专利名称：血液白细胞和血红蛋白浓度测定试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及测定血液样品中白细胞和血红蛋白浓度的试剂。
血液中白细胞数和血红蛋白浓度的测定对于白血病和贫血症等的临床诊断以及治疗过程的监测来说至关重要。
现在，白细胞数和血红蛋白浓度可以用自动血液分析装置在很短时间内测出，其应用非常广泛。
自动血液分析装置大致可以区分为按检测光散射和荧光等的光学检测方式工作的和按检测粒子通过细孔时的阻抗变化的电阻检测方式工作的，但后者从简便程度上看则更优。应用电阻检测方式时，白细胞数的测定是往血液样品中加入溶血剂溶解红细胞，得到只剩下白细胞的测定用样品后，让其通过检测器，检测所发生的信号而进行测定。
此外，通常外周血液中的白细胞有淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等五种，将溶血剂的组成进行适当的配比并进行2至3次的分级分离，就能只检测特定种类的白细胞。象这样，就能使不得不依靠显微镜进行的白细胞分类自动地在短时间内进行，从而减轻了检查人员的负担，而且不需要特别的技术。
另一方面，对于血红蛋白浓度的测定则采用以含氰化物的VanKampen试剂将血红蛋白转化成氰化高铁血红蛋白在541纳米附近测定吸光度的方法作为国际标准方法。此外，在用自动血细胞分析装置时，用具表面活性作用的季铵盐一边将红细胞碎片化一边使血红蛋白变性，用氰化碱得到氰化高铁血红蛋白样的吸收曲线从而进行测定，还可以对白细胞进行测定。但是在这些方法中，由于试剂中含有有害的氰化物，其试剂和测定后的样品必须进行无毒化才能废弃。
因此，已知有在测定血红蛋白浓度时不用氰化物且能够进行白细胞计数的试剂(美国专利第4,185,964号)。此试剂中含有能够完全阻止白细胞溶解量的具表面活性作用的水溶性季铵盐和少量碳数至8个的多羧酸。更进一步，还已知有能使白细胞分成三类的溶血剂。这其中含有季铵盐和特殊的血红蛋白稳定化剂。(特开平3-137566号、特开平3-252557号、特开平4-13969号)上述的溶血剂能使血红蛋白快速变性，但是具有如果样品液温变化时则血红蛋白浓度发生巨大变化的缺点。特别是在美国专利第4185964号中，因为没有稳定化剂，变化很大。在特开平3-137566号、特开平3-252557号、特开平4-13969号中，因加入特殊的血红蛋白稳定化剂所以变化变小，但是液温变化时血红蛋白浓度仍发生变化，在这种情况下稳定化效果不充分。因此为了得到稳定的测定值，就必须有使液温保持恒定的装置。这是使整个装置成本提高的主要因素之一。
本发明的目的在于提供不用氰化物的、能够测定白细胞数的、以及样品液温变化的也能稳定地测定血红蛋白浓度的试剂。
本发明的白细胞及血红蛋白浓度测定试剂含有(1)能够溶解红细胞、使血红蛋白变性的量的阳离子表面活性剂，(2)选自下述(a)、(b)和(c)中至少1种的血红蛋白稳定化剂(a)能促进转化成高铁血红蛋白的有效量的磺基水杨酸或其盐。
(b)0.2至10.0克/升的含氮原子和羧基的水溶性螯合剂。
(c)能促进转化成高铁血红蛋白的有效量的哌嗪或其盐。
(3)维持pH为4-6的缓冲剂。
用本发明的白细胞和血红蛋白浓度测定试剂，能同时测定白细胞和血红蛋白浓度，也能进行别的测定。
本发明的白细胞和血红蛋白浓度测定试剂中，含有能使红细胞溶解、血红蛋白变化的量的阳离子型表面活性剂。作为阳离子型表面活性剂，至少含有具下述结构的季铵盐型或吡啶鎓盐型中的一种。
