SⅢ diff溶胞剂相比较所测得的血红蛋白的浓度。为解决这个问题，可以在血红蛋白浓度测量之前将试剂迅速混合。
最好在试剂组合物中加入一种防氧化稳定剂以提供试剂的稳定性。以能提供试剂组合物的稳定性的有效数量加入防氧化稳定剂。试剂组合物稳定性是使试剂能在长期存放之后提供精确的血红蛋白浓度测量。更特殊地，当本发明的试剂组合物存放了至少6个星期，并且是在存储温度升高的情况下，血红蛋白浓度的测量结果可以与LYSE SⅢ diff溶胞剂在经受同样的存储条件下的测量结果相比较。
合适的防氧化稳定剂是乙二胺四乙酸(EDTA)衍生物、柠檬酸、酒石酸、葡糖酸、糖酸和它们的化合物。优选的是，防氧化稳定剂选自乙二胺四乙酸二钠、乙二醇双(3-氨基-乙基醚)-N,N’-四乙酸(EGTA)、葡糖酸、N-(2-乙酰氨基)亚胺基二乙酸(ADA)和其混合物。最优选的稳定剂是EDTA。优选地，试剂组合物含有的防氧化稳定剂的范围在0.1～10克/升，更优选地是1～5克/升，最优选地是2克～4克/升。
为了说明防氧化稳定剂的有效性，在试剂组合物之间做了比较。试剂1是实施例1中的不加乙二胺四乙酸二纳的试剂。试剂2是实施例1中的试剂。试剂组合物在70℃条件下存放了7天。下列表格说明含有防氧化稳定剂的试剂组合物提供了可以与传统LYSE S Ⅲ diff溶胞剂相比拟的血红蛋白测量。
表一血红蛋白浓度试剂组合物样品 LYSE SⅢ试剂1 试剂2diff溶胞剂(无EDTA)(0.25％EDTA)新鲜血液1 15.5 14.4 15.3新鲜血液2 12.4 11.4 12.2测量血红蛋白浓度的方法涉及到血液样本与本发明的试剂组合物的反应所产生的色原的检测。测量血红蛋白浓度包括以下步骤让血液样品与不含氰化物离子的试剂组合物进行反应，所述的试剂组合物包括至少一种选自季铵盐、吡啶鎓盐和其混合物的溶胞剂，溶胞剂的含量能有效地充分溶解红细胞，并释放血红蛋白；其含量可有效地将释放的血红蛋白转化成血色原的防氧化剂，和一种提供5～11.5的pH值以形成反应产物的碱溶液；并测量所述的反应产物的吸收来确定所述血液样品的血红蛋白的浓度。
反应产物色原具有在500～600纳米测量可重复的吸收频谱。
图1示出了利用COULTER COUNTER Model S-Plus Ⅳ diff仪器的36种不同正常全血样品的血红蛋白浓度测量之间的相关性。x轴表示利用市售产品LYSE S Ⅲ diff溶胞液，而y轴表示使用在图中表示为LYSE S 4的实施例1中的试剂。所测试的血液样品数为36。正常的血液样品定义为无已知疾病的人的血液样品。
相关系数为r=0.9940，而回归线，y=1.0115x-0.1671，表示出可以接受的相关性和偏差。
图2示出了利用COULTER COUNTER Model S-Plus Ⅳ diff仪器的82种不同异常全血样品的血红蛋白浓度测量之间的相关性。x轴表示利用市售产品LYSE S Ⅲ diff溶胞液，而y轴表示使用在图中表示为LYSE S 4的实施例1中的试剂。异常血液样品从患一种或多种疾病的人获得，例如贫血症、白血病和异常血细胞数目症。
相关系数为r=0.9994，而回归线，y=1.0249x-0.256，表示出可以接受的相关性和偏差。
实施例1通过在高于室温的条件下将各成分混合制备下列组合物试剂。
数量(克/升)十二烷基三甲基氯化铵和十四烷基三甲基溴化铵32防氧化剂2EDTA二钠2.5Pluronic 25R8 Prill 1pH值调整到 10此外，本发明试剂组合物另外具有能够从同一种血液样品与试剂组合物反应产物进行血红蛋白浓度的测量和白细胞区分的优点。优选的是根据血红蛋白的测量可以至少进行两种白细胞的区分。这两种白细胞是淋巴细胞和粒性白细胞。最优选的是，可以进行至少三种白细胞的区分。这三种白细胞是淋巴细胞、单核细胞和粒性白细胞。
当测量血红蛋白的浓度和白细胞的区分时，溶胞剂的浓度被进一步调整到一个能以有效的含量，使其充分溶解红细胞，而不有害影响白细胞，从而可以从同一反应产物中进行血红蛋白浓度的测量和白细胞的区分。当使用一种季铵盐化合物时，溶胞剂的有效含量在5～80克/升的范围内。最好是在15～35克/升的范围内。
