专利名称：提高离心前红细胞的聚焦作用和/或凝集作用的方法
技术领域：
本发明涉及一种减小红细胞间相互排斥的自然趋势的方法。尤其是，本发明涉及一种使抗凝全血的离心样品中红细胞层和淡黄色膜(buffy coat)粒细胞层之间的界面清晰的方法。
U.S.专利4,027,660；4,082,085；4,137,755；和5,086,784涉及一种设备和工艺，该设备和工艺可物理性地拉伸在透明管中，如毛细管中离心血样的血液组分层。然后，血细胞参数的测定由U.S.专利4,156,570和4,558,947中公开的仪器完成。正如U.S.专利4,779,976中描述的，此技术已经被应用在兽医上。上述技术通常称之为定量淡黄色膜分析(“q.b.c.a.”)技术。
此技术的研究者遇到了被称之为“流动”现象的问题，该现象与上述的q.b.c.a.技术有关。此流动问题部分是由于红细胞组分上升至淡黄色膜的粒细胞层的结果；部分是由于粒细胞沉降至离心的红细胞层上部的结果，二者都是由于红细胞和粒细胞密度的部分重叠。
一些解决方法被设计来减小流动。一种解决方法涉及了利用添加剂，如草酸钾，来减少红细胞的水分，即增加了红细胞的密度。此解决方法在U.S.专利4,159,896和4,181,609中说明。但此解决方法不能完全地消除流动问题。
另一种解决流动问题的尝试在U.S.专利4,695,553中探讨。此解决方法是，血样首先在管中以一个方向离心，然后将管反放入离心机，使血样在管中以相反方向离心。此方法的原理是，在第一次离心步骤中，最轻的红细胞会将在压积的红细胞层的上部；然后当再次反方向离心后，最轻的红细胞可与上面覆盖的重的红细胞接合，因此可以不上升至粒细胞界面。这种解决方法很麻烦，需要大量的技术人员完成。
第三个解决流动问题的方法涉及，向血样中加入抗体，或其它对红细胞表面抗原具有特异性的结合剂。一种适当的抗体是种特异性抗血型糖蛋白抗体。此抗体可使相邻红细胞彼此结合，由此导致红细胞附聚。U.S.4,594,165和U.S.4,940,668描述了与上述q.b.c.a.技术有关的红细胞附聚引发抗体的应用。为了使抗体发挥其预期的作用，各个红细胞在离心步骤前必须能够彼此相对靠近，使抗体可以将相邻红细胞彼此结合起来。
在通过q.b.c.a.技术对抗凝全血样品进行分析时，尤其是采用红细胞特异性抗体时，一个复杂化因素是红细胞之间彼此排斥的自然趋势。排斥现象是由于“Z-电位”产生的，该电位是由于红细胞表面负电荷的存在，而电荷的存在是因为红细胞膜上的唾液酸根导致的。
血中的红细胞还有一种聚集的趋势并形成为“红细胞钱串”或“币堆”。红细胞钱串化趋势是影响透明管中全血样品的红细胞沉降速度测定的因素，也影响比重。U.S.4,135,819中探讨了红细胞钱串化现象。全血样品中的红细胞成钱串化趋势的相反作用是上述的Z-电位排斥现象。
1975年9月2日批准的U.S.专利3,902,964，D.J Greenspan描述了一种方法和装置，可利用化学手段从血组成中分离出血浆或血清。此专利提出将正电性聚合物，如聚凝胺和血细胞凝集素植物提取物-植物血凝素，加入到血样中以提高血液中成分的凝集作用及这些成分由血清和血浆中的沉积。Greenspan发明的目的是将上述血样组分不通过离心即能够产生快速重力性地分离。Greenspan发明提出，一个正电性聚合物与一个植物血凝素结合，实际上可将血样中的组分从血浆或血清中分离出来而不用离心血样。此参考文件并没有讨论任何关于解决抗凝全血离心样品中，红细胞层和粒细胞层之间的清晰轮廓界面问题的解决方法。则根据上述Greenspan专利的说教不能认定其对离心抗凝人全血中流动现象的反作用有重要的改进作用。
需要一定程度地中和或减小动物和人的红细胞Z-电位，来提高红细胞聚集作用，红细胞钱串化和凝集作用，以改善上述人和动物的q.b.c.a技术。
