一种禽流感h9n2亚型病毒毒株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种禽流感H9N2亚型病毒毒株，其保藏编号为CGMCC?No.6757。本发明的禽流感H9N2亚型病毒毒株具有良好的特异性和免疫原性，鸡胚尿囊液凝集红细胞的作用不能被抗NDV阳性血清、抗EDS76阳性血清、抗M41阳性血清、抗H5亚型禽流感病毒阳性血清以及抗H?7亚型禽流感病毒子阳性血清所抑制，而能被H9亚型禽流感病毒阳性血清抑制，免疫雏鸡能产生对H9特异的HI抗体。本发明提供的禽流感H9N2亚型病毒毒株可作为疫苗毒株，预防禽类的H9亚型禽流感，还可用于禽流感病毒的鉴定和流行病学的调查，具有良好的市场应用前景。
【专利说明】一种禽流感H9N2亚型病毒毒株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物病毒领域，具体地，涉及一种禽流感H9N2亚型病毒毒株及其应用。
【背景技术】
[0002]禽流感(Avianinfluenza, Al)是由 A 型禽流感病毒(Avian influenzavirus,AIV)引起的严重危害养禽业的高度传染性疾病。禽流感病毒属于正粘病毒科，流感病毒属。血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是病毒的两种主要保护性抗原，根据HA、NA的抗原性差异，可将A型流感病毒分为不同的亚型。迄今为止，A型禽流感病毒的HA已发现16种，NA有10种，分别以Hl~H16、NI~NlO命名，不同H抗原或N抗原之间无交叉反应。各亚型间血凝素氨基酸序列同源性70%以下，相同亚型氨基酸序列同源性为809^90%。流感病毒为多形性的囊膜病毒，常呈球形，直径为8(Tl20nm，一些毒株也呈丝状或杆状。
[0003]该病于1878年首次发生于意大利，以后国内外不少学者都相继报道了该病的发生及其给养鸡业造成的巨大经济损失。H9N2亚型禽流感是目前世界上分布最广泛的禽流感病毒亚型。H9N2亚型禽流感病毒最早于1966年从北美的火鸡体内分离得到，该亚型的流感病毒最初只感染火鸡，几乎不感染鸡。但从20世纪90年代以来，H9N2亚型禽流感病毒就在亚洲很多养鸡场传播开来。该病目前已流行于世界上许多国家和地区，给养禽业造成了巨大的经济损失。在我国，高致病性禽流感以H5N1亚型为代表，低致病性禽流感以H9N2亚型为主型。
[0004]AIV血清亚型较多，不同亚型AIV甚至不同毒株对不同宿主的易感性不同，而易感性变化又会因为病毒变异而发生改变。流感病毒变异迅速，其变异的分子机制有:点突变、基因重组、缺陷性干扰粒子`、RNA组合，每一种机制都可导致AIV的进化。HA基因变异率高，是病毒发生抗原变异的主要原因。HA上潜在的糖基化位点是影响AIV毒力的可能因素之一。近年来的研究表明，HA突变导致邻近血凝素(HA)链的裂解位点上的碱性氨基酸成为优势氨基酸，后者与毒力的增强有关，从而不可避免的演变成为高致病性的毒株。HA受体结合位点的氨基酸可以影响受体结合特性，从而改变对病毒与细胞的亲和力及宿主范围。这可能就是H9N2亚型禽流感病毒毒力变异和感染谱不断扩大的真正原因。NA蛋白主要和病毒的成熟和释放有密切关系，可能会影响到病毒的复制、传播等。禽H9N2病毒的受体特异性和HB位点的变化与人流感病毒的相似性表明，一些禽类能够作为中间宿主将水禽流感病毒传播给人。Li等通过系统进化分析了中国近10年来从家禽分离出的20株H9N2的HA基因变异情况，发现有18株分离株能对其中的5株分离株所产生的抗血清产生较好的交叉反应。