溶胞剂溶解红细胞而不有害影响白细胞。然而，有一定量的被溶解的红细胞的细胞残渣与白细胞保留在溶解的血液样品中。细胞残渣可能在白细胞的区分中产生背景噪声或细胞流动阻塞。可选择地，在试剂组合物中可含有一种能通过溶解细胞颗粒物质、蛋白质残留物消除干扰的有效含量的表面活性剂。表面活性剂的浓度范围从0.1到2.5克/升，而更优选的是从0.5到1.5克/升。合适的非离子表面活性剂包括普卢兰尼克(Pluronic)F、Pluronic L、Pluronic P、Pluronic R(Pluronic表面活性剂由新泽西的Parsippary的BASF公司生产)以及聚氧乙烯烷基苯酚。优选的表面活性剂是Pluronic 25R8 Prill和Pluronic F127，而最好的表面活性剂是Pluronic 25R8 Prill。
当进行血红蛋白浓度测量和白细胞区分时，防氧化剂的浓度是以能有效地将被释放的血红蛋白转化成血色原的量。如果使用过量的防氧化剂，回收的白细胞的值较低。
优选的是，防氧化剂的含量范围在0.1克/升到10克/升，更优选从1克/升到3克/升。这些范围可以改变，因为防氧化剂的量与血液样品的体积之比取决于加入到血液样品中的稀释剂的量和加入到血液样品中的溶胞剂的量。
当进行血红蛋白浓度和白细胞区分二者的测量时，当溶胞剂和防氧化剂组合时，试剂组合物具有大约6～7.5的pH值。试剂组合物的范围可从5～11.5，更为优选的是从9～11，而最好是从9.5～10.5。为得到在合适的pH范围之内的试剂组合物的pH值，可以加入一种pH调节剂。当pH值高于11.5时，在获取相应于使用市售产品LISE SⅢ diff溶胞剂获取的血红蛋白浓度时会出现严重问题。
当进行血红蛋白浓度和白细胞区分二者的测量时，防氧化稳定剂的浓度被调整到一个可以有效地提供试剂组合物的稳定性的量。更具体地，当本发明的试剂组合物存放了至少6个星期，并且是在温度升高的情况下，白细胞区分和血红蛋白浓度的测量结果可以与LYSE S Ⅲdiff溶胞剂在经受同样的存放条件下的测量结果相比拟。同样的防氧化稳定剂可用于血红蛋白浓度的测量和白细胞的区分。优选的是，试剂组合物含有防氧化稳定剂的范围在0.1～10克/升，而更优选的是从1～5克/升，而最好是从2～4克/升。
在测量血样中血红蛋白浓度和区分至少两种白细胞的方法中，本发明涉及到将血液样品与本发明的试剂组合物反应时所产生的反应产物的吸收测量的改进和依据所述的反应产物区分至少两类不同白细胞的改进。
更具体地，本发明的方法包括让血液样品与不含氰化物离子的试剂组合物进行反应，所述的试剂组合物包括至少一种选自季铵盐、吡啶鎓盐和其组合物的溶胞剂，溶胞剂的含量能有效地充分溶解红细胞并释放血红蛋白，一种含量可有效地将释放的血红蛋白转化成血色原、从而形成反应产物的防氧化剂，测量所述反应产物的吸收来确定所述血液样品的血红蛋白的浓度，并根据所述的反应产物区分至少两种白细胞。
一般地，当溶胞剂与防氧化剂相组合时，该方法的试剂组合物具有6～7.5的pH值。试剂组合物的pH值的范围大约从5～11.5，更为优选的是从9～11，而最好是从9.5～10.5。为了得到试剂组合物在pH值范围之内的一个pH值，应加入一种pH调节剂。
本领域的技术人员将认识到，通过本领域已知的技术可以完成白细胞的区分。Hamill的美国专利3,874,852 Ledis等人的美国专利4,485,175和Carter等人的美国专利4,528,274的讲授举例说明了这些技术。
实施例2一种全血样品由一种预定浓度的等渗平衡稀释剂稀释，稀释剂被调整到一个预定的pH值和渗透压。以在一定时间内至少引起白细胞种类的一种的单个血细胞体积的变化这样的方式将所得到的稀释血液与本发明的试剂组合物相混合，从而能够区分至少两类白细胞。此外，可确定测量白细胞记数。
图3示出了利用实施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-Plus Ⅳ diff仪器的36种不同正常全血样品的白细胞(WBC)测量之间的相关性。x轴使用市售产品LYSE S Ⅲ diff溶胞剂，而y轴使用在图中表示为LYSE S4的实施例1中的试剂。正常的血液样品定义为无已知疾病的人的血液样品。相关系数为r=0.9989，而回归线y=0.9899x+0.0074，表示出可以接受的相关性和偏差。
图4示出了利用实施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-PlusⅣdiff仪器的82种不同异常全血样品的白细胞(WBC)测量之间的相关性。x轴使用市售产品LYSE S Ⅲ diff溶液，而y轴使用在图中表示为LYSE S 4的实施例1中的试剂。相关系数为r=0.9996，而回归线y=0.9962x-0.0251，表示出较高的相关性和很低的偏差。
