c、 待所述反应液渗滤完全后取25uL清洗液冲洗检测孔5; d、 待清洗液渗滤彻底后将反应分析垫1置于糖化血红蛋白分析仪上进行检测。
[0047]当全血样本加入亲和反应液中，红细胞被裂解释放血红蛋白，HbAlc的顺式二醇基 特异性结合蓝色苯硼酸染料偶联成蓝色结合物，血红蛋白全部被反应液中试剂沉淀。将适 量的上述完成反应的亲和反应液，置于反应分析垫检测孔过滤吸附，然后使用清洗液除去 多余的蓝色染料，最后使用糖化血红蛋白检测仪对蓝色(糖化血红蛋白）和红色（总血红蛋 白）的颜色进行色谱分析，计算二者的比率，即为样本中HbAlc的含量。其中，所述亲和反应 液中蓝色苯硼酸燃料反应原理如附图4所示。
[0048]本发明提供的一种检测糖化血红蛋白一体化试剂盒及其检测方法，只需要微量的 全血样本，即可在3~5分钟内实现定量检测糖化血红蛋白的含量，大大提高了筛查的速度， 具有灵敏度高、特异性好和结构简单的优点，且其制备方法简单，易于大规模生产。
[0049] 标准工作曲线的绘制： 取HbAlc为20.0%的人工制备的牛抗凝全血标本、HbAlc为0.0%的牛抗凝全血标本配成 HbAlc为 18 · 0%、15 · 0%、12 · 0%、9 · 0%、6 · 0%、3 · 0%、0 · 0%的全血标本，再分别测定其HbAlc，以配 成值为X，颜色光信号测定值为Y用以绘制标准工作曲线，经统计拟合标准工作曲线的表达 式列出曲线方程为：Y=〇 · 567+0 · 108X-0 · 001Χ2+2 · 90 X 10-6X3，R2=0 · 999，P〈0 · 05。线性检测 标准工作曲线如附图2所示，糖化血红蛋白测定范围为3.0%~18.0%。
[0050] 为了进一步体现实施例1在P0CT应用方面的性能优势，对以下指标进行测试： (1)重复性试验： 批内重复性试验:取同一患者抗凝全血标本，同时连续重复检测10次，计算出变异系数 值； 批间重复性试验:将同一患者抗凝全血标本分装成10份，贮存于冰箱，每天取1份检测， 共10天，计算出变异系数值。
[0051] 经计算得到，批内变异系数值为3.22%，批间（日间)变异系数值为4.38%，按照美国 临床试验室标准化委员会(NCCLS)文件要求的批内、批间不精密度水平应小于5%，本发明 提供的一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒符合要求。
[0052] 由上述检测可见，本发明检测方法具有更高的灵敏度，且在实现批内、批间精确定 量检测的同时具有很好的重复性。
[0053] (2)抗干扰试验： 1、将一新鲜抗凝全血标本，分成3份，每份1000yL，第1份加入葡萄糖为140mmol/L的100 μL高糖物质，第2份加入总胆红素为430.3μπι〇?Α的血清100μΙ，第3份加入甘油三酯为 39.8mmol/L的血清100μ1，混匀后分别测定HbAlc值。
[0054] 2、采集一患者全血标本，分别注入含EDTA-K2、肝素、枸橼酸钠的3种抗凝剂管中混 匀，然后分别测定HbAlc值，其测定结果见下表1所示： 表1:不同的抗凝剂对测定HbAlc值的影响
上表结果表明，在葡萄糖为140mmol/L以下高糖标本、总胆红素为430.3μπι〇1/1以下的 黄疸标本及甘油三酯为39.8mm〇l/L以下的脂血对本方法测定HbAlc无明显干扰。不同的抗 凝剂对本发明方法测定HbAl c也无明显干扰。
[0055] (3)实际检测对比试验 为了验证实施例1的性能，对实施例1的试纸条进行性能方面的测定，取417例患者的空 腹新鲜全血肝素抗凝标本，每份分别用美国Bio-Rad-HbAlc液相色谱分析仪与本发明YKY-HbAlc-体化试剂进行双盲法检测。将结果应用相关回归和配对t检验分析方法进行比较。 结果显示，两方法相关性良好，差异无统计学意义（回归方程为YBi。-Rad=0.180+1.006XYKY，R 2= 0.988，P〈0.01，n=417)，回归曲线图如附图3所示。
[0056] 本发明提供的实用上述试剂盒检测糖化血红蛋白的检测方法，只需要微量的全血 样本，即可在3~5分钟内实现定量检测糖化血红蛋白的含量，灵敏度高，特异性好。
[0057] 以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。亲和反应液、清 洗液其物质的量浓度、pH值及组分可以相同，可以不同，其均在本发明的保护范围之内，对 于具体实施例中所列举出来的不同组分只是本发明人所做试验中的其中一些优选实施例。 任何在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。