具体的优选下述的物质(a)季铵盐[化1]
(式中R1为C8-C20的烷基、链烯基或炔基；R2、R3和R4分别为C1-C8的烷基、链烯基或炔基，X为卤素离子)(b)吡啶鎓盐[化2]
(式中n为7-19的整数，X为卤素离子)本发明试剂使用的阳离子表面活性剂的合适浓度为0.1-15.0克/升。上述的表面活性剂优选季铵盐，浓度优选0.1-4.0克/升。此外，将上述的表面活性剂进行适当的组合，可以将白细胞分成例如淋巴细胞和其它细胞的两类或淋巴细胞、中性性粒细胞和其它细胞三类。
此外，在本发明的白细胞和血红蛋白浓度测定试剂中，含有能够促进转化成高铁血红蛋白的有效量的血红蛋白稳定化剂。稳定化剂选自(a)磺基水杨酸或其盐、(b)具氮原子和羧基的水溶性螯合剂以及(c)哌嗪或其盐中至少1种。作为水溶性螯合剂，例如有乙二胺四乙酸或其盐、二氨基丙醇四乙酸或其盐、二氨基丙烷四乙酸或其盐、乙二胺二乙酸或其盐、乙二胺二丙酸或其盐等。特别优选的为乙二胺四乙酸盐。
血红蛋白稳定化剂的用量为促进转化成高铁血红蛋白的有效量，通常在0.2-10.0克/升的范围比较合适。至于更合适的浓度因所用物质不同而不同，在使用磺基水杨酸或其盐的场合，更合适的浓度为0.2-2.0克/升。此外，在使用水溶性螯合剂的时候的特别合适的浓度，例如用乙二胺四乙酸盐时为0.5-10克/升，用二氨基丙醇四乙酸或其盐时为0.5-5克/升，用二氨基丙烷四乙酸或其盐时为0.5-5克/升，用乙二胺二乙酸或其盐时为0.5-5克/升，用乙二胺二丙酸二盐酸盐时为0.5-5克/升。用哌嗪或其盐时，合适的为0.5-5克/升。另外，这些稳定化剂有缓冲能力的时候，也可作为缓冲剂的一部分而使用。
可以推测，这些稳定化剂可与由上述的阳离性表面活性剂或其组合物引起变性的高铁血红蛋白中的血红素铁结合，从而起到稳定化的作用。
缓冲剂为能维持pH在4.0-6.0的物质，没有特殊的限定。pH如果太低的话，白细胞会脆弱化从而对白细胞数的测定产生不良的影响。而且如果pH太高则血红蛋白的历时稳定性变差。具体的说可以用众所周知的Good缓冲剂、磷酸缓冲剂、琥珀酸缓冲剂、马来酸-Tris缓冲剂等。其浓度为5-50mM，更合适的是15-30mM。
还有，上述各成分的浓度为将血液直接用本发明的白细胞和血红蛋白浓度测定试剂稀释使用时的浓度。此外血液先用稀释液(例如生理盐水或CELLPACKTM(东亚医用电子株式会社))稀释后再加试剂也可以。在这种情况下，为了使试剂添加后的浓度在上述范围内，可以对各成分的浓度进行调整。这时所用的稀释液，为了保持血细胞的形态通常应该使用pH在中性附近(6-8)、渗透压在等张附近(240-330Osm/kg的)。
本发明的试剂的电导优选作成8-20mS/cm，更优选10-15mS/cm。电导的调节可以适当加入氯化钠等电解质而进行。
用本发明的白细胞和血红蛋白浓度测定试剂调制血液样品，将此样品导入自动血细胞分析装置，用同一样品可以同时或分别测定根据检测粒子通过细孔时阻抗变化而得的白细胞数、或者根据检测样品吸光度而得的血红蛋白浓度。
作为本发明试剂的组成例例如有以下所举的。