本发明涉及一种提高人和动物的，尤其是奶牛的，红细胞钱串化或其它聚集作用趋势的方法。本发明的实施显著地减小了红细胞Z-电位导致的排斥力强度。由受试者血样中存在的结合剂所产生的红细胞聚集作用；钱串化作用；或凝集作用，可被一定程度地提高，能有效地使离心的抗凝全血样品中红细胞和粒细胞层间的界面清晰。
本发明涉及向血样中添加复合试剂，其中该试剂将中和或减小红细胞Z-电位的排斥作用。应用的试剂包括高分子量阳离子大分子物质的结合物，即分子量约大于50,000道尔顿的物质。溶液中适当试剂结合物将形成混合物分子团，该分子团可成为红细胞聚集和钱串化的引发剂。特别是，试剂结合物包括将以下物质结合聚凝胺；鱼精蛋白硫酸盐；阳离子抗生素，如万古霉素；聚乙二醇(PEG)；羟基二乙基淀粉(HES)；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；和高分子量葡聚糖。本发明中所用的术语“分子团”涉及亚显微颗粒，该种颗粒在溶液，尤其在哺乳动物的抗凝全血中，具有热力学稳定性。分子团由二个或更多的大分子形成，至少其中之一在分子团上形成正电性外层，该正电性层中和或减小由红细胞Z-电位产生的排斥力强度。优选在含水溶液中形成高分子分子团，例如与抗凝全血样品混合的生理盐水。某些超高分子量带正电荷物质，如PVP，也可单独或与其它上述试剂结合使用。
为了满足在抗凝全血的离心样品中制备清晰红细胞-粒细胞界面的需要，本发明还试图向血样中加入红细胞特异性结合剂，如抗血型糖蛋白抗体或植物凝血素，并与上述大分子剂结合。
因此，本发明的一个目的是提供一种处理抗凝全血样品的方法，以提高血样中红细胞成钱串化或其它聚集作用的趋势。
本发明进一步的目的是提供一种方法，其中由红细胞Z-电位导致的红细胞排斥作用可被抑制。
本发明又一个目的是提供一种方法，其中血样与含有一种或多种可一定程度地提高红细胞聚集作用的高分子量阳离子物质进行混合，它们将在血样离心时通过红细胞密度依重力沉降出层次。
本发明另一个目的是提供一种方法，其中血样还可与能使红细胞凝集的结合剂混合，它们在血样离心时通过红细胞密度依重力沉降出层次。
本发明的这些和其它的目的及进步，将通过下列结合有附图的本发明优选实施例具体说明，使所属领域技术人员更易理解。
附图简述
图1.是一个透明样品管的透视图，该透明样品管含有离心血样和细胞层拉伸插入物；图2.是一个红细胞彼此排斥状态的图解说明，该彼此排斥状态是由于其表面负电荷导致的；图3.是一个由葡聚糖和聚凝胺结合形成的分子团的图示，其中该分子团具有表面正电荷；图4.是一个状态图示，该状态是当分子团加入到血样中，通过减小或中和Z-电位的影响，使相邻红细胞更加紧密聚集情形。
图5.是一个状态的图示，在该状态中，分子团加入到血样中起减小或中和红细胞彼此排斥强度的作用，以使血样中红细胞特异性结合剂将各个红细胞凝集。
完成发明的最优选方式将附图作为参考，附图1表示在本发明试验方法中优选的血液取样和测试的装置类型。该装置包括抗凝全血样品可在其中抽取和离心的透明管2。透明管2含有通常为圆柱形的血细胞层拉伸插子6，该插子具有特定的比重，并能在管2的离心抗凝全血样品红细胞层8中漂浮。管2的底部用盖4封闭，以保证管2样品的离心。当血样在管2中离心时，其各组成按照特定的比重沉降分层。最重层是红细胞层8；然后依次为淡黄色膜10；和血浆层12。淡黄色膜10有三个主要组成层，即，粒细胞层14，淋巴细胞/单核细胞层16，和血小板层18。红细胞层8和粒细胞层14间的界面20是清晰的和明确的分界，这是由于在血样中加入了高分子量的阳离子大分子结合物，并同时加入红细胞结合剂，或在某些情况下可不加后者。