本发明的试剂组合物的另一个优点是它可用于作为使用传统测量方法进行血样中白细胞计数的一种试剂。当被用于白细胞计数的测量时，本发明的试剂组合物的试剂配方和用于血红蛋白浓度测量及白细胞区分的试剂组合物的配方一样。这提供了另一个优点能够使用同一种试剂组合物和根据血液样品与本发明的试剂组合物反应所产生的同种反应产物进行血红蛋白浓度、白细胞区分和白细胞计数的测量。
图5示出了利用实施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-Plus Ⅳ diff仪器的204种不同正常全血样品的白细胞的淋巴细胞测量之间的相关性。x轴使用市售产品LYSE S Ⅲ diff溶胞剂，而y轴使用在图中表示为LYSE S 4的实施例1中的试剂。相关系数为r=0.9885，而回归线y=0.9761x-0.729，表示出可以接受的相关性和偏差。
图6示出了利用实施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-Plus Ⅳ diff仪器的224种不同正常全血样品的白细胞的单核细胞测量之间的相关性。x轴使用市售产品LYSE S Ⅲ diff溶液，而y轴使用在图中表示为LYSE S4的实施例1中的试剂。相关系数为r=0.8528，而回归线y=0.9147x+1.3805，表示出较好的的相关性和可接受的偏差。
图7示出了利用实施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-Plus Ⅳ diff仪器的223种不同正常全血样品的白细胞的粒性细胞测量之间的相关性。x轴使用市售产品LYSE S Ⅲ diff溶液，而y轴使用在图中表示为LYSE S4的实施例1中的试剂。相关系数为r=0.9851，而回归线y=0.976x+2.0711，指示出较高的相关性和很低的偏差。
本发明的详细说明已在说明书中以说明为目的给出。不脱离本发明的精神和范围，本领域技术人员可对所给的细节做一些变化。
权利要求
1.用于测量血液样品中的血红蛋白浓度的不含氰化物离子的试剂组合物，包括a．包括至少一种选自季铵盐、吡啶鎓盐和其组合物的溶胞剂，溶胞剂的含量能有效地充分溶解红细胞并释放血红蛋白；和b．一种含量可有效地将释放的血红蛋白转化成血色原的防氧化剂。
2.权利要求1的试剂组合物，其中溶胞剂包括两种不同的季铵盐。
3.权利要求1的试剂组合物，其中防氧化剂选自亚磷酸、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠和其它具有还原特性硫的含氧酸碱金属盐，包括其混合物，其中硫的氧化值从+2～+4。
4.权利要求1的试剂组合物，还含有一种提供5～11.5pH值范围的pH调节剂。
5.权利要求1的试剂组合物，还包括一种其含量能有效地提供试剂组合物稳定性的防氧化稳定剂。
6.权利要求5的防氧化稳定剂，其中稳定剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)衍生物、柠檬酸、酒石酸、葡糖酸、糖酸和其混合物。
7.权利要求2的试剂组合物，其中溶胞剂包括十二烷基三甲基氯化铵和十四烷基三甲基溴化铵。
8.权利要求1的试剂组合物，还包括一种表面活性剂。
9.测量血红蛋白浓度的方法，包括步骤a．血液样品与一种不含氰化物离子的试剂组合物发生反应，所述的试剂组合物包括(ⅰ)至少一种选自季铵盐、吡啶鎓盐和其混合物的、其量足够溶解红细胞并释放血红蛋白的溶胞剂，和(2)一种其量能足以将释放的血红蛋白转换成血色原，从而形成一种反应产物的氧化剂；b．测定所述反应产物的吸收来确定所述血液样品的血红蛋白浓度。
10.权利要求9的方法，其中溶胞剂包括两种不同的季铵盐。
11.权利要求9的方法，其中防氧化剂选自抗坏血酸、亚磷酸、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠和其它具有还原特性硫的含氧酸碱金属盐，包括其混合物，其中硫的氧化值从+2～+4。
12.权利要求9的方法，其中试剂组合物还含有一种提供5～11.5pH值范围的pH调节剂。
13.权利要求9的方法，其中试剂组合物还包括一种其含量能有效地提供试剂组合物稳定性的防氧化稳定剂。