组成例1氯化十六烷基三甲基铵0.3-3.0克/升EDTA-2K 0.5-5.0克/升磷酸缓冲液 15-30mM氯化钠 适量精制水 1升组成例2氯化月桂基三甲基铵 0.3-10.0克/升氯化硬脂酰基三甲基铵0.1-1.0克/升EDTA-2K 0.5-5.0克/升Good缓冲液 15-30mM氯化钠 适量精制水 1升组成例3氯化月桂基三甲基铵 0.3-10.0克/升月桂基二甲基铵乙内酯0.5-5.0克/升EDTA-2K 0.5-5.0克/升琥珀酸缓冲液15-30mM氯化钠 适量精制水 1升用组成例1-3可以同时测定白细胞和血红蛋白，但调整各表面活性剂的种类和浓度则能够将白细胞分成2个以上的集团。白细胞的集团表示例如淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等。组成例1为将白细胞分成1个集团的组合物，组成例2、3为将白细胞分别分成2-3个集团的组合物。实施例1对温度变化的稳定性按以下配方调制本发明的试剂和比较例1、2的试剂，测定在不同温度下反应的血红蛋白量。本发明的试剂氯化月桂基三甲基铵 3.0克/升氯化硬脂酰基三甲基铵 0.2克/升EDTA-2K 1.0克/升磷酸缓冲液 20mM(pH5.0)氯化钠 适量(使电导为约13mS/cm的量)精制水 1升比较例1氯化月桂基三甲基铵 3.0克/升氯化硬脂酰基三甲基铵0.2克/升磷酸缓冲液 20mM氯化钠 适量(使电导为约13mS/cm的量)精制水 1升比较例2氯化月桂基三甲基铵 3.0克/升氯化硬脂酰基三甲基铵0.2克/升咪唑1.0克/升Tris-马来酸缓冲液 (使电导为约13mS/cm的量)精制水 1升将血液用上述组成的各试剂稀释至500倍，在10℃和35℃下反应30秒后用分光光度计测定吸光度，算出35℃下的吸光度对应10℃下吸光度的变化率，并由此求出变化的血红蛋白量(换算值)。所得结果如表1所示。
表1试剂 变化率 血红蛋白变化量(换算值)本发明-3.50％-0.53克/分升比较例1 -15.7％-2.34克/分升比较例2 -6.1％ -0.91克/分升变化率＝35℃下的吸光度/10℃下的吸光度比较例1的试剂为从本发明的试剂除去稳定化剂后的组成，但是这种情况下对温度的变化率很大。上述本发明的试剂中含有EDTA-2K作为稳定化剂，比较例2中含有咪唑作为稳定化剂，它们的变化率就比不含稳定化剂的比较例1小。
作为稳定化剂可以使用除此之外的物质，但其变化率的程度因所用的稳定化剂的种类不同而不同。
实施例2与现有方法的相关关系试剂组成氯化月桂基三甲基铵8.7克/升氯化硬脂酰基三甲基铵 0.8克/升EDTA-2K 3.0克/升磷酸缓冲液60mM(pH5.0)氯化钠使电导为13mS/cm的量精制水1升1)血红蛋白的相关关系用上述试剂，以CELLPACKTM(东亚医用电子株式会社)为稀释液，使用K-4500(东亚医用电子株式会社)，以113检体进行血红蛋白量的测定。以氰化高铁血红蛋白变法(用自动血细胞分析装置对国际标准法作改良的方法使用STROMATOLYSER-C(东亚医用电子株式会社)，同样地以K-4500测定)测定的血红蛋白量为对照作出相关图(
图1)。用此装置是，血液先用稀释液稀释，然后和上述试剂混合。最终血液被稀释500倍，上述试剂的阳离子表面活性剂、EDTA-2K、磷酸缓冲液浓度变成三分之一。稀释液中也含有氯化钠，因此电导基本不变。图中的X轴表示现有方法，Y轴表示用本发明试剂的方法。图的相关系数r＝0.997，回归直线Y＝0.951X+0.588，说明得到良好的相关关系，从而确认血红蛋白的测定可能。