附图2.图示了一种状态；在该状态中，抗凝全血样品的相邻红细胞22趋于彼此排斥，这是由于Z电位的表面负电荷造成的；当排斥达到一定程度时，将干扰相邻细胞22上的红细胞特异性结合剂24将细胞22彼此凝集的能力。为了造成结合剂引起的相邻红细胞22的聚集，结合剂单体24必须能附着在各红细胞22表面膜上。图2.表示，在某些情况下，由Z-电位排斥力产生的相邻红细胞间的空隙很大，使结合剂单体24无法使相邻红细胞22聚集。
图3.是本发明所述的分子团形成的图示。分子团通常由字符M表示，并由一群大分子形成。实际中的分子团M包括由许多核心葡聚糖分子D，许多聚凝胺分子组成的外表面。葡聚糖分子D提供了分子团M的预期体积；聚凝胺分子P提供了预期的分子团M的表面正电荷，如图3.所示。
附图4.是一个状态的图示，在该状态中牛抗凝全血样品的高分子量阳离子分子团引发红细胞钱串化和其它的红细胞聚集。在图4.中数字22代表各个红细胞，字符M代表阳离子性高分子量的改善红细胞钱串化或红细胞聚集的分子团，如PVP。阳离子分子团或大分子M的混合物分配在红细胞22之间，并有效地使红细胞22尽可能地彼此接近。由于阳离子高分子分子团或大分子M的掺入，红细胞22的聚集作用提高了。
附图5.是一种状态的图示，该状态中分子团或大分子M引发了钱串化或其它红细胞聚集的形成，并达到一定程度以满足红细胞结合剂24凝集红细胞22的需要。
上述确定技术的特定应用涉及了抗凝牛全血离心样品的q.b.c.a.技术。牛血迄今为止被证明不能用q.b.c.a.技术分析。原因是牛红细胞表现出的异常高的Z-电位。
从抗凝牛全血样品中抽取红细胞，先不结合上述类型的高分子量分子团或大分子而进行沉积，在显微镜下显示出零堆积，聚集或钱串化。抗凝牛全血与抗体混合；用高分子量阳离子分子分离；然后在上述q.b.c.a.的含插子管装置中离心。结果得到一个离心混合物，该混合物在红细胞/粒细胞间得到一个不清晰和含糊的界面，该界面无法提供临床可接受的测量量度，应用于以q.b.c.a.技术为依据的白细胞和血小板差示计数。
相反的，当高分子量分子团结合物的盐溶液，特定情况下和大分子，与抗凝牛全血混合，在显微镜下可观察到显著的红细胞聚集或钱串化。特别有效的是高分子量试剂包括由聚凝胺和葡聚糖形成的分子团；聚凝胺和PVP形成的分子团；和阳离子PVP大分子。发现与含有上述试剂的盐溶液混合的牛血样，经沉积，在显微镜下观察到的结果是大量红细胞形成聚集或钱串。当抗凝牛血样单独与含有聚凝胺和葡聚糖试剂二者之一的盐溶液混合时，证明不能产生显著的红细胞聚集或钱串形成。
根据本发明方案，抗凝牛全血样品与含分子团的盐溶液混合，该分子团由聚凝胺和葡聚糖组成。混合物在现有技术所用的q.b.c.a.的含插子管的装置中离心，所得沉降分离混合物显示出一个清晰并良好分界的红细胞-粒细胞界面，此界面足够提供临床可接受的量度，应用在根据q.b.c.a.技术手段的白细胞计差示数，及血细胞比容，血红蛋白和血小板计数。
通过q.b.c.a.技术测定牛血清时，首先优选的应用溶液是由约65mg聚凝胺和约65mg葡聚糖/ml盐水形成的分子团组成。上述混合物使红细胞产生足够的聚集，以便能够进行精确的白细胞和血小板差示计数，并可在抗凝牛全血的离心样品中进行精确的红细胞比容和血红蛋白读数。血液相对于盐水的可行性浓度在约2∶1到约10∶1的范围。
通过q.b.c.a.技术测定牛血清时，第二优选的应用方案是由约65mg聚凝胺和约65mgPVP/ml盐水形成的分子团组成。上述混合物使红细胞产生足够的聚集，以便能够进行精确的白细胞和血小板差示计数，并可在抗凝牛全血的离心样品中进行精确的红细胞比容和血红蛋白读数。血液相对盐水的可行性浓度在约2∶1到约10∶1的范围。
通过q.b.c.a.技术测定牛血清时，第三优选的应用方案是由65mgPVP的大分子/ml盐水组成。上述混合物也可使红细胞产生足够的聚集，以便能够进行精确的白细胞差示计数，并可在抗凝牛全血的离心样品中进行精确的红细胞比容，血红蛋白，和血小板计数的读数。血液相对于盐水的可行性浓度在约2∶1到约10∶1的范围。