[0005]由于禽流感病毒变异非常快，给禽流感防控带来困难，治疗性药物的研发周期较长，一定程度上影响了临床防控效果。接种疫苗是防控禽流感的主要手段，但由于禽流感病毒变异快，流行毒株多，血清学多且无交叉免疫，其作用大大受到限制。解决这一难题，有赖于对本地区流行的毒株的流行特点，变异特点进行研究以及筛选分离出合适的优势疫苗毒株，以使禽流感的防控更具有针对性和有效性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种禽流感H9N2亚型病毒毒株。
[0007]本发明的另一目的在于提供该禽流感H9N2亚型病毒毒株的应用。
[0008]本发明提供的一株禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株，是在安徽某鸡场严重呼吸困难、急性死亡的鸡只的肝脏、肺脏、气管及气管干酪样物质中中分离得到的。将分离的毒株灭活后，送哈尔滨兽医研究所，做HI和NI试验，确定病毒的亚型。结果表明分离到的毒株为H9亚型禽流感，定名为A/Chicken/Anhui/HF/2010 (H9N2亚型)株(简称HF株)。该毒株已于2012年11月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为禽流感病毒H9N2亚型，保藏号为CGMCC N0.6757。
[0009]在初次分离时，尿囊液血凝滴度为1: 128，凝集不被ND、AIV H5亚型和EDS76抗血清抑制，鸡胚出现规律性的出血(以脑部和爪子比较明显)；死亡时间多集中在84h~120h之间。
[0010]尽管从致鸡胚症状看，该毒株对禽类有一定的致病力。但根据分离病毒对鸡胚的致死时间、对雏鸡的致病力和鸡脑内致病指数(ICPI)的测定结果，依据国际通用标准和国际兽医局(OIE)推荐的鉴定标准，判`定分离的病毒株为低致病力禽流感病毒株。
[0011]对HF株的全基因测序发现，其HA基因编码的氨基酸与经典代表毒株的部分位点氨基酸不一致，HF株的HA基因编码的氨基酸部分位点发生了突变。HF株在HA蛋白氨基酸的第63位，N突变为G ; 180-181位，RG/EG突变为QE ;210位，T突变为K ;216位，D突变为E ；234位，L/Q突变为M ;237位，R突变为K ;283位，S突变为R ;304位，H突变为Q ;318_320位，VGV突变为IGI ；335位，A突变为R ；370位，V/T突变为A ；475位，C突变为W ；484位，D突变为N ；491位，R突变为W。
[0012]本发明禽流感H9N2亚型病毒HF株的HA蛋白含有如SEQ IDN0.1所述的氨基酸序列。
[0013]对HF株的全基因测序还发现，其NA基因编码的氨基酸与经典代表毒株的部分位点氨基酸不一致，HF株的NA基因编码的氨基酸部分位点发生了突变。HF株在NA蛋白的氨基酸的第17位，A/T突变为I ;30位，A突变为T ；225位，G突变为S ;260_261位，VH/AH突变为IN ;第327位，N/Y突变为D ;第356位，N突变为D ；365位，Κ/E突变为S，378位，D/G突变为N ;第397-400位，SDNW/SDIR/SDNS/NNNW突变为SDSW。具体地，本发明禽流感H9N2亚型病毒NA蛋白含有如SEQ ID N0.2所述的氨基酸序列。
[0014]本发明提供了含有病毒毒株HF株的诊断用抗原试剂。
[0015]本发明提供了含有病毒毒株HF株的诊断试剂盒。
[0016]本发明提供了含有病毒毒株HF株的疫苗。
[0017]本发明提供了病毒毒株HF株在制备疫苗中的应用。
[0018]本发明提供了病毒毒株HF株在制备禽流感诊断用抗原试剂中的应用。
[0019]本发明提供了病毒毒株HF株在制备禽流感诊断用阳性血清试剂中的应用。