2)白细胞的相关关系用上述试剂，以CELLPACKTM(东亚医用电子株式会社)为稀释液，使用K-4500(东亚医用电子株式会社)进行白细胞数的测定。对照使用STROMATOTOLYSER-3WPTM(东亚医用电子株式会社)，同样地以K-4500进行测定，作成相关图(图2)(N＝113)。图的相关系数r＝0.997，因归直线Y＝0.986X+1.137，说明得到良好的相关关系，从而确认和现有方法一样能够对白细胞进行测定。
此外，就白细胞分类值进行探讨，得到和现有方法一样的良好相关关系(N＝51)。结果如图3-图5所示。其中W-SCR相当于添加溶血剂后小型白细胞比率的淋巴细胞比率，W-LCR相当于添加溶血剂后大型白细胞比率的中性粒细胞比率，W-MCR相当于添加溶血剂后中型白细胞比率的其它白细胞比率。此外，粒度分布图如图6所示。
实施例3白细胞成二分类的试剂试剂组成氯化月桂基三甲基铵 6.1克/升氯化硬脂酰基三甲基铵 1.1克/升EDTA-2K 3.0克/升磷酸缓冲液 60mM(pH5.0)氯化钠 使电导为13mS/cm的量精制水 1升用上述试剂，以CELLPACKTM(东亚医用电子株式会社)作稀释剂，使用K-4500(东亚医用电子株式会社)进行白细胞的测定时，确证白细胞能被分成两类。粒度分布图如图7所示。图中较小的群相当于淋巴细胞，较大的群相当于其它的白细胞。
应用本发明能够在样品液温变化下稳定地进行白细胞数和血红蛋白浓度的测定。这样就不需要使样品液温保持恒定的部件，从而能使分析装置的成本变得便宜。
此外，因为不用氰化物就能进行白细胞数和血红蛋白浓度的测定，所以就不需要进行废液处理等特别的操作。[图1]用本发明试剂的血红蛋白量和现有方法测定的血红蛋白量的相关图。用本发明试剂测定的白细胞数和现有方法测定的白细胞数的相关图。用实施例2试剂测定的W-SCR和现有方法测定的W-SCR的相关图。用实施例2试剂测定的W-MCR和现有方法测定的W-MCR的相关图。用实施例2试剂测定的W-LCR和现有方法测定的W-LCR的相关图。用实施例2试剂测定的白细胞的粒度分布图。用实施例3试剂测定的白细胞的粒度分布图。
权利要求
1.白细胞和血红蛋白浓度测定试剂，含有(1)能够使红细胞溶解、血红蛋白变性的量的阳离子型表面活性剂；(2)选自下述(a)，(b)和(c)中至少1种的血红蛋白稳定化剂(a)促进转化成高铁血红蛋白的有效量的磺基水杨酸或其盐(b)0.2-10.0克/升的具氮原子和羧基的水溶性螯合剂、(c)促进转化成高铁血红蛋白的有效量的哌嗪或其盐；(3)维持pH在4-6的缓冲剂。
2.根据权利要求1的试剂，其中水溶性螯合剂为EDTA盐。
3.根据权利要求1的试剂，其中促进转化成高铁血红蛋白的有效量为0.2-10.0克/升。
全文摘要
本发明公开了不用氰化物的能够测定白细胞数,而且样品液温变化时仍能稳定进行血红蛋白浓度测定的试剂,含有(1)能够使红细胞溶解、血红蛋白变性的量的阳离子型表面活性剂;(2)选自下述(a)、(b)和(c)中至少1种的血红蛋白稳定化剂:(a)促进转化成高铁血红蛋白的有效量的磺基水杨酸或其盐、(b)0.2—10.0克/升的具氮原子和羧基的水溶性螯合剂、(c)促进转化成高铁血红蛋白的有效量的哌嗪或其盐;(3)维持pH在4—6的缓冲剂。
文档编号G01N33/72GK1197211SQ9810665
公开日1998年10月28日 申请日期1998年4月17日 优先权日1997年4月18日
发明者内桥欣也, 池内喜郎, 白上笃, 浜口行雄 申请人:东亚医用电子株式会社