在牛血分析中，最优选应用的分子团和大分子的盐水溶液浓度的确定，是由IDEXX Laboratories，Inc.的Messers. John Roche，PaulWeiss和Travis Waldron工作室完成的。
上述确认技术的另一个应用涉及了抗凝全血离心样品的q.b.c.a.技术，其中该血样表现出流动问题。如上所述，具有确定的过度流动的人血液，至今为止被证明还难以用q.b.c.a.技术分析。此现象的原因还不清楚。
已知具有“流动”作用的人抗凝全血样品，与聚凝胺和葡聚糖分子团的盐溶液混合，然后用图1所示并描述的q.b.c.a.技术装置进行离心。结果得到了一种离心混合物，该混合物虽然改善了流动问题，但仍不足以提供临床可接受量度，应用于以q.b.c.a.技术为依据的白细胞差示计数，或血细胞比容和血红蛋白计数中。同样，流动性血样和单独一种较高分子量试剂的混合物，或流动性血样和抗血型糖蛋白抗体的混合物，都不能改善流动作用。
当流动性血样与聚凝胺和葡聚糖分子团的结合物混合，并再结合抗血型糖蛋白抗体，粒细胞-红细胞的分离得到了改善；且在具有合理百分比的离心流动性血样中，上述两种细胞层间的界面明显清晰了。当与聚凝胺-葡聚糖分子团溶液和抗血型糖蛋白抗体结合时，约一半的流动性测试血样被证明其细胞分离程度显著提高，可确保应用q.b.c.a.技术来完成精确白细胞和血小板差示计数，及红细胞比容和血红蛋白读数。
特别是，流动性人血液与抗血型糖蛋白抗体，和含有约65mg和约65mg葡聚糖/ml盐水的分子团的盐溶液进行混合。将此血液-试剂混合物沉积，在显微镜下可观察到产生了大量的红细胞聚集或红细胞钱串的形成。对于分析流动性人血样，血液与红细胞聚集剂溶液的比浓度，优选范围约是2∶1至10∶1。由一个极常规的方法也可得到相似的结果，该方法是将适当浓度的结合剂和/或红细胞-聚集剂，在血样管壁上形成一层干的溶于血液的包被层。当与红细胞结合剂结合时，上述聚凝胺-PVP分子团和PVP大分子也可有效的减小流动问题。
因此容易理解的是，单独向血样中加入阳离子高分子量分子团化合物的结合物，或加入阳离子大分子试剂，或某些情况下，与红细胞特异性结合试剂结合，将显著地提高红细胞聚集，成钱串化和凝集的能力。按此方法处理的血样可因此在q.b.c.a.技术中更易于精确地分析。尤其是，处理的抗凝牛全血样品可应用上述技术分析，处理的流动性人血样品也可应用上述技术得到更好地分析。
由于在不超出本发明原理的范围内，即可做出与本发明公开实施例的许多变化和不同，本发明不局限于这些其它方式，但以所附权利要求书中所要求的为限。
权利要求
1.一种在离心抗凝全血样品的红细胞层和粒细胞层间形成良好确定的和清晰的界面的方法，该方法包括的步骤如下a)将一定量的分子团与血样混合以提供一种血液-分子团混合物，该分子团由至少两种不同的高分子量颗粒组成，并具有表面正电荷；及b)在透明管中离心血液-分子团混合物。
2.根据权利要求1中的方法，其中的步骤还包括将该血液-分子团混合物与红细胞特异性结合剂在该离心步骤前进行混合。
3.根据权利要求1中的方法，其中所述血样为牛血。
4.根据权利要求1中的方法，其中该高分子量颗粒是选自一组由聚凝胺，鱼精蛋白硫酸盐，阳离子抗生素，聚乙二醇(PEG)，羟基二乙基淀粉(HES)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，和葡聚糖组成的试剂。
5.根据权利要求1中的方法，其中该分子团由聚凝胺和葡聚糖的混合物形成。
6.根据权利要求1中的方法，其中该分子团是由聚凝胺和PVP形成的。
7.一种在离心抗凝牛全血样品的牛红细胞层和牛粒细胞层间形成良好确定的和清晰的界面的方法，该方法包括的步骤如下a)将一定量的分子团与牛血样混合以提供一种牛血液-分子团混合物，该分子团由至少两种不同的高分子量颗粒组成，并具有表面正电荷；及b)在透明管中离心牛血液-分子团混合物。