[0020]本发明提供了病毒毒株HF株在制备禽流感治疗用抗血清试剂中的应用。[0021]本发明的禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株具有良好的特异性和免疫原性，鸡胚尿囊液凝集红细胞的作用不能被抗NDV阳性血清、抗EDS76阳性血清、抗H5亚型禽流感病毒阳性血清以及抗H7亚型禽流感病毒阳性血清所抑制，而能被H9亚型禽流感病毒阳性血清抑制。免疫雏鸡能产生对H9特异的HI抗体。用H9亚型特异抗血清中和后接种鸡胚，鸡胚均不死亡，而未中和的对照接种胚都死亡，这进一步说明了本发明毒株的特异性。本发明作为制造效果良好的疫苗毒株，预防禽类的H9亚型禽流感，用于病毒的鉴定和流行病学的调查。
【具体实施方式】
[0022]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0023]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。禽流感H5、H7和H9亚型抗血清购自哈尔滨维科生物技术有限公司；新城疫(ND)、减蛋综合征(EDS76)、传染性支气管炎病毒M41抗血清购自中国兽医药品监察所。
[0024]实施例1禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株的分离和鉴定
[0025]1、流行病学调查
[0026]安徽某鸡场发以严重呼吸困难、急性死亡为特征的病例，7800只自20日龄草鸡在6天内陆续死亡300多只。剖检后发现几乎所有死亡鸡，支气管粘膜严重出血、支气管堵塞，充满淡黄色干酪样物质，肾脏肿大、有暗红色充血性坏死灶。
[0027]2、病毒分离
[0028]无菌采集病、死鸡支气管干酪样物质及其肝脏、脾脏、肺脏等组织，剪碎研磨后按I:5比例加入生理盐水制成悬液，置-20°C下反复冻融3次，3000r/min离心15min,取上清液用0.22 y m除菌滤器过滤，将处理好的无菌组织样品经绒毛尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，共接种10枚，0.2mL/枚，置37°C孵育，每8h照一次胚，弃去24h内非特异性死亡胚，收集24~48h死亡胚及48h未死亡胚的胚液(绒毛尿囊液、羊水)及绒毛尿囊膜，放置-20°C冻结保存备用。
[0029]按照上述方法，从病鸡的病料中分离到有血凝性的病毒，HA试验证明HF株能够凝集鸡红细胞，HI试验证明HF株的血凝性不能被新城疫病毒(NDV)抗血清、抗AIV H5亚型血清和抗AIV H7亚型血清所抑制，能被AIV H9亚型阳性血清抑制。结果见表1。
[0030]表1病料初次分离结果
[0031]
【权利要求】
1.一株禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株，其保藏编号为CGMCCN0.6757。
2.如权利要求1所述的病毒毒株HF株，其特征在于，其HA蛋白含有如SEQID N0.1所述的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的病毒毒株HF株，其特征在于，其NA蛋白含有如SEQID N0.2所述的氨基酸序列。
4.含有权利要求1-3任一所述病毒毒株HF株的诊断用抗原试剂。
5.含有权利要求1-3任一所述病毒毒株HF株的诊断试剂盒。
6.含有权利要求3任一所述病毒毒株HF株的疫苗。
7.权利要求1~3任一所述的病毒毒株HF株在制备疫苗中的应用。
8.权利要求1-3任一所述的病毒毒株HF株在制备禽流感诊断用抗原试剂中的应用。
9.权利要求f3任一所述的病毒毒株HF株在制备禽流感诊断用阳性血清试剂中的应用。
10.权利要求f3任一所述的病毒毒株HF株在制备禽流感治疗用抗血清试剂中的应用。
【文档编号】C07K16/06GK103789273SQ201210488720
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月26日 优先权日:2012年11月26日
【发明者】张坦, 郑杰, 张红, 孙丰廷, 杨国良, 王亚丽, 张凌云, 张发明, 张洪 申请人:北京华都诗华生物制品有限公司