14.权利要求10的防氧化稳定剂，其中稳定剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)衍生物、柠檬酸、酒石酸、葡糖酸、糖酸和其混合物。
15.权利要求10的方法，其中溶胞剂包括十二烷基三甲基氯化铵和十四烷基三甲基溴化铵。
16.权利要求9的方法，还包括添加表面活性剂。
17.权利要求11中的方法，其中所述反应混合物的吸收测量在500～600纳米之间进行。
18.一种用于测量血液样品中的血红蛋白浓度和区分白细胞种类的不含氰化物离子的试剂组合物，包括a．一种至少包括选自季铵盐、吡啶鎓盐和其混合物的成分之一、其量足够溶解红细胞并释放血红蛋白、并在体积上影响白细胞以确定两种白细胞的种类的溶胞剂；和b．一种其含量能有效地将释放的血红蛋白转化成血色原的防氧化剂。
19.权利要求18中的试剂组合物，其中溶胞剂包括两种不同的季铵盐。
20.权利要求18中的试剂组合物，其中防氧化剂选自亚磷酸、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠和其它具有还原特性硫的含氧酸碱金属盐，也包括其混合物，其中硫的氧化值从+2～+4。
21.权利要求18中的试剂组合物，其中试剂组合物还含有一种提供5～11.5pH值范围的pH调节剂。
22.权利要求18中的试剂组合物，其中试剂组合物还包括一种其含量能有效地提供试剂组合物稳定性的防氧化稳定剂。
23.权利要求21中的防氧化稳定剂，其中稳定剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)衍生物、柠檬酸、酒石酸、葡糖酸、糖酸和其混合物。
24.权利要求19的试剂化合物，其中溶胞剂包括十二烷基三甲基氯化铵和十四烷基三甲基溴化铵。
25.权利要求18中的试剂组合物，还包括一种表面活性剂。
26.一种测量血液样品中的血红蛋白浓度和区分白细胞种类的方法，包括a．使血液样品与不含氰化物离子的试剂组合物发生反应，从而形成反应产物，所述试剂组合物包括(1)至少一种选自季铵盐、吡啶鎓盐和其混合物的、含量足够溶解红细胞并释放血红蛋白并由体积影响白细胞，以便确定至少两种白细胞种类的溶胞剂，和(2)一种含量足够能将释放的血红蛋白转换成血色原的防氧化剂；b．测量所述反应产物的吸收来确定所述血液样品的血红蛋白浓度；和c．根据反应产物区分至少两种白细胞种类。
27.权利要求26中的方法，其中溶胞剂包括两种不同的季铵盐。
28.权利要求26中的方法，其中防氧化剂选自亚磷酸、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠和其它具有还原特性硫的含氧酸碱金属盐，包括其混合物，其中硫的氧化值从+2～+4。
29.权利要求26中的方法，其中试剂组合物还包括一种提供在5～11.5pH值范围的pH调节剂。
30.权利要求26中的方法，其中试剂组合物还包括一种其含量能有效地提供试剂组合物稳定性的防氧化稳定剂。
31.权利要求29的方法，其中的防氧化稳定剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)衍生物、柠檬酸、酒石酸、葡糖酸、糖酸和其混合物。
32.权利要求27中的方法，其中溶胞剂包括十二烷基三甲基氯化铵和十四烷基三甲基溴化铵。
33.权利要求26中的方法，还包括加入表面活性剂。
34.权利要求32中的方法，其中所述的反应混合物的吸收测量在大约500～600纳米之间进行。
35.权利要求30中的方法，其中根据反应产物可以区分至少三种白细胞种类。
全文摘要
一种不含氰化物离子的试剂组合物和一种用于测量血液样品中的血红蛋白浓度的方法。此外,根据试剂组合物和血液样品的同一反应产物,试剂组合物可以用于测量血红蛋白的浓度和区分至少两种白细胞种类。试剂组合物包括至少一种选自季铵盐、吡啶鎓盐和其混合物的、含量足够溶解红细胞并洗提血红蛋白的溶胞剂,和一种其有效含量能够把释放的血红蛋白转化成血色原的防氧化剂。可用一种pH值调节剂调节pH值,从而提供范围在5～11.5的pH值。
文档编号G01N33/72GK1215168SQ97126470
公开日1999年4月28日 申请日期1997年10月17日 优先权日1997年10月17日
发明者M·里斯格, C·扬 申请人:库特国际公司