8.一种在离心抗凝全血样品的红细胞层和粒细胞层间形成良好确定的和清晰的界面的方法，该方法包括的步骤如下a)将一定量的分子团与血样混合以提供一种血液-分子团混合物，该分子团由一群葡聚糖和聚凝胺组成；及b)在透明管中离心血液-分子团混合物。
9.一种在离心抗凝全血样品的红细胞层和粒细胞层间形成良好确定的和清晰的界面的方法，该方法包括的步骤如下a)将一定量的分子团与血样混合形成一种血液-分子团混合物，该分子团由一组聚乙烯吡咯烷酮和聚凝胺组成；及b)在透明管中离心血液-分子团混合物。
10.一种减少抗凝全血样品中由红细胞Z电位导致的排斥力强度的方法，该方法包括的步骤是，通过将一定量的分子团与血样混合，形成一种抗凝的血液-分子团混合物，该分子团由至少两种不同的高分子量颗粒组成，并具有表面正电荷。
11.根据权利要求10中的方法，其中该高分子颗粒包括葡聚糖和聚凝胺。
12.根据权利要求10中的方法，其中该高分子颗粒包括聚乙烯吡咯烷酮和聚凝胺。
13.一种在离心抗凝全血样品的红细胞层和粒细胞层间形成良好确定的和清晰的界面的方法，该方法包括的步骤如下a)将一定量的分子团与血样混合形成一种血液-分子团混合物，该分子团由一组聚乙烯吡咯烷酮和聚凝胺组成；及b)在透明管中离心血液-分子团混合物。
14.一种减少抗凝全血样品中由红细胞Z电位导致的排斥力强度的方法，该方法包括的步骤是，通过将一定量的分子团与血样混合，形成一种抗凝的血液-分子团混合物，该分子团由至少两种不同的高分子量颗粒组成，并具有表面正电荷。
15.一种在离心抗凝全血样品的红细胞层和粒细胞层间形成良好确定的和清晰的界面的方法，该方法包括的步骤如下a)提供一种抗凝全血和阳离子大分子试剂的混合物；及b)在透明管中离心血液一试剂混合物。
16.根据权利要求15中的方法，其中该大分子试剂是聚乙烯吡咯烷酮。
17.根据权利要求15中的方法，其中所述血样是牛血液。
18.一种减小抗凝全血样品中由红细胞Z电位导致的排斥力强度的方法，该方法包括的步骤是，通过将一定量阳离子大分子与血样混合，形成一种抗凝的血液-阳离子大分子混合物。
19.根据权利要求18中的方法，其中该大分子试剂是聚乙烯吡咯烷酮。
20.根据权利要求18中的方法，其中血样是牛血液。
21.一种含水介质中分子团溶液，该分子团由一组大分子试剂组成，该试剂包括一个核芯的大分子组分和一表面大分子组分，该表面大分子组分为分子团提供了表面正电荷。
22.根据权利要求21中的溶液，其中该含水介质是盐溶液。
23.根据权利要求21中的溶液，其中该分子团是由一组葡聚糖和聚凝胺组成。
24.根据权利要求21中的溶液，其中该分子团由一组聚乙烯吡咯烷酮和聚凝胺组成。
25.一种血液分析装置，包括一透明血液管，该管有一个接收和容纳血样的腔体，该管腔被一层干燥试剂包涂，该试剂溶于血液并包括大分子试剂，该大分子试剂能够在溶液中形成分子团，并有效地抑制管中抗凝全血的红细胞Z-电位。
全文摘要
哺乳动物抗凝全血样品与试剂的结合物混合,该试剂可减小哺乳动物红细胞彼此间具有的天然排斥力。然后,经处理的血样在含有淡黄色膜扩展插子的管中离心,在管中该插子可物理性的扩展血样的淡黄色膜组成的轴向长度。通过减小红细胞彼此间排斥的倾向,得到红细胞和淡黄色膜间的一个清晰的界限。加入血样中的凝集试剂的作用也会提高。上述方法和试剂首次使精确分析抗凝牛全血的离心样品,并得到血细胞比容,及白细胞差示计数成为可能。另外,具有流动性倾向的人血样品,也可通过加入适当降低红细胞排斥试剂及凝集试剂,进行精确分析。
文档编号G01N33/50GK1196486SQ97126498
公开日1998年10月21日 申请日期1997年11月21日 优先权日1996年11月22日
发明者S·C·沃德罗, R·A·莱文 申请人:S·C·沃德罗, R·A·莱文