【主权项】
1. 一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒，其特征在于，包括:反应分析垫、位于反应 分析垫右侧的装有亲和反应液的亲和反应液微孔、位于亲和反应液微孔右侧的装有清洗液 的清洗液微孔和位于所述清洗液微孔右侧的条码区。2. 根据权利要求1所述的一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒，其特征在于，所述亲 和反应液微孔的孔径为5mm~6mm，高度8mm~10mm，内装有250yL亲和反应液。3. 根据权利要求2所述的一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒，其特征在于，所述亲 和反应液包括如下组分： 甘氛酸 20~150mmol/L， 氯化锌 2~50mmol/L， 氯化镁 5~50mmol/L， 氯化钾 50~500mmol/L， 叠氮化钠 0.1~1.5g/L， 蓝色苯硼酸染料 0.05~0.50 mmol/L， 甲醇 体积浓度为1.5~5.0%， 乙基苯基聚乙二醇质量体积浓度为0.05~0.1%。4. 根据权利要求3所述的一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒，其特征在于，所述亲 和反应液的PH值为8.5~10.5。5. 根据权利要求1所述的一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒，其特征在于，所述清 洗液微孔的孔径为5mm~6mm，高度为，内装有60~80yL的清洗液。6. 根据权利要求5所述的一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒，其特征在于，所述清 洗液包括如下组分： 三羟甲基氨基甲烷 20~200mmol/L， 叠氮化钠 0.1~1.5g/L， 聚乙二醇辛基苯基醚体积浓度为0.05~0.5%。7. 根据权利要求6所述的一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒，其特征在于，所述清 洗液的PH值为7.6~8.6。8. 根据权利要求1所述的一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒，其特征在于，所述亲 和反应液微孔和/或清洗液微孔由铝箱或透明塑料膜密封。9. 根据权利要求1所述的一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒，其特征在于，所述反 应分析垫为12mm* 12cm的正方形状，包括上盖和下盖，所述上盖中央设有一检测孔，孔径为1 ~2mm，所述上盖和下盖之间放置三层10mm*l 0mm的分析滤纸。10. -种使用权力要求1-9任一所述的试剂盒检测糖化血红蛋白的检测方法，其特征在 于，包括以下步骤： a、 取5tiL全血样本加入到装有25〇tiL亲和反应液的亲和反应液微孔中，混匀2-3秒，静置 2-3分钟后，再次混匀反应液； b、 取25nL上述混匀后的反应液置于反应分析垫上的检测卡孔中； c、 待上述反应液在检测卡孔中渗滤完全后取25uL清洗液冲洗检测孔； d、 待上述清洗液渗滤完全后将其反应分析垫置于糖化血红蛋白分析仪上进行检测。
【专利摘要】本发明提供一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括反应分析垫、位于所述反应分析垫右侧的装有亲和反应液的亲和反应液微孔、位于所述亲和反应液微孔右侧的装有清洗液的清洗液微孔和位于所述清洗液微孔右侧的条码区。本发明提供的一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒，检测时只需要微量的全血样本，即可在3-5分钟内实现定量检测糖化血红蛋白的含量，大大提高了筛查的速度，具有灵敏度高、特异性好和结构简单的优点，且制备方法简单，易于大规模生产。其检测方法，只需要微量的全血样本，即可在3-5分钟内实现定量检测糖化血红蛋白的含量，灵敏度高、特异性好。
【IPC分类】G01N1/28, G01N30/00
【公开号】CN105606418
【申请号】CN201511015703
【发明人】黄亚丽, 魏芳, 赵柯, 丁文宇
【申请人】李新华
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年12月30日